抗生素药物的安全性

抗 生 素 药 物 的 安 全 性 抗 生 素 (Antibiotics)类 药 物 是 临 床 上 常 用 的 一 类 重 要 药 物 ， 临 床 使 用 的 抗 生 素 主 要 由 生 物 合 成 ， 经 过 发 酵 和 提 纯 两 步 制 得 ； 也 有 少 数 是 利 用 化 学 合 成 或 半 合 成 方 法 制 得 。 ChP2010 共 收 载 抗 生 素 类 原 料 药 及 其 各 种 制 剂 近 300 个 品 种 。 第 一 节 概 述 一 、 抗 生 素 类 药 物 的 定 义 和 特 点 青 霉 素 于 1929 年 被 弗 莱 明 发 现 ， 至 1943 年 链 霉 素 的 发 现 者 赛 尔 曼 瓦 克 斯 曼 才 给 出 了 抗 生 素 的 定 义 ， 即 微 生 物 代 谢 产 生 的 能 抑 制 它 种 微 生 物 生 长 活 动 甚 至 杀 灭 它 种 微 生 物 的 化 学 物 质 。 抗 生 素 的 来 源 不 仅 限 于 细 菌 、 放 线 菌 和 霉 菌 等 微 生 物 ， 植 物 和 动 物 也 能 产 生 抗 生 素 。 抗 生 素 的 应 用 也 远 远 超 出 了 抗 菌 范 围 。 一 般 认 为 ， 比 较 确 切 的 抗 生 素 的 定 义 应 为 ： 抗 生 素 是 生 物 (包 括 微 生 物 、 植 物 、 动 物 )在 其 生 命 活 动 中 产 生 的 (或 并 用 化 学 、 生 物 或 生 化 方 法 衍 生 的 )， 能 在 低 微 浓 度 下 有 选 择 地 抑 制 或 影 响 它 种 生 物 机 能 的 化 学 物 质 的 总 称 。 抗 生 素 主 要 由 微 生 物 发 酵 、 经 化 学 纯 化 、 精 制 和 化 学 修 饰 等 过 程 ， 最 后 制 成 适 当 制 剂 。 与 化 学 合 成 药 物 相 比 ， 其 结 构 、 组 成 更 复 杂 ， 表 现 为 ： 1 化 学 纯 度 较 低 有 三 多 ： 即 同 系 物 多 ， 如 庆 大 霉 素 、 新 霉 素 等 含 有 多 个 组 分 ； 异 构 体 多 ， 半 合 成 -内 酰 胺 抗 生 素 、 氨 基 糖 苷 类 抗 生 素 具 有 旋 光 性 ， 均 存 在 光 学 异 构 体 ， 如 药 用 巴 龙 霉 素 为 两 个 立 体 异 构 体 巴 龙 霉 素 和 巴 龙 霉 素 的 混 合 物 ； 降 解 物 多 ， 如 四 环 素 类 存 在 脱 水 、 2 差 向 异 构 体 。 2 活 性 组 分 易 发 生 变 异 微 生 物 菌 株 的 变 化 、 发 酵 条 件 改 变 等 均 可 导 致 产 品 质 量 发 生 变 化 ， 如 组 分 的 组 成 或 比 例 的 改 变 。 3 稳 定 性 差 抗 生 素 分 子 结 构 中 通 常 含 有 活 泼 基 团 ， 而 这 些 基 团 往 往 是 抗 生 素 的 活 性 中 心 ， 如 青 霉 素 、 头 孢 菌 素 类 结 构 中 的 -内 酰 胺 环 ， 链 霉 素 结 构 中 的 醛 基 等 均 具 有 稳 定 性 差 的 特 点 。 二 、 抗 生 素 类 药 物 的 分 类 抗 生 素 的 种 类 繁 多 ， 性 质 复 杂 ， 用 途 又 各 异 ， 对 其 系 统 分 类 有 一 定 困 难 。 根 据 不 同 的 研 究 目 ， 抗 生 素 一 般 有 以 下 几 种 分 类 法 ： 1 根 据 产 生 抗 生 素 的 生 物 来 源 分 类 细 菌 产 生 的 抗 生 素 、 真 菌 产 生 的 抗 生 素 、 放 线 菌 产 生 的 抗 生 素 、 高 等 植 物 产 生 的 抗 生 素 、 动 物 产 生 的 抗 生 素 。 2 根 据 抗 生 素 的 作 用 对 象 分 类 抗 革 兰 阳 性 菌 的 抗 生 素 、 抗 革 兰 阴 性 菌 的 抗 生 素 、 广 谱 抗 生 素 、 抗 真 菌 的 抗 生 素 、 抗 肿 瘤 的 抗 生 素 、 抗 病 毒 及 抗 原 虫 系 昆 虫 的 抗 生 素 、 抗 结 核 分 枝 杆 菌 的 抗 生 素 。 3 根 据 抗 生 素 的 作 用 机 制 分 类 抑 制 细 胞 壁 合 成 的 抗 生 素 、 影 响 细 胞 膜 功 能 的 抗 生 素 、 抑 制 和 干 扰 细 胞 蛋 白 质 合 成 的 抗 生 素 、 抑 制 细 胞 核 酸 合 成 的 抗 生 素 、 抑 制 细 菌 生 物 能 作 用 的 抗 生 素 。 4 根 据 抗 生 素 的 化 学 结 构 分 类 其 中 以 作 用 对 象 、 化 学 结 构 不 同 进 行 分 类 是 较 常 用 的 ， 前 者 对 于 临 床 选 用 抗 生 素 带 来 一 定 方 便 ， 后 者 有 利 于 抗 生 素 工 业 生 产 和 质 量 分 析 研 究 。 按 照 化 学 结 构 分 类 共 分 为 以 下 九 大 类 。 3 (1) -内 酰 胺 类 抗 生 素 ： 这 类 抗 生 素 的 化 学 结 构 中 都 含 有 一 个 四 元 的 内 酰 胺 环 ， 属 于 这 类 抗 生 素 的 有 青 霉 素 、 头 孢 菌 素 以 及 它 们 的 衍 生 物 。 临 床 常 用 的 青 霉 素 类 药 物 有 ： 青 霉 素 钾 、 青 霉 素 钠 、 青 霉 素 V 钠 、 阿 莫 西 林 、 阿 莫 西 林 钠 、 哌 拉 西 林 、 哌 拉 西 林 钠 、 美 罗 培 南 、 阿 洛 西 林 钠 、 氨 苄 西 林 、 氨 苄 西 林 钠 、 普 鲁 卡 因 青 霉 素 、 磺 卞 西 林 钠 、 托 西 酸 舒 他 西 林 、 氯 唑 西 林 钠 等 。 临 床 常 用 的 头 孢 类 药 物 有 ： 头 孢 丙 烯 、 头 孢 尼 钠 、 头 孢 他 啶 、 头 孢 地 尼 、 头 孢 地 嗪 钠 、 头 孢 西 丁 钠 、 头 孢 曲 松 钠 、 头 孢 克 肟 、 头 孢 克 洛 、 头 孢 呋 辛 钠 、 头 孢 呋 辛 酯 、 头 孢 孟 多 酯 钠 、 头 孢 拉 定 (先 锋 霉 素 )、 头 孢 泊 肟 酯 、 头 孢 哌 酮 、 头 孢 哌 酮 钠 、 头 孢 唑 肟 钠 、 头 孢 唑 林 钠 (先 锋 霉 素 )、 羟 氨 苄 头 孢 氨 苄 (先 锋 霉 素 )、 头 孢 羟 氨 苄 、 头 孢 替 唑 钠 、 头 孢 硫 脒 、 头 孢 噻 吩 钠 、 头 孢 噻 肟 钠 、 头 孢 拉 氧 头 孢 钠 、 盐 酸 头 孢 他 美 酯 、 盐 酸 头 孢 吡 肟 等 。 (2) 四 环 类 抗 生 素 ： 这 类 抗 生 素 的 化 学 结 构 中 都 含 有 一 个 四 并 苯 的 母 核 ， 属 于 这 类 抗 生 素 的 有 盐 酸 四 环 素 、 盐 酸 土 霉 素 、 盐 酸 多 烯 环 素 、 盐 酸 米 诺 环 素 、 盐 酸 金 霉 素 、 盐 酸 美 他 环 素 等 。 (3)氨 基 糖 苷 类 抗 生 素 ： 这 类 抗 生 素 的 化 学 结 构 中 都 有 氨 基 糖 苷 和 氨 基 环 醇 ， 属 于 这 类 抗 生 素 的 药 物 数 目 很 多 ， 常 用 的 有 ： 硫 酸 链 霉 素 、 硫 酸 庆 大 霉 素 、 妥 布 霉 素 、 阿 米 卡 星 、 盐 酸 大 观 霉 素 、 硫 酸 小 诺 米 星 、 硫 酸 巴 龙 霉 素 、 硫 酸 卡 那 霉 素 、 硫 酸 西 索 米 星 、 硫 酸 阿 米 卡 星 、 硫 酸 依 替 米 星 、 硫 酸 核 糖 霉 素 、 硫 酸 新 霉 素 等 。 (4)大 环 内 酯 类 抗 生 素 ： 这 类 抗 生 素 的 化 学 结 构 中 都 有 一 个 大 环 内 酯 作 为 配 糖 体 ， 红 霉 素 为 本 类 抗 生 素 的 代 表 。 本 类 抗 生 素 临 床 效 果 显 著 ， 如 琥 乙 红 霉 素 、 乙 酰 螺 旋 霉 素 、 吉 他 霉 素 、 交 沙 霉 素 、 麦 白 霉 素 、 4 克 拉 霉 素 、 阿 奇 霉 素 、 罗 红 霉 素 、 依 托 红 霉 素 、 乳 糖 酸 红 霉 素 、 硬 脂 酸 红 霉 素 等 。 (5)多 烯 大 环 类 抗 生 素 ： 这 类 抗 生 素 的 化 学 结 构 中 不 仅 有 大 环 内 酯 ， 而 且 在 内 酯 结 构 中 还 存 有 共 轭 双 键 ， 属 于 这 类 抗 生 素 的 有 制 霉 菌 素 、 两 性 霉 素 B、 曲 古 霉 素 、 戊 霉 素 、 菲 里 平 (菲 律 宾 菌 素 )、 球 红 霉 素 等 。 (6)多 肽 类 抗 生 素 ： 这 类 抗 生 素 是 由 多 种 氨 基 酸 ， 经 肽 键 缩 合 成 线 状 、 环 状 或 带 侧 链 的 环 状 多 肽 类 化 合 物 ， 属 于 这 类 抗 生 素 的 有 盐 酸 万 古 霉 素 、 盐 酸 去 甲 万 古 霉 素 、 硫 酸 多 黏 菌 素 B 等 。 (7)酰 胺 醇 类 抗 生 素 ： 于 这 类 抗 生 素 的 有 氯 霉 素 、 甲 砜 霉 素 、 琥 珀 氯 霉 素 、 棕 榈 氯 霉 素 等 。 (8) 抗 肿 瘤 类 抗 生 素 ： 属 于 这 类 抗 生 素 的 有 丝 裂 霉 素 、 盐 酸 平 阳 霉 素 、 盐 酸 多 柔 比 星 、 盐 酸 表 柔 比 星 、 盐 酸 柔 红 霉 素 等 。 (9)其 他 抗 生 素 ： 凡 不 属 于 上 述 八 类 的 抗 生 素 一 般 均 归 于 其 他 抗 生 素 。 如 丙 酸 交 沙 霉 素 、 美 洛 西 林 钠 、 盐 酸 克 林 霉 素 、 盐 酸 林 可 霉 素 、 替 考 拉 宁 、 磷 霉 素 钙 、 磷 霉 素 钠 、 磷 霉 素 氨 丁 三 醇 等 。 由 于 抗 生 素 的 结 构 和 性 质 各 异 ， 上 列 的 分 类 远 远 不 能 包 括 所 有 的 抗 生 素 ， 且 某 一 种 抗 生 素 可 以 同 时 划 分 为 几 个 类 型 ， 所 以 此 种 分 类 法 仅 是 将 常 用 的 重 要 的 抗 生 素 列 入 几 大 类 。 本 章 主 要 讨 论 -内 酰 胺 类 、 氨 基 糖 苷 类 、 四 环 素 类 抗 生 素 的 物 理 化 学 性 质 、 鉴 别 反 应 、 杂 质 检 查 、 含 量 测 定 方 法 与 原 理 。 5 三 、 抗 生 素 类 药 物 的 细 菌 耐 药 性 在 长 期 的 抗 生 素 选 择 之 后 出 现 的 对 相 应 抗 生 素 产 生 耐 受 能 力 的 微 生 物 ， 统 称 耐 药 菌 。 所 谓 细 菌 耐 药 性 (bacterial resistance)又 称 抗 药 性 ， 是 指 细 菌 产 生 的 对 抗 菌 药 不 敏 感 的 现 象 ， 是 细 菌 自 身 生 存 过 程 的 一 种 特 殊 表 现 形 式 。 天 然 抗 生 素 是 细 菌 产 生 的 次 级 代 谢 产 物 ， 用 于 抵 御 其 他 微 生 物 、 保 护 自 身 安 全 的 化 学 物 质 。 人 类 将 细 菌 产 生 的 这 种 物 质 制 成 抗 菌 药 物 ， 用 于 杀 灭 感 染 的 微 生 物 。 微 生 物 接 触 到 抗 菌 药 ， 也 会 通 过 改 变 代 谢 途 径 或 制 造 出 相 应 的 灭 活 物 质 ， 使 其 避 免 被 抗 菌 药 物 抑 制 或 杀 灭 ， 形 成 耐 药 性 。 耐 药 菌 的 出 现 增 加 了 感 染 性 疾 病 治 愈 的 难 度 ， 并 迫 使 人 类 寻 找 新 的 对 抗 微 生 物 感 染 的 方 法 。 1 耐 药 性 的 种 类 耐 药 性 可 分 为 固 有 耐 药 性 (intrinsic resistance)和 获 得 性 耐 药 性 (acquired resistance)。 固 有 耐 药 性 又 称 天 然 耐 药 性 ， 是 由 细 菌 染 色 体 基 因 决 定 代 代 相 传 ， 不 会 改 变 的 ， 如 链 球 菌 对 氨 基 糖 苷 类 抗 生 素 天 然 耐 药 ； 肠 道 革 兰 阴 性 杆 菌 对 青 霉 素 G 天 然 耐 药 ； 铜 绿 假 单 胞 菌 对 多 数 抗 生 素 均 不 敏 感 。 获 得 性 耐 药 性 是 由 于 细 菌 与 抗 生 素 接 触 后 ， 由 质 粒 介 导 ， 通 过 改 变 自 身 的 代 谢 途 径 ， 使 其 不 被 抗 生 素 杀 灭 。 如 金 黄 色 葡 萄 球 菌 产 生 -内 酰 胺 酶 类 抗 生 素 耐 药 。 细 菌 的 获 得 性 耐 药 可 因 不 再 接 触 抗 生 素 而 消 失 ， 也 可 由 质 粒 将 耐 药 基 因 转 移 给 染 色 体 而 代 代 相 传 ， 成 为 固 有 耐 药 。 2 耐 药 的 机 制 (1)产 生 灭 活 酶 ， 使 抗 菌 药 失 活 ： 细 菌 产 生 灭 活 的 抗 菌 药 物 酶 使 抗 菌 药 物 失 活 是 耐 药 性 产 生 的 最 重 要 机 制 之 一 ， 使 抗 菌 药 物 作 用 于 细 菌 之 前 即 被 酶 破 坏 而 失 去 抗 菌 作 用 。 这 些 灭 活 酶 可 由 质 粒 和 染 色 体 基 因 表 达 。 6 -内 酰 胺 酶 ： -内 酰 胺 酶 由 染 色 体 或 质 粒 介 导 。 对 -内 酰 胺 类 抗 生 素 耐 药 的 主 要 原 因 是 细 菌 产 生 的 -内 酰 胺 酶 使 -内 酰 胺 环 裂 解 ， 从 而 使 该 抗 生 素 丧 失 抗 菌 作 用 。 氨 基 糖 苷 类 抗 生 素 钝 化 酶 ： 细 菌 在 接 触 到 氨 基 糖 苷 类 抗 生 素 后 产 生 钝 化 酶 使 后 者 失 去 抗 菌 作 用 ， 常 见 的 氨 基 糖 苷 类 钝 化 酶 有 乙 酰 化 酶 、 腺 苷 化 酶 和 磷 酸 化 酶 ， 这 些 酶 的 基 因 经 质 粒 介 导 合 成 ， 可 以 将 乙 酰 基 、 腺 苷 酰 基 和 磷 酰 基 连 接 到 氨 基 糖 苷 类 的 氨 基 或 羟 基 上 ， 使 氨 基 糖 苷 类 抗 生 素 的 结 构 改 变 从 而 失 去 抗 菌 活 性 。 其 他 酶 类 ： 细 菌 可 产 生 氯 霉 素 乙 酰 转 移 酶 灭 活 氯 霉 素 、 产 生 酯 酶 灭 活 大 环 内 酯 类 抗 生 素 ； 金 黄 色 葡 萄 球 菌 产 生 核 苷 转 移 酶 灭 活 林 可 霉 素 。 (2)抗 菌 药 物 作 用 靶 位 改 变 ： 由 于 改 变 了 细 胞 内 膜 上 与 抗 生 素 结 合 部 位 的 靶 蛋 白 ， 降 低 与 抗 生 素 的 亲 和 力 ， 使 抗 生 素 不 能 与 其 结 合 ， 导 致 抗 菌 的 失 败 。 细 菌 与 抗 生 素 接 触 之 后 产 生 一 种 新 的 靶 蛋 白 ， 使 抗 生 素 不 能 与 新 的 靶 蛋 白 结 合 ， 从 而 高 度 耐 药 。 靶 蛋 白 数 量 会 不 断 增 加 ， 即 使 药 物 存 在 时 该 细 菌 仍 有 足 够 量 的 靶 蛋 白 维 持 其 正 常 功 能 和 形 态 ， 导 致 细 菌 继 续 生 长 、 繁 殖 ， 从 而 对 抗 菌 药 物 产 生 耐 药 。 (3)降 低 细 菌 外 膜 通 透 性 ： 很 多 广 谱 抗 菌 药 都 对 铜 绿 假 单 胞 菌 无 效 或 作 用 很 弱 ， 主 要 是 因 为 抗 菌 药 物 不 能 进 入 铜 绿 假 单 胞 菌 菌 体 内 ， 故 产 生 天 然 耐 药 。 细 菌 接 触 抗 生 素 后 ， 可 以 通 过 改 变 通 道 蛋 白 的 性 质 和 数 量 来 降 低 细 菌 的 膜 通 透 性 ， 阻 止 抗 菌 药 物 进 入 细 菌 体 内 而 产 生 获 得 性 耐 药 性 。 (4)影 响 主 动 流 出 系 统 ： 某 些 细 菌 能 将 进 入 菌 体 的 药 物 泵 出 体 外 ， 7 这 种 泵 因 需 能 量 ， 故 称 主 动 流 出 系 统 (active efflux system)。 由 于 这 种 主 动 流 出 系 统 的 存 在 及 它 对 抗 菌 药 物 具 有 选 择 性 的 特 点 ， 使 大 肠 杆 菌 、 金 黄 色 葡 萄 球 菌 、 表 皮 葡 萄 球 菌 、 铜 绿 假 单 胞 菌 、 空 肠 弯 曲 杆 菌 等 对 四 环 素 类 、 氟 喹 诺 酮 类 、 大 环 内 酯 类 、 氯 霉 素 、 -内 酰 胺 类 产 生 多 重 耐 药 。 四 、 抗 生 素 药 物 的 质 量 分 析 抗 生 素 类 药 物 的 质 量 控 制 方 法 与 一 般 化 学 药 品 一 样 ， 通 过 鉴 别 、 检 查 、 含 量 (效 价 )测 定 三 个 主 要 方 面 来 判 断 其 质 量 的 优 劣 。 由 于 抗 生 素 类 药 物 的 特 点 ， 其 分 析 方 法 可 分 为 理 化 方 法 和 生 物 学 法 两 大 类 。 (一 ) 鉴 别 试 验 抗 生 素 类 药 物 的 鉴 别 试 验 主 要 为 理 化 方 法 ， 常 用 方 法 有 ： 1 官 能 团 的 显 色 反 应 如 -内 酰 胺 环 的 羟 肟 酸 铁 反 应 ； 链 霉 素 的 麦 芽 酚 反 应 、 坂 口 反 应 。 对 于 抗 生 素 盐 类 ， 通 常 鉴 别 酸 根 或 金 属 离 子 或 有 机 碱 。 2 光 谱 法 包 括 红 外 光 谱 与 紫 外 吸 收 光 谱 的 鉴 别 。 抗 生 素 的 红 外 光 谱 分 析 时 需 注 意 ， 由 于 抗 生 素 存 在 多 晶 现 象 ， 有 时 对 照 品 与 供 试 品 图 谱 或 对 照 图 谱 不 一 致 ， 最 好 用 相 同 溶 剂 同 时 重 结 晶 供 试 品 和 对 照 品 ， 使 处 于 相 同 晶 型 情 况 下 再 进 行 测 定 ， 若 多 晶 效 应 是 由 于 研 磨 和 压 片 过 程 中 的 晶 相 转 变 所 致 ， 则 应 采 用 溶 液 法 试 验 。 3 色 谱 法 包 括 TLC 和 HPLC 法 ， 采 用 对 照 品 或 标 准 品 对 照 法 。 4 生 物 学 法 是 检 查 抗 生 素 灭 活 前 后 的 抑 菌 能 力 ， 并 与 已 知 含 量 的 对 照 品 对 照 后 进 行 鉴 别 ， 此 法 已 很 少 应 用 。 8 (二 ) 检 查 抗 生 素 类 药 物 的 检 查 项 目 包 括 ： 影 响 产 品 稳 定 性 的 检 查 项 目 结 晶 性 、 酸 碱 度 、 水 分 或 干 燥 失 重 等 。 控 制 有 机 和 无 机 杂 质 的 检 查 项 目 溶 液 的 澄 清 度 与 颜 色 、 有 关 物 质 、 残 留 溶 剂 、 炽 灼 残 渣 、 重 金 属 等 。 与 临 床 安 全 性 密 切 相 关 的 检 查 项 目 异 常 毒 性 、 热 源 或 细 菌 内 毒 素 、 降 压 物 质 、 无 菌 等 。 其 他 检 查 项 目 对 于 多 组 分 抗 生 素 还 要 进 行 组 分 分 析 等 (如 硫 酸 庆 大 霉 素 的 “庆 大 霉 素 C 组 分 的 测 定 ”)。 此 外 ， 有 些 抗 生 素 还 规 定 “悬 浮 时 间 与 抽 针 试 验 ”(如 注 射 用 普 鲁 卡 因 青 霉 素 )、 “聚 合 物 ” (如 -内 酰 胺 类 抗 生 素 )、 “杂 质 吸 光 度 ”(如 四 环 素 类 抗 生 素 )等 。 (三 ) 含 量 或 效 价 测 定 微 生 物 检 定 法 本 法 系 在 适 宜 条 件 下 ， 根 据 量 反 应 平 行 线 原 理 设 计 ， 通 过 检 测 抗 生 素 对 微 生 物 的 抑 制 作 用 ， 计 算 抗 生 素 活 性 (效 价 ) 的 方 法 。 测 定 方 法 可 分 为 管 碟 法 和 浊 度 法 ： 管 碟 法 是 利 用 抗 生 素 在 琼 脂 培 养 基 内 的 扩 散 作 用 ， 比 较 标 准 品 与 供 试 品 两 者 对 接 种 的 试 验 菌 产 生 抑 菌 圈 的 大 小 ， 以 测 定 供 试 品 效 价 的 一 种 方 法 。 浊 度 法 是 利 用 抗 生 素 在 液 体 培 养 基 中 对 试 验 菌 生 长 的 抑 制 作 用 ， 通 过 测 定 培 养 后 细 菌 浊 度 值 的 大 小 ， 比 较 标 准 品 与 供 试 品 对 试 验 菌 生 长 抑 制 的 程 度 ， 以 测 定 供 试 品 效 价 的 一 种 方 法 。 微 生 物 检 定 法 的 优 点 是 灵 敏 度 高 、 需 用 量 小 ， 测 定 结 果 较 直 观 ； 测 定 原 理 与 临 床 应 用 的 要 求 一 致 ， 更 能 确 定 抗 生 素 的 医 疗 价 值 ； 而 且 适 用 范 围 广 ， 较 纯 的 精 制 品 、 纯 度 较 差 的 制 品 、 已 知 的 或 新 发 现 的 抗 生 素 均 能 应 用 ； 对 同 一 类 型 的 抗 生 素 不 需 分 离 ， 可 一 次 测 定 其 总 效 价 ， 是 抗 生 9 素 药 物 效 价 测 定 的 最 基 本 的 方 法 。 但 其 存 在 着 操 作 步 骤 多 、 测 定 时 间 长 、 误 差 大 等 缺 点 。 随 着 抗 生 素 类 药 物 的 发 展 和 分 析 方 法 的 进 步 ， 理 化 方 法 逐 渐 取 代 了 生 物 学 法 ， 但 对 于 分 子 结 构 复 杂 、 多 组 分 的 抗 生 素 ， 生 物 学 法 仍 然 是 首 选 的 效 价 测 定 方 法 。 理 化 方 法 是 根 据 抗 生 素 的 分 子 结 构 特 点 ， 利 用 其 特 有 的 化 学 或 物 理 化 学 性 质 及 反 应 而 进 行 的 。 对 于 提 纯 的 产 品 以 及 化 学 结 构 已 确 定 的 抗 生 素 ， 能 较 迅 速 、 准 确 地 测 定 其 效 价 ， 并 具 有 较 高 的 专 属 性 。 但 本 法 也 存 在 不 足 ： 如 化 学 法 通 常 是 利 用 抗 生 素 化 学 结 构 上 官 能 团 的 特 殊 化 学 反 应 ， 对 含 有 具 同 样 官 能 团 杂 质 的 供 试 品 就 不 适 用 ， 或 需 采 取 适 当 方 法 加 以 校 正 。 而 且 当 该 法 是 利 用 某 一 类 型 抗 生 素 的 共 同 结 构 部 分 的 反 应 时 ， 所 测 得 的 结 果 ， 往 往 只 能 代 表 药 物 的 总 含 量 ， 并 不 一 定 能 代 表 抗 生 素 的 生 物 效 价 。 因 此 ， 通 常 在 以 理 化 方 法 测 定 抗 生 素 含 量 时 ， 不 但 要 求 方 法 正 确 可 靠 、 具 有 专 属 性 、 操 作 简 单 、 省 时 、 试 剂 易 得 、 样 品 用 量 少 ， 而 且 要 求 测 定 结 果 必 须 与 生 物 效 价 吻 合 。 目 前 世 界 各 国 药 典 所 收 载 的 抗 生 素 的 理 化 方 法 主 要 是 HPLC 法 ， 如 -内 酰 胺 类 、 四 环 素 类 、 大 环 内 酯 类 等 抗 生 素 大 多 采 用 HPLC 法 测 定 含 量 。 抗 生 素 活 性 表 示 方 法 抗 生 素 的 活 性 以 效 价 单 位 表 示 ， 即 指 每 毫 升 或 每 毫 克 中 含 有 某 种 抗 生 素 的 有 效 成 分 的 多 少 。 效 价 是 以 抗 菌 效 能 (活 性 部 分 )作 为 衡 量 的 标 准 ， 因 此 ， 效 价 的 高 低 是 衡 量 抗 生 素 质 量 的 相 对 标 准 。 效 价 用 单 位 (U)或 微 克 (g)表 示 。 各 种 抗 生 素 的 效 价 基 准 是 人 们 为 了 生 产 科 研 方 便 而 规 定 的 ， 如 1mg 青 霉 素 钠 定 为 1670 U； 1mg 庆 大 霉 素 定 为 590 U； 1mg 硫 酸 卡 那 霉 素 定 为 670 U。 一 种 抗 生 素 有 一 个 效 价 基 准 ， 同 一 种 抗 生 素 的 各 种 盐 类 的 效 价 可 根 据 其 分 子 量 与 标 准 盐 类 进 10 行 换 算 。 例 1mg 青 霉 素 钾 的 单 位 (U)=1670356.4/372.5=1598 U/mg。 以 上 为 抗 生 素 的 理 论 效 价 ， 实 际 样 品 往 往 低 于 该 理 论 效 价 。 第 二 节 -内 酰 胺 类 抗 生 素 本 类 抗 生 素 包 括 青 霉 素 类 和 头 孢 菌 素 类 ， 它 们 的 分 子 结 构 中 均 含 有 -内 酰 胺 环 ， 因 此 统 称 为 -内 酰 胺 类 抗 生 素 。 一 、 化 学 结 构 与 性 质 1 化 学 结 构 青 霉 素 和 头 孢 菌 素 分 子 中 都 有 一 个 游 离 羧 基 和 酰 胺 侧 链 。 氢 化 噻 唑 环 或 氢 化 噻 嗪 环 与 -内 酰 胺 并 合 的 杂 环 ， 分 别 构 成 二 者 的 母 核 。 青 霉 素 类 分 子 中 的 母 核 称 为 6-氨 基 青 霉 烷 酸 ； 头 孢 菌 素 类 分 子 中 的 母 核 称 为 7-氨 基 头 孢 菌 烷 酸 。 通 常 青 霉 素 类 分 子 中 含 有 三 个 手 性 碳 原 子 (C2、 C5、 C6)， 头 孢 菌 素 类 分 子 中 含 有 两 个 手 性 碳 原 子 (C6、 C7)。 由 于 酰 胺 基 上 R 以 及 R1 的 不 同 ， 构 成 各 种 不 同 的 青 霉 素 和 头 孢 菌 素 。 2 性 质 (1) -内 酰 胺 环 的 不 稳 定 性 ： -内 酰 胺 环 是 该 类 抗 生 素 的 结 构 活 性 中 心 ， 其 性 质 活 泼 ， 是 分 子 结 构 中 最 不 稳 定 部 分 ， 其 稳 定 性 与 含 水 量 和 纯 度 有 很 大 关 系 。 干 燥 条 件 下 青 霉 素 和 头 孢 菌 素 类 药 物 均 较 稳 定 ， 室 温 条 件 下 密 封 保 存 可 贮 存 3 年 以 上 ， 但 他 们 的 水 溶 液 很 不 稳 定 ， 随 pH 和 温 度 而 有 很 大 变 化 。 青 霉 素 水 溶 液 在 pH 6 6.8 时 较 稳 定 。 本 类 药 物 在 酸 、 碱 、 青 霉 素 酶 、 羟 胺 及 某 些 金 属 离 子 (铜 、 铅 、 汞 和 银 )或 氧 化 剂 等 作 用 下 ， 易 发 生 水 解 和 分 子 重 排 ， 导 致 -内 酰 胺 环 的 破 坏 而 失 去 抗 菌 活 性 。 (2) 旋 光 性 ： 青 霉 素 类 分 子 中 含 有 三 个 手 性 碳 原 子 ， 头 孢 菌 素 类 含 11 有 两 个 手 性 碳 原 子 ， 故 都 具 有 旋 光 性 。 根 据 此 性 质 ， 可 用 于 定 性 和 定 量 分 析 。 (3) 酸 性 与 溶 解 度 ： 青 霉 素 类 和 头 孢 菌 素 类 分 子 中 的 游 离 羧 基 具 有 相 当 强 的 酸 性 ， 大 多 数 青 霉 素 类 化 合 物 的 pKa 在 2.5 2.8 之 间 ， 能 与 无 机 碱 或 某 些 有 机 碱 形 成 盐 。 其 碱 金 属 盐 易 溶 于 水 ， 而 有 机 碱 盐 难 溶 于 水 ， 易 溶 于 甲 醇 等 有 机 溶 剂 。 青 霉 素 的 碱 金 属 盐 水 溶 液 遇 酸 则 析 出 游 离 基 的 白 色 沉 淀 。 (4) 紫 外 吸 收 特 性 ： 青 霉 素 类 分 子 中 的 母 核 部 分 无 共 轭 系 统 ， 但 其 侧 链 酰 胺 基 上 R 取 代 基 若 有 苯 环 等 共 轭 系 统 ， 则 有 紫 外 吸 收 特 征 。 如 青 霉 素 钾 (钠 )的 R 为 苄 基 ， 因 而 其 水 溶 液 在 264nm 波 长 处 具 有 较 强 的 紫 外 吸 收 。 而 头 孢 菌 素 类 母 核 部 分 具 有 O C N C C 结 构 ， R 取 代 基 具 有 苯 环 等 共 轭 系 统 ， 有 紫 外 吸 收 。 本 类 药 物 在 不 同 条 件 下 的 降 解 反 应 见 图 16-1 和 图 16-2。 二 、 鉴 别 试 验 本 类 药 物 的 鉴 别 试 验 ， 现 版 ChP、 USP、 BP 采 用 的 方 法 主 要 为 HPLC、 IR 和 TLC 法 。 (一 ) 色 谱 法 利 用 比 较 供 试 品 溶 液 主 峰 与 对 照 品 溶 液 主 峰 的 保 留 时 间 (tR)是 否 一 致 或 比 较 供 试 品 溶 液 与 对 照 品 溶 液 所 显 主 斑 点 的 位 置 和 颜 色 是 否 相 同 进 行 鉴 别 。 HPLC 法 一 般 都 规 定 在 含 量 测 定 项 下 记 录 的 色 谱 图 中 ， 供 试 品 溶 液 主 峰 应 与 对 照 品 溶 液 主 峰 的 保 留 时 间 一 致 。 中 国 药 典 对 鉴 别 试 验 中 有 HPLC 法 又 有 TLC 法 的 ， 规 定 可 在 两 种 鉴 别 方 法 中 选 做 一 种 。 12 (二 ) 光 谱 法 1 红 外 吸 收 光 谱 (IR) 红 外 吸 收 光 谱 反 映 了 分 子 的 结 构 特 征 ， 各 国 药 典 对 收 载 的 -内 酰 胺 类 抗 生 素 几 乎 均 采 用 了 本 法 进 行 鉴 别 。 该 类 抗 生 素 的 -内 酰 胺 环 羰 基 的 伸 缩 振 动 (1750 1800cm-1)， 仲 酰 胺 的 氨 基 、 羰 基 的 伸 缩 振 动 (3300cm-1、 1525 cm-1、 1680 cm-1)、 羧 酸 离 子 的 伸 缩 振 动 (1600cm-1、 1410cm-1)是 该 类 抗 生 素 共 有 的 特 征 峰 。 2 紫 外 吸 收 光 谱 (UV) 本 类 药 物 的 紫 外 光 谱 鉴 别 法 通 常 利 用 最 大 吸 收 波 长 鉴 定 法 ： 将 供 试 品 配 成 适 当 浓 度 的 溶 液 ， 直 接 测 定 紫 外 吸 收 光 谱 ， 根 据 其 最 大 吸 收 波 长 或 最 大 吸 收 波 长 处 的 吸 光 度 进 行 鉴 定 。 如 头 孢 唑 林 钠 的 紫 外 鉴 别 法 ： 取 本 品 适 量 ， 加 水 溶 解 并 稀 释 制 成 每 1ml 中 约 含 16g 的 溶 液 ， 在 272nm 的 波 长 处 有 最 大 吸 收 。 (三 ) 呈 色 反 应 1 羟 肟 酸 铁 反 应 青 霉 素 及 头 孢 菌 素 在 碱 性 中 与 羟 胺 作 用 ， -内 酰 胺 环 破 裂 生 成 羟 肟 酸 ； 在 稀 酸 中 与 高 铁 离 子 呈 色 。 哌 拉 西 林 (钠 )、 头 孢 哌 酮 、 拉 氧 头 孢 钠 采 用 此 法 鉴 别 。 2 类 似 肽 键 的 反 应 本 类 药 物 具 有 -CONH-结 构 ， 一 些 取 代 基 有 -氨 基 酸 结 构 ， 可 显 双 缩 脲 和 茚 三 酮 反 应 。 3 其 他 呈 色 反 应 侧 链 含 有 -C6H5-OH 基 团 时 ， 能 与 重 氮 苯 磺 酸 试 液 产 生 偶 合 反 应 而 呈 色 。 此 外 ， 本 类 药 物 还 可 与 变 色 酸 -硫 酸 、 硫 酸 -甲 醛 等 试 剂 反 应 而 呈 色 。 (四 ) 各 种 盐 的 反 应 钾 、 钠 离 子 的 火 焰 反 应 ： 青 霉 素 类 、 头 孢 菌 素 类 药 品 中 ， 许 多 制 成 钾 盐 或 钠 盐 供 临 床 使 用 ， 因 而 可 利 用 钾 、 钠 离 子 的 火 焰 反 应 进 行 鉴 别 。 13 如 阿 莫 西 林 钠 、 头 孢 尼 西 钠 、 头 孢 西 丁 钠 、 头 孢 曲 松 钠 等 钠 离 子 的 鉴 别 ； 青 霉 素 钾 、 青 霉 素 钾 等 钾 离 子 的 鉴 别 。 三 、 检 查 本 类 抗 生 素 的 杂 质 主 要 有 高 分 子 聚 合 物 、 有 关 物 质 、 异 构 体 等 ， 一 般 采 用 HPLC 法 控 制 其 限 量 ， 也 有 采 用 测 定 杂 质 的 吸 光 度 来 控 制 杂 质 量 的 。 此 外 ， 有 的 还 进 行 结 晶 性 、 抽 针 与 悬 浮 时 间 等 有 效 性 试 验 ， 部 分 抗 生 素 还 检 查 有 机 溶 剂 残 留 量 。 (一 ) 聚 合 物 中 国 药 典 规 定 需 检 查 聚 合 物 ， 聚 合 物 的 检 查 采 用 分 子 排 阻 色 谱 法 。 分 子 排 阻 色 谱 法 是 根 据 待 测 组 分 的 分 子 大 小 进 行 分 离 的 一 种 液 相 色 谱 技 术 ， 其 分 离 原 理 为 凝 胶 色 谱 柱 的 分 子 筛 机 制 。 色 谱 柱 多 以 亲 水 硅 胶 、 凝 胶 或 经 修 饰 凝 胶 ， 如 葡 聚 糖 凝 胶 (Sephadex)和 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 (Sepharose)等 为 填 充 剂 ， 这 些 填 充 剂 表 面 分 布 着 不 同 尺 寸 的 孔 径 ， 药 物 分 子 进 入 色 谱 柱 后 ， 它 们 中 的 不 同 组 分 按 其 分 子 大 小 进 入 相 应 的 孔 径 内 ， 大 于 所 有 孔 径 的 分 子 不 能 进 入 填 充 剂 颗 粒 内 部 ， 在 色 谱 过 程 中 不 被 保 留 ， 最 早 被 流 动 相 洗 脱 至 柱 外 ， 表 现 为 保 留 时 间 较 短 ； 小 于 所 有 孔 径 的 分 子 能 自 由 进 入 填 充 剂 表 面 的 所 有 孔 径 ， 在 色 谱 柱 中 滞 留 时 间 较 长 ， 表 现 为 保 留 时 间 较 长 ； 其 余 分 子 则 按 分 子 大 小 依 次 被 洗 脱 。 分 子 排 阻 色 谱 法 所 需 的 进 样 器 和 检 测 器 同 高 效 液 相 色 谱 法 ， 液 相 色 谱 泵 一 般 分 常 压 、 中 压 和 高 压 。 在 药 物 分 析 中 ， 尤 其 是 分 子 量 或 分 子 量 分 布 测 定 中 ， 通 常 采 用 高 效 分 子 排 阻 色 谱 法 (HPSEC)。 应 选 用 与 供 试 品 分 子 大 小 相 适 应 的 色 谱 柱 填 充 剂 。 使 用 的 流 动 相 通 常 为 水 溶 液 或 缓 冲 液 ， 14 其 pH 不 宜 超 出 填 充 剂 的 耐 受 力 ， 一 般 pH 在 2 8 之 间 。 流 动 相 中 可 加 入 适 量 的 有 机 溶 剂 ， 但 不 宜 过 浓 ， 一 般 不 应 超 过 30%， 流 速 不 宜 过 快 ， 一 般 为 0.5 1.0ml/min。 高 效 分 子 排 阻 色 谱 法 的 系 统 适 用 性 试 验 中 色 谱 柱 的 理 论 板 数 (n)、 分 离 度 、 重 复 性 、 拖 尾 因 子 的 测 定 方 法 ， 在 一 般 情 况 下 ， 同 高 效 液 相 色 谱 法 项 下 方 法 ， 但 在 高 分 子 杂 质 检 查 时 ， 某 些 药 物 分 子 的 单 体 与 其 二 聚 体 不 能 达 到 基 线 分 离 时 ， 其 分 离 度 的 计 算 公 式 为 ： R=二 聚 体 的 峰 高 /单 体 与 二 聚 体 之 间 的 谷 高 。 除 另 有 规 定 外 ， 分 离 度 应 大 于 2.0。 定 量 方 法 ： 主 成 分 自 身 对 照 法 。 一 般 用 于 高 分 子 杂 质 含 量 较 低 的 品 种 。 面 积 归 一 化 法 。 限 量 法 。 规 定 不 得 检 出 保 留 时 间 小 于 对 照 品 保 留 时 间 的 组 分 ， 一 般 用 于 混 合 物 中 高 分 子 物 质 的 控 制 。 自 身 对 照 外 标 法 。 一 般 用 于 Sephadex G-10 凝 胶 色 谱 系 统 中 -内 酰 胺 抗 生 素 中 高 分 子 杂 质 的 检 查 。 在 该 分 离 系 统 中 ， 除 部 分 寡 聚 物 外 ， - 内 酰 胺 抗 生 素 中 高 分 子 杂 质 在 色 谱 过 程 中 均 不 保 留 ， 即 所 有 的 高 分 子 杂 质 表 现 为 单 一 的 色 谱 峰 ， 以 供 试 品 自 身 为 对 照 品 ， 按 外 标 法 计 算 供 试 品 中 高 分 子 杂 质 的 相 对 百 分 含 量 。 (二 ) 有 关 物 质 和 异 构 体 -内 酰 胺 类 抗 生 素 中 的 有 关 物 质 和 异 构 体 通 常 采 用 色 谱 法 检 查 。 本 类 药 物 多 数 规 定 有 关 物 质 检 查 ， 部 分 还 检 查 异 构 体 杂 质 。 头 孢 呋 辛 酯 中 有 关 物 质 和 异 构 体 的 检 查 ： 色 谱 条 件 与 系 统 适 用 性 试 验 ： 以 十 八 烷 基 硅 胶 键 合 硅 胶 为 填 充 剂 ； 以 0.2mol/L 磷 酸 二 氢 铵 溶 液 -甲 醇 (62 38)为 流 动 相 ； 检 测 波 长 为 278 nm。 取 头 孢 呋 辛 酯 对 照 品 适 量 ， 加 流 动 相 溶 解 并 稀 释 制 成 每 1ml 中 约 含 0.2 mg 的 溶 液 ， 15 取 此 液 在 60 水 浴 中 加 热 至 少 1 小 时 ， 冷 却 ， 得 含 头 孢 呋 辛 酯 3- 异 构 体 的 溶 液 ； 另 取 本 品 适 量 ， 加 流 动 相 溶 解 并 稀 释 制 成 每 1ml 中 约 含 0.2 mg 的 溶 液 ， 经 紫 外 光 照 射 24 小 时 ， 得 含 头 孢 呋 辛 酯 E 异 构 体 的 溶 液 。 取 上 述 两 种 溶 液 各 20l， 分 别 注 入 液 相 色 谱 仪 ， 记 录 色 谱 图 。 头 孢 呋 辛 酯 A、 B 异 构 体 、 3-异 构 体 及 E 异 构 体 峰 的 相 对 保 留 时 间 分 别 约 为 1.0、 0.9、 1.2 及 1.7 和 2.1。 头 孢 呋 辛 酯 A、 B 异 构 体 之 间 ， 头 孢 呋 辛 酯 A 异 构 体 与 3-异 构 体 之 间 的 分 离 度 应 符 合 要 求 。 测 定 法 ： 取 本 品 适 量 ， 精 密 称 定 (约 相 当 于 头 孢 呋 辛 酯 25mg)， 置 100ml 量 瓶 中 ， 加 甲 醇 5ml 溶 解 ， 再 用 流 动 相 稀 释 至 刻 度 ， 摇 匀 ， 立 即 精 密 量 取 20l 注 入 液 相 色 谱 仪 ， 记 录 色 谱 图 ； 另 取 头 孢 呋 辛 酯 对 照 品 适 量 ， 同 法 操 作 并 测 定 。 按 外 标 法 以 头 孢 呋 辛 酯 主 峰 峰 面 积 计 算 供 试 品 的 含 量 。 异 构 体 ： 在 含 量 测 定 项 下 记 录 的 供 试 品 溶 液 色 谱 图 中 ， 头 孢 呋 辛 酯 A 异 构 体 峰 面 积 与 头 孢 呋 辛 酯 A、 B 异 构 体 峰 面 积 和 之 比 应 为 0.48 0.55。 有 关 物 质 ： 取 本 品 适 量 ， 精 密 称 定 (约 相 当 于 头 孢 呋 辛 酯 50mg)， 置 100ml 量 瓶 中 ， 加 甲 醇 10ml， 强 力 振 摇 溶 解 ， 再 用 流 动 相 稀 释 至 刻 度 ， 摇 匀 ， 作 为 供 试 品 溶 液 ； 精 密 量 取 1ml， 置 100ml 量 瓶 中 ， 用 流 动 相 稀 释 至 刻 度 ， 摇 匀 ， 作 为 对 照 溶 液 。 取 对 照 溶 液 20l 注 入 液 相 色 谱 仪 ， 调 节 检 测 灵 敏 度 ， 使 两 主 成 分 中 任 一 主 成 分 色 谱 峰 的 峰 高 约 为 满 量 程 的 20%， 立 即 精 密 量 取 供 试 品 溶 液 与 对 照 溶 液 各 20l， 分 别 注 入 液 相 色 谱 仪 ， 记 录 色 谱 图 至 头 孢 呋 辛 酯 A 异 构 体 峰 保 留 时 间 的 16 3.5 倍 。 供 试 品 溶 液 色 谱 图 中 如 有 杂 质 峰 ， 两 个 E 异 构 体 峰 面 积 之 和 不 得 大 于 对 照 溶 液 两 个 主 峰 面 积 之 和 (1.0%)， 3-异 构 体 峰 面 积 不 得 大 于 对 照 溶 液 两 个 主 峰 面 积 之 和 的 1.5 倍 (1.5%)， 其 他 单 个 杂 质 峰 面 积 不 得 大 于 对 照 溶 液 两 个 主 峰 面 积 之 和 的 0.5 倍 (0.5%)， 各 杂 质 峰 面 积 的 和 不 得 大 于 对 照 溶 液 两 个 主 峰 面 积 之 和 的 3 倍 (3.0%)， 供 试 品 溶 液 色 谱 图 中 任 何 小 于 对 照 溶 液 两 个 主 峰 面 积 之 和 0.05 倍 的 峰 可 忽 略 不 计 。 此 外 ， 一 些 药 物 如 氨 苄 西 林 需 检 查 N,N-二 甲 基 苯 胺 ， 采 用 GC 法 测 定 ， 限 量 为 “不 得 过 百 万 分 之 二 十 ”； 头 孢 拉 啶 需 检 查 头 孢 氨 苄 等 有 关 物 质 。 (三 ) 吸 光 度 药 典 也 常 采 用 测 定 杂 质 吸