拟南芥热激蛋白的 westren blotting试验设计书

拟南芥 At-HsfA1a 过量表达转基因植株与非转基因植株的 At-HsfA1a 和 HSP70 表达量分析 (1) 转基因和非转基因植株的生长： 将转基因和非转基因的种子消毒后（无菌水浸泡半小时；1%升汞 3min； 70%乙醇 1min；无菌水洗三次。）分别播种于含 PPT（10mg/l）和不含 PPT 的 1/2 MS 盐培养基中。15 天后，将小苗移入土中进行栽培。 (2) 小苗逆境处理（取生长状态较为健康的叶片 13 张， 约 80-100mg 左右）： 加热处理：将叶片置于 SIB 缓冲液中，39，30min 酸处理：将叶片置于用琥珀酸调的 pH 值最终为 3.5 的 SIB 中，20min 碱处理：将叶片置于用 Tris 碱调过的 pH 最终为 8.0 的 SIB 中，20min 过氧化氢处理：将叶片置于 5mM 的过氧化氢中，45min 以上处理除加热外其余均在抽真空的情况下进行 (3) 叶片总蛋白提取： 吸去逆境处理液，同时加入 PBS buffer 清洗；用滤纸吸干叶片（0. 1g）表面缓冲液，加入液氮研磨；加入 50ul lysis buffer +0.5ul DTT（使用的是凯基 Caspase-3 分光光度法检测试 剂盒中配套的蛋白质提取缓冲液 lysis buffer 和 DTT 缓冲 液） ，冰上裂解 2060min，期间振荡 34 次，每次 10 秒；4 10000rpm,1min,离心两次，去掉沉淀，取上清。 (4) 蛋白质浓度测定： 取 5ul crude extract（粗提物）+ 95 bradford, OD595 下测定光吸收值，根据标 准曲线测定蛋白质粗提物的浓度。 考马斯亮兰法 具体操作步骤:（一）实验原理 1976 年由 Bradford 建立的考马斯亮兰法（ Bradford 法），是根据蛋白质与染料相结合 的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛 的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。 2 考马斯亮兰 G-250 染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置 （lmax），由 465nm 变为 595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为，染料 主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。 在 595nm 下测定的吸光度值 A595，与蛋白质浓度成正比。 Bradford 法的突出优点是： （1）灵敏度高，据估计比 Lowry 法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达 1mg。这是因为 蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质染料复合物有更高的消光系数，因而 光吸收值随蛋白质浓度的变化比 Lowry 法要大的多。 （2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要 5 分钟左右。由 于染料与蛋白质结合的过程，大约只要 2 分钟即可完成，其颜色可以在 1 小时内保持稳定， 且在 5 分钟至 20 分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像 Lowry 法那样费时和严 格地控制时间。 （3）干扰物质少。如干扰 Lowry 法的 K 、Na 、Mg2 离子、Tris 缓冲液、糖和蔗糖、 甘油、巯基乙醇、EDTA 等均不干扰此测定法。 此法的缺点是： （1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此 Bradford 法用于不同 蛋白质测定时有较大的偏差，在制作 标准曲线时通常选用 g球蛋白为标准蛋白质，以 减少这方面的偏差。 （2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、 Triton X-100、十二 烷基硫酸钠（SDS）和 0.1N 的 NaOH。（如同 0.1N 的酸干扰 Lowary 法一样）。 （3）标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用 Beer 定律进行计算，而只能用标准曲线来 测定未知蛋白质的浓度。 （二）试剂与器材 1. 试剂： （1）标准蛋白质溶液，用 g球蛋白或牛血清清蛋白(BSA)，配制成 1.0mg/ml 和 0.1mg/ml 的标准蛋白质溶液。 （2）考马斯亮兰 G250 染料试剂：称 100mg 考马斯亮兰 G250，溶于 50ml 95%的 乙醇后，再加入 120ml 85%的磷酸，用水稀释至 1 升。 2. 器材： （1）可见光分光光度计 （2）旋涡混合器 （3 ）试管 16 支 （三）操作方法 1. 标准方法 （1）取 16 支试管，1 支作空白， 3 支留作未知样品，其余试管分为两组按表中顺序，分 别加入样品、水和试剂，即用 1.0mg/ml 的标准蛋白质溶液给各试管分别加入： 0、0.01、0.02 、0.04 、0.06、0.08、0.1ml ，然后用无离子水补充到 0.1ml。最后各试管 中分别加入 5.0ml 考马斯亮兰 G250 试剂，每加完一管，立即在旋涡混合器上混合（注 意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除）。未知样品的加样量见下表中的第 8、9、10 管。 （2）加完试剂 25 分钟后，即可开始用比色皿，在分光光度计上测定各样品在 595nm 处 的光吸收值 A595，空白对照为第 1 号试管，即 0.1mlH2O 加 5.0mlG250 试剂。 注意：不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用 少量 95%的乙醇荡洗，以洗去染色。塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。 3 （3）用标准蛋白质量（mg）为横座标，用吸光度值 A595 为纵座标，作图，即得到一条 标准曲线。由此标准曲线，根据测出的未知样品的 A595 值，即可查出未知样品的蛋白质 含量。 0.5mg 牛血清蛋白/ml 溶液的 A595 约为 0.50。 2. 微量法 当样品中蛋白质浓度较稀时（10100mg/ml）,可将取样量（包括补加的水）加大到 0.5ml 或 1.0ml, 空白对照则分别为 0.5ml 或 1.0ml H2O, 考马斯亮蓝 G250 试剂仍加 5.0ml, 同时作相应的标准曲线，测定 595nm 的光吸收值。0.05mg 牛血清蛋白/ml 溶液的 A595 约为 0.29。 (5) 加入等体积 2XSDS loading buffer, 沸水煮 10min。根据蛋白质浓度的不同， 取不同体积的量上样，以使蛋白上样量一致，控制蛋白质的上样总量为 12ug 左 右。 (6) SDS-PAGE 电泳检测 使用浓缩胶 2.7%; 分离胶 7.5的聚丙烯凝胶进行电泳；上样时，使用的 蛋白质 Marker 为 Marker 为 High Molecular Weight Calibration Kit for Electrophoresis；跑胶时，使用恒流 20mA, 室温下 1.5 小时即可。其他操作 均与一般的 SDS-PAGE 电泳的一致。 胶的制备 利用 BIO-RAD 的蛋白电泳装置，灌制厚度为 1.5mm、浓度为 10%的分离 胶 3.5ml，及 5的浓缩胶，待浓缩胶聚合后，轻轻地拔出梳子立即用电极缓冲 液冲洗上样孔，组装电泳仪，加入电极缓冲液。 样品的制备 10l 样品+10l 的 2上样缓冲液(100mM Tris pH 6.8，4% SDS, 20% 甘 油，10% 巯基乙醇，0.02% 溴酚兰)混匀后煮沸 10 min，短暂离心后即可上样。 电泳 连接电源，先以恒压 80v 电泳至溴酚兰染料从浓缩胶进入分离胶时，将电 压调至 120v 至溴酚兰达到胶的底部。关掉电源，停止电泳。 剥胶、染色和脱色 弃去电泳缓冲液，用专用工具轻轻将玻璃板撬开，切除凝胶的一角作为标 记用去离子水冲洗凝胶，并轻轻将凝胶剥离出来，移至大培养皿中。加入 30-35 4 毫升考马斯亮蓝染色液，在脱色摇床上染色约 2 h 后，弃染色液，用冲洗后加 入适量脱色液进行脱色，直到显出清晰的蓝色条带和干净的背景。注意在操作 中尽量不能用手接触凝胶。 (7)对 At-HsfA1a, y-Hsf 进行电印迹转膜及 western 分析 水浴式电印迹 剪取和凝胶同样大小的 PVDF 膜一张及 Watman 3MM 滤纸四张，在 100% 甲醇溶液中浸没 23s，再转移到电印迹缓冲液中，浸没 15min。同样将电泳后 的 SDS 聚丙烯酰胺凝胶（不染色）转移到电印迹缓冲液中，浸没 12min。打 开转移槽的胶板并依次放入：电印迹缓冲液浸湿的海绵；与凝胶等大的电印迹 缓冲液浸湿后的 Watman 3MM 滤纸；SDS 聚丙烯酰胺凝胶；PVDF 膜；与凝胶 等大的电印迹缓冲液浸湿后的 Watman 3MM 滤纸；电印迹缓冲液浸湿后的海棉。 即做成转移印迹夹心饼（transblotting sandwich） ，注意在做每一层时都要用玻璃 棒抹去所有的气泡。小心合上转移槽的胶板，向槽内倒入电印迹缓冲液，浸没 转移胶板。以 50v 恒压进行电印迹转膜，室温下 4h。注意凝胶的一侧接电源负 极，PVDF 膜的一侧接电源正极。60mA，2.5h，冰浴搅拌下使其尽量保持低温 同时温度均匀。 封闭( 以后所有操作均在室温下进行)：用 3BSA 的 blocking buffer 摇床上 封闭 30min。转膜后，膜上其它没有结合蛋白质的空白位置需要用封闭液加以封 闭，以避免非特异性结合。这是由于 Western Blotting 的灵敏度，特异性在很大 程度取决于封闭的好坏。过度的封闭导致抗原表位的遮蔽，从而降低检测灵敏度。 不完全封闭又会导致最终背景增高或信噪比太低。最常用的封闭液是脱脂奶粉， 由于脱脂奶粉的成分比较复杂，里面微量的生物素或碱性磷酸酶就可能造成背 景的污染而不太适合生物素亲和素检测和碱性磷酸酶底物检测系统。另外，脱 脂奶粉里的其它微量蛋白质有可能和待检测抗原有相似的抗体识别表位而造成 交叉反应。 5 加一抗：自制抗血清可按 1:500 或 1:1000 的比例加入，然后在 1.5BSA 的 half-blocking buffer 中，摇床上共培养 1h。之后洗去一抗：用 washing buffer 洗 膜 3 次，每次摇床 5min。 加二抗：分别加入 goat anti-rabbit Ig G(alkaline phosphatase conjugate) 2ul 于 5ml 的 1.5BSA 的 half-blocking buffer 中，摇床上共培养 2h。之后洗去二抗： 用 washing buffer 洗膜 5 次，每次摇床上 5min. 使用 NBT/BCIP 显色试剂盒摇床避光条件下显色，约 5-20min 后，待印迹出现且背景 不太浓时终止显色，用水洗去显色液，用滤纸吸干。 碱性磷酸酶 经免疫反应固定的碱性磷酸酶可催化底物 5-溴-4-氯-3- 吲跺磷酸氮蓝四唑（BCIPNBT）在原位转变为深蓝色化合物。 1）配制下列 3 种溶液： NBT 在 10 ml 70的二甲基甲酰胺中溶解 0.5g NBT。 BCIP 在 10 ml 100的二甲基甲酰胺中溶解 0.5BCIP。 碱性磷酸酶缓冲液 100 mmol/L NaCl 5 mmol/L MgCl2 100 mmol/L Tris-Cl （pH9.5） 放在密闭容器中保存于室温，这一溶液是稳定的。 2）取 66l