斑点杂交法检测

斑点杂交法检测结核分枝杆菌临床应用价值探讨 作者：陆文英 作者单位：江苏省盐城市慈航医院， 江苏 盐城 224001 【摘要】 目的：探讨斑点杂交法检测结核分枝杆菌的临床应用价值。方法:用抗酸染色法、 L-J 培养法、PCR 法和斑点杂交法平行检测 76 例临床标本和 28 种标准菌株。 结果:46 例 肺结核患者痰标本抗酸染色法、L-J 培养法、PCR 法和斑点杂交法结核分枝杆菌检测阳性 率分别为 43.4%、50.0%、73.9%和 56.5%；30 例非结核患者痰标本、19 种非结核分枝杆菌 和 9 种非分枝杆菌标准株培养法和斑点杂交法检测结果均为阴性，PCR 法有 3 例阳性。结 论:斑点杂交法检测结核分枝杆菌方法简便，结果可靠，可用于结核病的快速诊断。 【关键词】 结核分枝杆菌 点杂交 酸染色 L-J 培养 The Clinical Value of Detection Mycobacterium Tuberculosis by Dot Blot Hybridization LU Wen-ying, et al (Cihang Hospital of Yancheng City, Jiangsu Yancheng 224001,China) Abstract:Objective: To study the clinical value of detecting mycobacterium tuberculosis by dot blot hybridization. Methods: Acid fast stain , L-J culture ,PCR and dot blot hybridization was uesd to detect the seventy-six clinical isolates and twenty-eight kinds of normal tuberculosis . Result:Acid fast stain L-J culture ,PCR ,dot blot hybridization was used to detect the mycobacterium tuberculosis of sputum of forty-six pulmonary tuberculosis,and their positive rate was 43.4%,50.0%,73.9%,56.5% respectively.The results of thirty non-pulmonary tuberculosis ,nineteen kinds of non- mycobacterium tuberculosis and nine kinds of non-mycobacteri which was detected by culture and dot blot hybridization were all negative. The results of three specimens were positive when they were detected by PCR.Conclusion:Using dot blot hybridization to detect mycobacterium tuberculosis is simplified and the results is reliable. It can be uesd to rapid diagnosis of TB. Key words: Mycobacterium tuberculosis; Dot blot hybridization; Acid fast stain; L-J culture 近年来结核病的发病率大幅提高，为早期、快速、准确诊断结核病，我们建立了斑点 杂交法直接检测痰标本中结核分枝杆菌，并应用于临床，同时与传统的涂片抗酸染色法、 L-J 培养法、PCR 法进行平行观察，以探讨其临床应用价值。 1 材料和方法 1.1 菌种来源: 19 种非结核分枝杆菌标准株来自中国药品生物制品检定所，9 种非分 枝杆菌来自中国科学院微生物研究所。 1.2 标本来源：46 例结核病人痰标本来自 2004 年至 2006 年盐城第一人民医院门诊病 人和盐城市第二人民医院门诊、住院病人，所有病人均经培养或临床证实患有活动性肺结 核，30 份非结核病人痰标本来自盐城第一人民医院呼吸科住院病人。标本采集后平行做 4 项检查，首先集菌涂片镜检，余下标本经 3%NaAC-NaOH 处理后分别用 L-J 培养法、PCR 法、斑点杂交法进行检测。 1.3 试剂和仪器：斑点杂交法所用探针由上海生工公司合成，其 5端以地高辛标记， 探针序列：5-GGT GGA AAG CGC TTT AGC GGT-3。 FQ-PCR 试剂由深圳匹基公司提 供，扩增仪为罗氏公司 light cycle 型。 1.4 方法 1.4.1 斑点杂交法：根据结核分枝杆菌 16s rRNA 保守序列设计探针，其 5端以地高 辛标记，标本经 3%NaAC-NaOH 消化后，常规异硫氰酸胍裂解，酚 -氯仿抽提，异丙醇沉 淀法提取结核分枝杆菌 rRNA，将抽提的 rRNA 纯化后直接点样于硝酸纤维膜上，用地高 辛标记探针杂交，酶呈色观察结果。 1.4.2 FQ-PCR 法，严格按试剂说明书操作，同时作阳性，阴性对照。 1.4.3 集菌涂片抗酸染色法采用结核病诊断细菌学检验规程1推荐方法，痰培养采 用 L-J 培养法1 。 1.5 统计学处理:采用 PEMS3.0 统计软件对数据进行 X 2 检验。 2 结 果 2.1 四种方法平行检测结核患者痰标本中结核分枝杆菌，结果表明，集菌涂片镜检法， L-J 培养法、PCR 法、斑点杂交法结核分枝杆菌的检出率分别为 43.4%(20/46)、 50.0%(23/46)、73.9%(34/46) 、56.5%(26/46)，结果见表 1。表 1 46 例临床标本斑点杂交法 与其它三种方法平行检测结果（略） 2.2 30 例非结核呼吸系统疾病患者痰标本和牛分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、海鱼分枝 杆菌、胞内分枝杆菌、鸟分枝杆菌、猿猴分枝杆菌、苏加分枝杆菌、胃分枝杆菌、次要分 枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌、戈登分枝杆菌、偶然分枝杆菌、副偶然分枝杆菌、龟分枝杆菌、 龟分枝杆菌龟亚种、不产色分枝杆菌、母牛分枝杆菌、浅淡黄分枝杆菌、草分枝杆菌、金 黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、假白喉杆菌、草绿色甲链球菌、肺炎克雷伯菌、绿脓假单 胞菌、卡他球菌、大肠埃希菌、肺炎球菌检测结果显示，培养法、斑点杂交法均为阴性， PCR 法有 3 例阳性,培养法、斑点杂交法特异性为 100%，而 PCR 法特异性为 94.8%(55/58)。 3 讨 论 斑点杂交法根据结核分枝杆菌菌体内含有大量 rRNA 的特点，直接将细菌的 rRNA 抽 提后，点样于硝酸纤维膜上，用地高辛标记探针杂交，酶呈色观察结果，目前国内尚未见 报道。由于 rRNA 在细菌死后极易降解，一般认为只存在于活菌菌体内，故阳性具有结核 分枝杆菌活菌的诊断价值2 。该法采用探针杂交的方法，具有较高的特异性，同时又采 用酶呈色观察结果，使杂交信号得以放大，提高了灵敏度，有一定的推广应用价值。 传统的结核分枝杆菌检测方法主要有集菌涂片法和培养法，涂片法具有简便、快速、 价廉的特点，但检出率较低，并需进一步试验才可确定是否为结核分枝杆菌，同时它不能 鉴别菌体的死活。培养法一直被作为结核分枝杆菌检测的金标准，然而检测时间长，不适 合临床早期诊治的需求，同时影响其检出率的因素较多，易造成漏诊。近年来兴起的 PCR 方法，大大提高了检出率，但假阳性率较高，又有假阴性，从而影响其临床应用3 。实 验结果显示，斑点杂交法检测结核患者痰标本中结核分枝杆菌，检出率为 56.5%，高于集 菌涂片法（43.4%）和培养法（ 50.0%） ，低于 PCR 法的 73.9%；30 例对照组、19 种非结核 分枝杆菌和 9 种非分枝杆菌标准株检测结果显示，斑点杂交法、培养法均为阴性，特异性 为 100%，而 PCR 法有 3 例阳性，特异性为 94.8%，由此可以看出，斑点杂交法检测时间 短，结果准确，且不会像 PCR 检测出现假阳性，可以用结核病的快速诊断。 晋升网（）致力于成为医务工作者晋升职称心灵导师；是目前国内收录 医学期刊、医学杂志最多最权威的医学学术平台；提供免费医学期刊在线阅读；网罗和甄 选海量优秀医学论文检索，独立研发医学在线资源分享库和医学在线模拟考试库；整合刊 类、标题、关键词检索及全文检索，并独家研发刊社管理和刊社加盟系统、在线投稿、在 线查稿、在线阅读、远程审稿、在线下载等系统；聚刊社力量，建服务平台，让晋升网通 过“专业”走入每一个医务人员的身边是我们不懈的追求目标。 【参考文献】 中国防痨协会.结核病诊断细菌学检验规程.中国防痨杂志， 199