分子诊断学试卷

分 子 诊 断 学 试 卷 A二 、 填 空 （ 每 空 0.5分 ， 共 15分 。 请 将 答 案 填 写 在 答 题 纸 上 ） 1 .从 高 温 嗜 热 细 菌 中 发 现 高 温 DNA p o ly merase后 ， 使 得 PCR技 术 得 以 广泛 应 用 ， 在 高 温 下 有 活 性 的 DNA p o ly merase有 _、 _、 _、 _。 其 中 具有 3 -5 外 切 活 性 的 高 温 DNA p o ly merase有 _和 _。2 .黏 粒 (co smid )是 质 粒 噬 菌 体 杂 合 载 体 ， 它 的 复 制 子 来 自 、 co s位 点 序 列 来 自 ， 最 大 的 克 隆 片 段 达 到 4 5 k b 。3 .感 受 态 细 胞 (Co mp eten t cells)是 一 种 处 于 _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 状 态 的 细 胞 。 一 般 通 过 _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 来 诱 导 大 肠 杆 菌 感 受 态 的 形 成 。4 .PCR反 应 过 程 分 为 三 个 步 骤 ， 即 ， 和 。 5 . 细 菌 的 移 动 基 因 存 在 着 三 种 类 型 的 转 位 因 子 包 括 、 、 。6 .Klen o w酶 在 情 况 下 ， 呈 现 DNA聚 合 酶 活 性 ， 在 情 况 下 呈 现 外 切 酶 活 性 。7 . 外 源 基 因 在 原 核 细 胞 中 表 达 ， 常 用 的 启 动 子 有 、 、 、 和 。 8 . 在 La cZ标 记 基 因 插 入 外 源 基 因 ， 经 IPTG诱 导 ， 在 X-g al培 养 基 中 显色 ， 为 性 克 隆 ， 未 插 入 基 因 的 克 隆 显 色 ， 为 性 克 隆 。 9 . 基 因 序 列 经 碱 基 替 代 ， 缺 失 或 插 入 后 ， 可 使 遗 传 信 息 产 生 三 种 不 同 的后 果 ， 分 别 为 、 、 。 1 0 .由 一 个 细 胞 或 者 组 织 的 基 因 组 所 表 达 的 全 部 相 应 的 蛋 白 质 ， 称 为 。三 、 判 断 题 （ 错 的 打 “ ” ， 对 的 打 “ ” ， 每 题 1分 ， 共 10分 。 请 将 答 案 填 在 答 题 纸 对 应 的 题 号 下 ）1 . Max am-Gilb ert化 学 降 解 法 测 序 时 ， 从 测 序 胶 上 直 接 读 出 的 序 列 是 用 于 测 序 的 模 板 的 互 补 序 列 。2 . 蛋 白 酶 K可 有 效 地 降 解 内 源 蛋 白 ， 能 快 速 水 解 细 胞 裂 解 物 中 的 DNA酶 和 RNA酶 ， 以 利 于 完 整 DNA和 RNA的 分 离 。3 . 电 泳 时 EB加 在 琼 脂 糖 凝 胶 中 一 般 会 降 低 DNA在 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 中 的 迁 移 率 。4 . 提 取 DNA时 ， 若 用 酚 除 蛋 白 质 ， 需 要 用 Tris-HCl对 酚 进 行 平 衡 ,p H达 7 .8 。5 . 基 因 组 研 究 可 以 归 纳 成 为 构 建 4 张 相 互 关 联 的 基 因 组 图 谱 ： 遗 传 图 、 物 理 图 、 序 列 图 和 功 能 图 。6 . DNA连 接 酶 是 一 种 能 催 化 二 条 DNA链 之 间 形 成 磷 酸 二 酯 键 的 酶 ， 因 此 该 酶 既 可 修 复 基 因 序 列 中 的 缺 口 ， 也 可 修 复 裂 口 。7 . 质 粒 提 取 后 ， 在 琼 脂 糖 电 泳 出 现 一 条 带 时 说 明 质 粒 提 取 纯 度 高 ， 当 为 三 条 带 时 为 纯 度 不 高 。8 . COS位 点 ， COS质 粒 ， COS细 胞 它 们 均 含 有 用 于 自 身 环 化 的 1 2 个 碱 基 的 互 补 粘 性 末 端 。9 . 入 噬 菌 体 的 插 入 型 载 体 只 有 一 个 单 一 限 制 酶 切 点 ， 替 换 型 载 体 有 2 个 成 对 的 限 制 性 酶 切 点 。1 0 . 原 核 细 胞 和 真 核 细 胞 转 录 的 mRNA均 具 有 与 rRNA结 合 的 SD序 列 ， 以 利 于 进 行 有 效 的 转 录 。 四 、 选 择 题 （ 每 题 1分 ， 共 15分 。 请 将 最 佳 答 案 填 在 答 题 纸 对 应 的 题 号下 ） 1 . 用 于 核 酸 分 子 杂 交 的 探 针 不 能 是 放 射 性 标 记 的 ( )。A DNA B RNA C 抗 体 D 寡 核 苷 酸 2 . cDNA文 库 包 括 该 种 生 物 的 ( )。A 某 些 蛋 白 质 的 结 构 基 因 B 所 有 蛋 白 质 的 结 构 基 因 C 所 有 结 构 基 因 D 内 含 子 和 调 控 区3 . 关 于 碱 解 法 分 离 质 粒 DNA， 下 面 哪 一 种 说 法 不 正 确 ?( ) A 溶 液 I的 作 用 是 悬 浮 菌 体 B 溶 液 的 作 用 是 使 DNA变 性C 溶 液 的 作 用 是 使 DNA复 性 D 质 粒 DNA分 子 小 ， 所 以 没 有 变 性 ， 染 色 体 变 性 后 不 能 复 性 4 . 有 关 DNA 序 列 自 动 化 测 定 的 不 正 确 叙 述 是 （ ） 。 A 不 再 需 要 引 物 B 激 光 扫 描 分 析 代 替 人 工 读 序C 基 本 原 理 与 手 工 测 序 相 同 D 用 荧 光 代 替 了 同 位 素 标 记 5 . 在 重 组 DNA 技 术 中 ， 不 常 用 到 的 酶 是 （ ） 。A 限 制 性 核 酸 内 切 酶 B DNA 聚 合 酶 C DNA 连 接 酶 D DNA 解 链 酶6 . 关 于 cDNA 的 最 正 确 的 说 法 是 （ ） 。 A 以 mRNA 为 模 板 合 成 的 双 链 DNA B 同 mRNA 互 补 的 单 链DNA C 同 mRNA 互 补 的 双 链 DNA D 以 上 都 正 确7 . 在 分 离 DNA 过 程 造 成 DNA 分 子 断 裂 的 因 素 很 多 ， 下 列 说 法 中 哪 一 项 是 不 正 确 的 （ ） 。A 核 酸 酶 的 降 解 B 化 学 降 解 C 保 存 液 中 未 加 一 滴 氯 仿 D 物 理 剪 切8 . 下 列 哪 一 项 不 是 So u th ern b lo ttin g 的 步 骤 （ ） 。 A 用 限 制 酶 消 化 DNA B DNA 与 载 体 的 连 接C 凝 胶 电 泳 分 离 DNA 片 段 D DNA 片 段 转 移 到 硝 酸 纤 维 膜 上 9 . 下 列 哪 种 克 隆 载 体 对 外 源 DNA 的 装 载 量 最 大 （ ） 。A 粘 粒 B 酵 母 人 工 染 色 体 C 质 粒 D 噬 菌 体 1 0 . 人 工 染 色 体 载 体 必 须 具 有 的 元 件 是 （ ） 。A 染 色 体 端 粒 B 着 丝 粒 C 自 主 复 制 序 列 D 以 上 三 项 全 部 1 1 . 噬 菌 体 外 包 装 目 的 基 因 片 段 的 大 小 应 为 （ ） 。A.小 于 噬 菌 体 DNA的 5 0 % B. 小 于 噬 菌 体 DNA的 7 5 % C.大 于 噬 菌 体 DNA的 1 0 5 % D.为 噬 菌 体 DNA的 7 5 % 105%1 2 .识 别 基 因 序 列 不 同 ， 但 酶 切 后 产 生 的 粘 性 末 端 相 同 的 一 类 酶 为 （ ） 。A.同 工 酶 B.同 尾 酶 C.同 裂 酶 D.同 位 酶 1 3 .下 列 生 物 体 的 细 胞 基 因 组 哪 些 会 有 断 裂 基 因 ？ （ ）A.大 肠 杆 菌 B.乙 肝 病 毒 C.人 D.噬 菌 体 1 4 . 真 核 细 胞 基 因 表 达 的 特 点 为 （ ） 。A.单 顺 反 子 B.多 顺 反 子 C.转 录 和 转 译 连 续 进 行 D .转 录 和 转 译 在 同 一 时 空 进 行 1 5 . p BR3 2 2 质 粒 作 为 基 因 克 隆 载 体 不 具 有 下 列 何 种 调 控 元 件 （ ） 。A.Amp r和 Tetr B.o ri复 制 子 C.La cZ标 记 D.多 克 隆 位 点 五 、 问 答 题 （ 共 36分 ， 请 将 答 案 填 写 在 答 题 纸 对 应 的 题 号 下 ）1 . 真 核 细 胞 基 因 组 中 的 基 因 常 有 内 含 子 存 在 ， 能 否 在 原 核 细 胞 中 表 达 ？ 为 什 么 ？ （ 5分 ）2 . 质 粒 单 酶 切 点 的 基 因 连 接 如 何 降 低 本 底 和 防 止 自 我 环 化 和 提 高 连 接 效 率 ？ （ 6分 ）3 . 真 核 表 达 调 控 的 顺 式 作 用 元 件 有 哪 些 ？ 其 作 用 特 点 是 什 么 ？ （ 8分 ） 4 . 基 因 工 程 疫 苗 研 究 开 发 应 遵 循 的 原 则 是 什 么 ？ （ 8分 ）5 . 有 哪 几 种 反 义 核 苷 酸 基 因 失 活 疗 法 ？ 简 述 其 原 理 。 （ 9分 ） 答 案 -试 卷 A一 、 名 词 解 释 （ 每 题 3分 ， 共 24分 。 请 将 答 案 填 写 在 答 题 纸 上 ） 1 . 分 子 诊 断 ： 是 指 通 过 检 测 基 因 的 结 构 异 常 或 其 表 达 异 常 ， 对 人 体 的 健 康 状况 和 疾 病 做 出 诊 断 的 方 法 。 2 . 实 时 定 量 PCR(real-time PCR)： 7 .实 时 PCR： 通 过 特 定 设 计 的 PCR 仪 器 来 实时 检 测 PCR 扩 增 过 程 每 一 轮 循 环 产 物 的 累 积 数 量 ， 推 算 模 板 的 起 始 浓 度 ， 这 种 工 作 方 式 就 称 为 实 时 PCR3 . 重 叠 基 因 ： 不 同 基 因 的 核 苷 酸 序 列 有 时 为 相 邻 两 个 基 因 共 用 ， 将 核 苷 酸 彼 此 重 叠 的 两 个 基 因 称 为 重 叠 基 因4 . 锌 指 结 构 ： 由 两 个 半 胱 氨 酸 （ Cy s） 残 基 和 两 个 组 氨 酸 （ His） 残 基 通 过 位 于 中 心 的 锌 离 子 结 合 成 一 个 稳 定 的 指 状 结 构 , 并 以 锌 辅 基 敖 合 形 成 的 环 状 结构 作 为 活 性 单 位 , 在 指 状 突 出 区 表 面 暴 露 的 碱 基 及 其 极 性 氨 基 酸 与 DNA 合 有 关5 . 基 因 置 换 ： 是 指 将 致 病 基 因 整 个 地 被 有 功 能 的 正 常 基 因 所 置 换 ， 使 致 病 基 因 永 久 地 得 到 更 正 。6 . 基 因 敲 除 ： 基 因 敲 除 是 向 正 常 生 物 个 体 内 引 入 某 个 突 变 的 基 因 位 点 而 选 择 性 地 使 某 特 定 基 因 功 能 失 活 的 技 术 。7. 基 因 芯 片 ： 将 大 量 的 基 因 片 段 有 序 地 、 高 密 度 地 排 列 在 玻 璃 片 或 纤 维 膜 等 载 体 上 ， 称 之 为 基 因 芯 片 （ 又 称 DNA 芯 片 、 生 物 芯 片 ） 。8 . 蛋 白 质 组 学 ： 指 应 用 各 种 技 术 手 段 来 研 究 蛋 白 质 组 的 一 门 新 兴 学 科 ， 即 研 究 细 胞 在 不 同 生 理 或 病 理 条 件 下 蛋 白 质 表 达 的 异 同 ， 对 相 关 蛋 白 质 进 行 分类 和 鉴 定 。 更 重 要 的 是 蛋 白 质 组 学 的 研 究 要 分 析 蛋 白 质 间 相 互 作 用 和 蛋 白 质 的 功 能 .二 、 填 空 （ 每 空 0.5分 ， 共 15分 。 请 将 答 案 填 写 在 答 题 纸 上 ） 1 . Ta q DNA聚 合 酶 Tth DNA聚 合 酶 Ven t DNA聚 合 酶 Pwo DNA聚 合 酶DNA聚 合 酶 Pwo DNA聚 合 酶 Pfu DNA聚 合 酶 2 . 质 粒 噬 菌 体3 . 容 易 接 受 外 源 DNA片 段 CaCl 2 法4 . 变 性 退 火 延 伸 5 . 插 入 序 列 转 位 子 噬 菌 体 Mu和 D1086 . 有 d NTP 没 有 d NTP 7 . 乳 糖 启 动 子 Trp启 动 子 Tac启 动 子 噬 菌 体 的 PL和 PR启 动 子 脂 蛋 白 启 动 子 8 . 白 阳 性 蓝 阴9 . 同 义 突 变 错 义 突 变 无 义 突 变 1 0 . 蛋 白 质 组三 、 判 断 题 （ 错 的 打 “ ” ， 对 的 打 “ ” ， 每 题 1分 ， 共 10分 。 请 将 答 案 填 在 答 题 纸 对 应 的 题 号 下 ）题 号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 答 案 四 、 选 择 题 （ 每 题 1分 ， 共 15分 。 请 将 最 佳 答 案 填 在 答 题 纸 对 应 的 题 号 下 ）题 号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2 1 3 1 4 1 5 答案 CADADAC B B D D B C A C 五 、 问 答 题 （ 共 36分 ， 请 将 答 案 填 写 在 答 题 纸 对 应 的 题 号 下 ）1 . 真 核 细 胞 基 因 组 中 的 基 因 常 有 内 含 子 存 在 ， 能 否 在 原 核 细 胞 中 表 达 ？ 为 什 么 ？ （ 5分 ）答 ： 不 能 ， 因 为 原 核 细 胞 缺 乏 对 真 核 基 因 中 内 含 子 的 剪 接 功 能 和 转 录 后 加 工 系 统 。 原 核 生 物 必 须 有 相 应 的 原 核 RNA聚 合 酶 可 识 别 原 核 细 胞 的 启 动 子催 化 RNA的 合 成 。 基 因 表 达 是 以 操 纵 子 为 单 位 ， 操 纵 子 由 数 个 相 关 的 结 构 基 因 和 调 控 功 能 的 部位 组 成 的 。 因 此 在 构 建 原 核 表 达 载 体 时 必 须 有 1 个 强 的 原 核 启 动 子 及 其 两 侧 的 调 控 序 列 。2 . 质 粒 单 酶 切 点 的 基 因 连 接 如 何 降 低 本 底 和 防 止 自 我 环 化 和 提 高 连 接 效 率 ？ （ 6分 ）答 ： 目 的 基 因 片 断 与 载 体 由 相 同 的 单 一 限 制 性 核 酸 内 切 酶 （ 如 EcoRI） 消 化 酶 切 后 , 两 者 的 两 端 均 具 有 相 同 的 粘 性 末 端 , 称 为 单 酶 切 点 的 粘 性 末 端 , 又 称 全 同 源 性 粘 性 末 端 高 背 景 载 体 经 单 一 限 制 性 核 酸 内 切 酶 切 割 后 , 载 体 分 子 易 于 自 我 环 化 , 既 不 利 于 目 的 基 因 的 重 组 连 接 , 大 大 降 低 阳 性 克 隆 效 率 , 又 可 使 非 重 组 性 载 体 造 成 高 背 景 。 为 了 防 止 载 体 的 自 我 环 化 ， 通 常 用 碱 性 磷 酸 酶 去 除 载 体 粘 性 末 端 的 5 P以 抑 制 DNA的 自 我 环 化 。 在 连 接 反 应 中 , 具 有 5-P， 的 目 的 基 因 DNA片 断 可 有 效 地 与 去 磷 酸 化 质 粒 DNA载 体 通 过 粘 性 末 端 发 生 互 补 连 接 , 尽 管 产 生 的 重 组 DNA分 子 于 连 接 点 含 有 两 个 缺 口 的 开 环 分 子 ,尽 管 在 转 化 时 其 转 化 效 率 高 于 线 性 低 于 闭 和 环 , 但 转 化 大 肠 杆 菌 后 ,在 菌 体 内 其 缺 口 可 获 得 修 复 。 如 第 二 章 图 2-6 双 向 插 入 经 单 一 限 制 核 酸 内 切 酶 （ 如 EcoRI） 切 割 的 目 的 基 因 和 载 体 , 因 二 者 的 粘 性 末 端 是 相 同 的 , 因 此 在 连 接 反 应 中 , 目 的 基 因 可 发 生 双 向 插 入 , 载 体 对 目 的 基 因 表 达 是 有 方 向 的 , 而 目 的 基 因 可 双 向 与 之 相 连 , 这 种 连 接 若 以 克 隆 目 的 基 因 片 段 为 目 的 没 有 影 响 , 若 以 表 达 为 目 的 , 我 们 就 要 对 插 入 的 片 段 进 行 方 向 鉴 定 , 因 目 的 基 因 由 起 始 密 码 子 向 终 止 密 码 子 方 向 表 达 是 定 向 转 录 的 , 一 旦 启 动 子 与 目 的 基 因 编 码 顺 序 方 向 相 反 就 不 能 正 确 转 录 目 的 基 因 的 mRNA。 若 构 建 表 达 DNA重 组 体 选 用 双 酶 切 切 割 目 的 基 因 和 载 体 ， 可 使 目 的 基 因 与 载 体 的 连 接 发 生 定 向 连 接 重 组 , 以 便 定 向 克 隆 。3 . 真 核 表 达 调 控 的 顺 式 作 用 元 件 有 哪 些 ？ 其 作 用 特 点 是 什 么 ？ （ 8分 ） 答 ： 顺 式 作 用 元 件 为 一 些 能 与 DBP结 合 的 特 定 序 列 的 DNA片 段 , 决 定 转 录起 始 位 点 和 RNA聚 合 酶 的 转 录 效 应 ,按 功 能 可 分 为 启 动 子 、 增 强 子 、 沉 默 子 、 衰 减 子 和 终 止 子 等 DNA序 列 片 段 。 启 动 子 真 核 基 因 启 动 子 是 基 因 表 达 时 与 基 因 转 录 起 始 有 关 的 5端 DNA序 列 ,包 括 在 -30bp区 富 含 有 AT的 典 型 TATA盒 （ 框 ） （ TATA box） 和 在 -70 -80bp区 域 （ 在 TATA box上 游 ） 启 动 元 件 。 前 者 是 引 导 RNA聚 合 酶 在 正 确 起 始 位 点 转 录 mRNA所 必 需 的 DNA序 列 , 即 保 证 转 录 的 精 确 起 始 。 后 者 UPE是 调 节 转 录 起 始 频 率 和 提 高 转 录 效 率 的 调 控 序 列 ， 后 者 的 序 列 常 为 GGTCAAT和 GGGCCC序 列 , 称 为 GC box, 它 们 经 协 同 作 用 ,以 调 控 基 因 的 转 录 效 率 。 启 动 子 的 转 录 效 率 因 细 胞 而 异 ， 因 此 需 要 根 据 宿 主 细 胞 的 类 型 选 择 不 同 的 启 动 子 ， 以 便 真 核 基 因 的 高 效 表 达 。 常 用 的 启 动 子 有 Rous肉 瘤 病 毒 启 动 子 RSV和 巨 细 胞 病 毒 的 启 动 子 CMV。 还 有 SV40早 期 启 动 子 , 腺 病 毒 的 晚 期 启 动 子 。 增 强 子 增 强 子 是 使 启 动 子 的 基 因 转 录 效 率 显 著 提 高 （ 增 强 转 录 活 性 ） 的 一 类 顺 式 作 用 元 件 ， 其 本 身 不 具 有 启 动 子 活 性 ， 是 由 多 个 独 立 的 ， 具 有 特 征 性 的 核 苷 酸 序 列 所 组 成 。 其 基 本 的 核 心 组 件 常 由 812bp组 成 , 以 单 拷 贝 或 多 拷 贝 串 联 的 形 式 存 在 。 增 强 子 一 般 有 以 下 特 性 ： 增 强 子 能 提 高 同 一 条 DNA链 上 基 因 转 录 的 速 率 ; 增 强 子 对 同 源 或 异 源 基 因 都 有 效 ; 增 强 子 的 位 置 可 在 基 因 5上 游 、 3下 游 或 内 部 ; 无 方 向 性 ,增 强 子 从 5 3或 是 从 3 5均 可 对 启 动 子 发 挥 作 用 ; 增 强 子 可 远 离 转 录 起 始 点 ; 增 强 子 一 般 无 基 因 特 异 性 , 对 各 种 基 因 启 动 子 均 有 作 用 , 但 具 有 组 织 或 细 胞 特 异 性 。 典 型 的 增 强 子 首 先 发 现 于 SV40的 病 毒 中 , 为 SV40的 早 期 基 因 增 强 子 , 约 200bp, 含 2个 72bp的 重 复 序 列 , 位 于 早 期 启 动 子 上 游 , 增 强 子 可 促 使 病 毒 基 因 转 录 效 率 提 高 100倍 ， 因 此 具 有 这 一 增 强 子 的 载 体 已 得 到 了 广 泛 的 应 用 。 近 些 年 来 ， 来 自 于 Rous肉 瘤 病 毒 基 因 长 末 端 重 复 序 列 和 人 类 巨 细 胞 病 毒 （ CMV） 增 强 子 也 已 被 广 泛 用 于 真 核 细 胞 的 基 因 表 达 。 增 强 子 能 增 强 启 动 子 的 转 录 能 力 ， 有 效 的 增 强 子 能 促 进 转 录 达 10倍 或 100 倍 以 上 , 在 某 些 情 况 下 , 表 达 产 物 可 能 具 有 细 胞 毒 效 应 。 因 此 ， 最 好 使 用 一 种 可 被 外 界 刺 激 信 号 诱 导 表 达 外 源 基 因 的 诱 导 型 启 动 子 , 诱 导 型 启 动 子 有 热 休 克 启 动 子 、 金 属 硫 蛋 白 启 动 子 、 糖 皮 质 激 和 固 醇 类 激 素 诱 导 的 启 动 子 ， 热 休 克 启 动 子 的 诱 导 可 通 过 提 高 细 胞 的 培 养 温 度 使 启 动 子 转 录 水 平 提 高 ， 重 金 属 离 子 可 有 效 地 促 进 金 属 硫 蛋 白 启 动 子 的 转 录 活 性 。 RNA剪 接 信 号 多 数 高 等 的 真 核 基 因 都 含 有 内 含 子 序 列 , 在 细 胞 核 内 转 录 产 生 的 前 体 mRNA要 经 过 剪 接 过 程 去 掉 内 含 子 顺 序 后 才 成 为 成 熟 的 mRNA分 子 。 虽 然 许 多 基 因 的 cDNA转 入 哺 乳 类 动 物 细 胞 后 , 其 表 达 不 受 有 或 无 内 含 子 的 影 响 , 但 有 些 基 因 在 真 核 细 胞 中 表 达 需 要 有 内 含 子 的 存 在 。 一 般 来 说 ， 在 哺 乳 动 物 细 胞 的 表 达 载 体 中 最 好 有 一 段 内 含 子 序 列 的 剪 接 信 号 ， 以 提 供 外 源 基 因 cDNA表 达 的 需 要 。 常 用 的 内 含 子 剪 接 序 列 有 SV40的 小 t抗 原 的 内 含 子 序 列 等 。 负 调 控 元 件 沉 默 子 和 衰 减 子 是 抑 制 基 因 转 录 的 DNA序 列 , 称 为 负 调 控 元 件 , 它 们 与 反 式 作 用 因 子 相 互 结 合 而 起 作 用 。 这 些 负 调 控 元 件 不 受 距 离 和 方 向 的 限 制 ， 并 可 对 异 源 基 因 表 达 起 作 用 。 终 止 子 和 polyA信 号 真 核 基 因 转 录 的 确 切 终 止 信 号 和 终 止 机 制 , 目 前 尚 不 清 楚 , 终 止 过 程 不 是 在 RNA聚 合 酶 指 导 下 完 成 的 , 在 不 明 机 制 下 发 生 转 录 终 止 。 现 在 已 发 现 模 板 DNA分 子 的 3端 有 转 录 终 止 信 号 序 列 , 称 终 止 子 。 通 常 由 转 录 产 生 的 具 有 polyA尾 的 基 因 终 止 信 号 是 在 多 聚 腺 苷 酸 化 位 点 下 游 的 一 段 长 度 为 数 百 个 碱 基 的 DNA区 域 内 的 G/T簇 , 例 如 在 SV40中 的 AGGTTTTTT的 DNA序 列 为 终 止 转 录 调 控 元 件 。 一 般 转 录 终 止 子 为 发 夹 结 构 的 反 向 重 复 序 列 。 现 在 基 因 工 程 表 达 载 体 上 所 使 用 的 转 录 终 止 子 都 是 病 毒 基 因 或 细 胞 基 因 的 3端 的 一 段 序 列 , 其 中 也 包 括 3端 不 翻 译 区 。 如 SV40小 t抗 原 和 -球 蛋 白 的 转 录 终 止 片 段 常 用 于 构 建 真 核 基 因 表 达 载 体 。 一 般 认 为 polyA的 存 在 增 加 了 mRNA分 子 的 稳 定 性 ,使 之 能 成 功 地 进 行 翻 译 。 准 确 而 有 效 地 进 行 多 聚 腺 苷 酸 化 需 要 两 种 序 列 ： 位 于 polyA位 点 下 游 的 GU丰 富 区 或 U丰 富 区 ; 位 于 polyA位 点 上 游 的 11 30个 核 苷 酸 处 的 一 个 由 6个 核 苷 酸 组 成 的 高 度 保 守 序 列 （ 5-AAUAAA） , 这 些 序 列 与 转 录 后 的 RNA切 割 和 加 尾 有 关 。 最 常 用 的 polyA信 号 是 用 SV40的 一 段 237kb的 BamHI-BcLI酶 切 片 段 , 它 包 含 早 期 和 晚 期 转 录 单 位 的 切 割 和 加 polyA信 号 , 两 套 信 号 分 别 位 于 不 同 的 DNA链 上 , 作 用 方 向 相 反 , 它 们 对 mRNA的 加 工 都 同 样 有 效 。 在 双 启 动 子 的 表 达 载 体 中 ， 启 动 子 的 转 录 方 向 为 同 向 时 ， 上 游 启 动 的 转 录 由 于 会 穿 过 下 游 启 动 子 ， 这 样 就 使 得 下 游 的 转 录 受 到 极 大 的 影 响 ， 造 成 下 游 转 录 水 平 的 下 降 ， 但 是 如 果 在 两 个 启 动 子 间 插 入 一 个 转 录 终 止 子 后 ， 上 游 启 动 子 对 下 游 启 动 子 的 影 响 就 被 消 除 了 ， 这 样 下 游 启 动 子 的 表 达 量 会 有 明 显 提 高 。 当 两 个 启 动 转 录 方 向 相 反 时 ， 基 因 表 达 可 能 会 被 转 录 形 成 的 反 义 RNA所 抑 制 , 这 时 插 入 转 录 终 止 子 将 会 消 除 这 种 抑 制 作 用 。4 . 基 因 工 程 疫 苗 研 究 开 发 应 遵 循 的 原 则 是 什 么 ？ （ 8分 ） 答 ： (1)不 能 或 难 于 培 养 的 的 病 原 体 如 乙 型 肝 炎 病 毒 (HBV)， 丙 型 肝 炎 病 毒 (HCV)， 戊 型 肝 炎 病 毒 (HEV)， EB病 毒 (Epstein-Barr病 毒 ， EBV)， 巨 细 胞 病 毒 (CMV)， 人 乳 头 瘤 病 毒 (HPV)， 麻 风 杆 菌 ， 疾 原 虫 、 血 吸 虫 等 。 (2)有 潜 在 致 癌 性 或 免 疫 病 理 作 用 的 病 原 体 ， 前 者 如 1型 嗜 人 T淋 巴 细 胞 病 毒 (HTLV-I)， 人 免 疫 缺 损 病 毒 (HIV),单 纯 疱 疹 病 毒 (HSV)， 还 有 EBV、 CMV、 HPV等 。 后 者 如 呼 吸 道 合 胞 病 毒 (RSV),登 革 热 病 毒 (DGV)， 肾 综 合 征 出 血 热 病 毒 (HFRSV)； (3)常 规 疫 苗 免 疫 效 果 差 ， 如 霍 乱 和 痢 疾 菌 苗 ； 或 者 反 应 大 ， 如 百 日 咳 和 伤 寒 菌 苗 。(4)能 大 大 节 约 成 本 ， 简 化 免 疫 程 序 的 多 价 疫 苗 ， 如 以 痘 苗 病 毒 ， 腺 病 毒 ， 卡 介 苗 或 沙 门 氏 菌 为 载 体 的 多 价 活 疫 菌 ；5 . 有 哪 几 种 反 义 核 苷 酸 基 因 失 活 疗 法 ？ 简 述 其 原 理 。 （ 9分 ） 答 ： （ 1 ） 将 特 异 的 反 义 基 因 重 组 到 表 达 载 体 上 （ 病 态 载 体 或 质 粒 ） ， 导 入 靶 细 胞 中 转 录 出 反 义 RNA， 形 成 双 链 RNA（ RNA/RNA双 链 体 ） ， 阻 碍 基 因 的 翻 译 。 （ 2 ） 人 工 合 成 寡 聚 脱 氧 核 糖 核 酸 （ ODN） 经 过 化 学 修 饰 导 入 细 胞 ， 与 mRNA和 DNA结 合 ， 形 成 RNA/DNA杂 链 或 DNA核 苷 酸 三 聚 体 ， 影 响 基 因 的 翻 译 或 转 录 。 （ 3 ） 特 异 性 的 核 酶 ， 根 据 癌 基 因 设 计 出 特 异 的 “ 锤 头 ” 或 “ 发 夹 ” 结 构 ， 它 能 够 催 化 切 割 ， 降 解 异 常 表 达 基 因 的 mRNA而 影 响 基 因 的 翻 译 。 分 子 诊 断 学 试 卷 B二 、 选 择 题 （ 每 题 1分 ， 共 15分 ; 请 将 答 案 填 写 在 答 题 纸 上 ） 1 . 限 制 性 核 酸 内 切 酶 是 由 细 菌 产 生 的 ， 其 生 理 意 义 是 ( )。A.修 复 自 身 的 遗 传 缺 陷 B.促 进 自 身 的 基 因 重 组 C.强 化 自 身 的 核 酸 代 谢 D.提 高 自 身 的 防 御 能 力2 . 生 物 工 程 的 下 游 技 术 是 ( )。 A.基 因 工 程 及 分 离 工 程 B. 蛋 白 质 工 程 及 发 酵 工 程C.基 因 工 程 及 蛋 白 质 工 程 D.分 离 工 程 及 蛋 白 质 工 程 3 . 基 因 工 程 操 作 常 用 的 酶 是 :(I 内 切 酶 II 连 接 酶 III 末 端 转 移 酶 IV聚 合 酶 ()。 A. I + II B. I + III + IV C. II + III + IV D. I +II + IV + III4 . 限 制 性 内 切 核 酸 酶 的 星 活 性 是 指 ( )。 A. 在 非 常 规 条 件 下 ， 识 别 和 切 割 序 列 也 不 发 生 变 化 的 活 性 。B. 活 性 大 大 提 高 C. 切 割 速 度 大 大 加 快D.识 别 序 列 与 原 来 的 完 全 不 同 5 . 下 列 五 个 DNA 片 段 中 含 有 回 文 结 构 的 是 ( )。A. GAAACTGCTTTGAC B. GAAACTGGAAACTG C. GAAACTGGTCAAAG D. GAAACTGCAGTTTC6 . 关 于 cDNA的 不 正 确 的 提 法 是 ( )。 A.同 mRNA互 补 的 单 链 RNAB.同 mRNA互 补 的 含 有 内 含 子 的 DNA C.以 mRNA为 模 板 合 成 的 双 链 RNAD.以 上 都 不 正 确 7 . 下 列 有 关 连 接 反 应 的 叙 述 ， 错 误 的 是 ( )。A. 连 接 反 应 的 最 佳 温 度 为 3 7 B. 连 接 反 应 缓 冲 体 系 的 甘 油 浓 度 应 低 于 1 0 %C. 连 接 反 应 缓 冲 体 系 的 ATP 浓 度 不 能 高 于 1 mM D. 连 接 酶 通 常 应 过 量 2 -5 倍8 . T 4 -DNA 连 接 酶 是 通 过 形 成 磷 酸 二 酯 键 将 两 段 DNA 片 段 连 接 在 一起 ， 其 底 物 的 关 键 基 团 是 ( )。 A. 2 -OH 和 5 P B. 2 -OH 和 3 -PC. 3 -OH 和 5 P D. 5 -OH 和 3 -P 9 . 载 体 的 功 能 是 ( )。A. 外 源 基 因 进 入 受 体 的 搭 载 工 具 B. 不 能 为 外 源 基 因 提 供 整 合 能 力C. 不 能 提 供 复 制 能 力 D. 不 能 为 外 源 基 因 提 供 表 达 能 力1 0 . 黏 性 末 端 连 接 法 ， 不 仅 操 作 方 便 ， 而 且 ( )。 A.产 生 新 切 点 B.易 于 回 收 外 源 片 段C.载 体 不 易 环 化 D.影 响 外 源 基 因 的 表 达 1 1 . 下 列 哪 种 克 隆 载 体 对 外 源 DNA的 容 载 量 最 大 ? ( )A.质 粒 B.黏 粒 C.酵 母 人 工 染 色 体 (YAC) D. 噬 菌 体 1 2 . 考 斯 质 粒 （ co smid ） 是 一 种 ( )。 A.容 量 最 大 一 种 载 体 B.由 -DNA 的 co s 区 与 一 质 粒 重 组 而 成 的 载 体C.是 一 种 单 链 DNA环 状 载 体 D.不 能 在 受 体 细 胞 内 复 制 ， 但 可 以 表 达 1 3 . 1 3 ( )某 一 重 组 DNA 的 载 体 部 分 有 两 个 BamHI 酶 切 位 点 。 用 BamHI酶 切 后 凝 胶 电 泳 上 出 现 四 条 长 度 不 同 的 带 子 ， 其 长 度 总 和 与 已 知 数 据 吻 合 ， 该 重 组 分 子 插 入 片 段 上 的 BamHI 酶 切 位 点 共 有 ( )。A.4 个 B. 3 个 C. 1 个 D. 2 个 1 4 . 下 列 哪 一 种 酶 作 用 时 需 要 引 物 ? ( )A.限 制 酶 B.末 端 转 移 酶 C.反 转 录 酶 D. DNA连 接 酶 1 5 . 用 下 列 方 法 进 行 重 组 体 的 筛 选 ， 只 有 ( )说 明 外 源 基 因 进 行 了 表 达 。A.So u th em印 迹 杂 交 B.No rth em印 迹 杂 交 C.Western 印 迹 D.原 位 菌 落 杂 交三 、 简 答 题 （ 每 题 5分 ， 共 25分 ; 请 将 答 案 填 写 在 答 题 纸 上 ） 1 . 什 么 是 包 涵 体 ？2 . 什 么 是 -互 补 筛 选 ？ 3 . 简 述 酶 切 反 应 体 系 及 反 应 条 件 ？4 . 核 酸 操 作 的 基 本 技 术 有 哪 些 ？ 5 . 基 因 工 程 诞 生 的 理 论 基 础 是 什 么 ？四 、 论 述 题 （ 每 题 10分 ， 共 40分 ; 请 将 答 案 填 写 在 答 题 纸 上 ） 1 . 如 何 有 效 地 提 高 外 源 基 因 的 表 达 效 率 ？2 . 试 述 载 体 构 建 一 般 方 法 。 3 . 试 述 5 RACE技 术 原 理 和 方 法4. 大 肠 杆 菌 作 为 基 因 工 程 受 体 菌 的 优 缺 点 是 什 么 ？ 答 案 -试 卷 B一 、 名 词 解 释 （ 每 题 2 分 ， 共 2 0 分 ） 1 . 转 化 ： 严 格 地 说 是 指 感 受 态 的 大 肠 杆 菌 细 胞 捕 获 和 表 达 质 粒 载体 DNA分 子 的 生 命 过 程 2 . 质 粒 不 亲 和 性 ： 在 没 有 选 择 压 力 的 情 况 下 ， 两 种 不 同 质 粒 不 能 够 在 同 一 宿 主 细 胞 系 中 稳 定 地 共 存 的 现 象 。3 . cDNA文 库 ： 是 指 某 生 物 某 一 发 育 时 期 所 转 录 形 成 的 cDNA片 段 与 某 种 载 体 连 接 而 成 的 克 隆 的 集 合 。4 . RACE： 是 一 种 通 过 PCR进 行 cDNA末 端 快 速 克 隆 的 技 术 ， 是 以 mRNA 为 模 板 反 转 录 成 cDNA第 一 链 后 用 PCR技 术 扩 增 出 某 个 特 异 位 点 到 3 ，或 5 ， 端 之 间 未 知 序 列 的 方 法 。 5 . 基 因 文 库 ： 通 过 克 隆 方 法 保 存 在 适 当 宿 主 中 的 某 种 生 物 ， 组 织 ， 器 官或 细 胞 类 型 的 所 有 DNA片 段 而 构 成 的 克 隆 集 合 体 。 6 . RT-PCR:先 用 逆 转 录 酶 作 用 于 mRNA， 以 寡 聚 d T为 引 物 合 成 cDNA第一 链 ， 然 后 用 已 知 一 对 引 物 ， 扩 增 嵌 合 分 子 ， 这 种 方 法 称 为 逆 转 录 PCR。7 . 载 体 ： 指 基 因 工 程 中 携 带 外 源 基 因 进 入 受 体 细 胞 的 运 载 工 具 ， 它 的 本 质 是 DNA复 制 子 。8 .S-D序 列 ： 在 大 肠 杆 菌 mRNA的 核 糖 体 结 合 位 点 上 ， 含 有 一 个 转 译 起 始 密 码 子 及 同 1 6 S核 糖 体 RNA 3 ， 末 端 碱 基 互 补 的 序 列 ， 该 序 列 最 初由 Sh in e 、 Dalg arn o 发 现 ， 故 后 来 命 名 为 Sh in e-Dalg arn o 序 列 ， 简 称 S- D序 列 。9 . 穿 梭 质 粒 载 体 ： 指 一 类 由 人 工 构 建 的 具 有 两 种 不 同 复 制 起 点 的 选 择 标 记 ， 因 而 可 在 两 种 不 同 宿 主 细 胞 中 存 活 和 复 制 的 质 粒 载 体 。1 0 .MCS： 指 载 体 上 人 工 合 成 的 含 有 紧 密 排 列 的 多 种 限 制 核 酸 内 切 酶 的 酶 切 位 点 的 DNA片 段 。二 、 选 择 题 （ 每 题 1 分 ， 共 1 5 分 ） 题号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2 1 3 1 4 1 5 答案 D A A D D C A C D C C B D C C 三 、 简 答 题 （ 共 2 5 分 ， 每 题 5 分 ）1 . 什 么 是 包 涵 体 ？ 答 ： 重 组 蛋 白 在 胞 内 表 达 时 ， 常 常 以 不 溶 性 蛋 白 聚 集 成 的 晶 状 物 形式 存 在 ， 这 种 晶 状 体 即 包 涵 体 。 包 涵 体 的 形 成 是 外 源 蛋 白 的 高 效 表 达 时 的 普 遍 现 象 ， 这 是 由 于 肽 链 折 叠 过 程 中 部 分 折 叠 的 中 间 态 发 生 了 错误 聚 合 ， 而 不 是 形 成 成 熟 的 天 然 态 或 完 全 解 链 的 蛋 白 。 2 . 什 么 是 -互 补 筛 选 ？答 ： 质 粒 载 体 具 有 -半 乳 糖 苷 酶 基 因 （ lacZ） ， 当 外 源 DNA插 入 到 它 的 lacZ， 可 造 成 表 达 后 的 -半 乳 糖 苷 酶 失 活 ， 利 用 这 一 点 就 可 以 通过 大 肠 杆 菌 转 化 子 菌 落 在 添 加 有 X-gal-IPTG培 养 基 中 的 颜 色 变 化 鉴 别 出 重 组 子 和 非 重 组 子 。 有 些 大 肠 杆 菌 上 带 有 lacZ基 因 的 部 分 编 码 序 列 ， 质粒 载 体 中 含 有 别 一 部 分 编 码 序 列 ， 当 质 粒 转 入 载 体 后 ， 可 形 成 具 有 酶 活 性 的 蛋 白 质 。 这 种 lacZ基 因 上 缺 失 了 一 部 分 编 码 序 列 的 突 变 体 与 带 有 这一 部 分 编 码 序 列 的 突 变 体 之 间 实 现 互 补 的 现 象 叫 互 补 。 3 . 限 制 性 核 酸 内 切 酶 的 活 性 受 哪 些 因 素 影 响 ？答 ： 酶 的 纯 度 。 DNA样 品 的 纯 度 。 DNA的 甲 基 化 程 度 。 酶 切 反 应 的 温 度 与 时 间 。 DNA分 子 的 构 型 。 限 制 性 核 酸 内 切 酶 的 反 应 缓 冲 液 。4 . 核 酸 操 作 的 基 本 技 术 有 哪 些 ？ 答 ： 核 酸 提 取 与 纯 化 核 酸 的 检 测 与 保 存 核 酸 的 凝 胶 电 泳 核酸 分 子 杂 交 5 .基 因 工 程 诞 生 的 理 论 基 础 是 什 么 ？答 ： 是 现 代 分 子 生 物 学 领 域 理 论 上 的 三 大 发 现 和 技 术 上 的 三 大 发 明 。 理