本科生六个基本生物学实验

实验一：感受态细胞的制备 1. 原理： 当实验室获得了一个新的质粒时，而这个质粒并未转化到宿主菌体内，则 需要该技术进行细菌的转化，以大量获得这一质粒。转化细菌的方式有很多种， 如电转化法、脂质体转染法、显微注射法、CaCl 2 处理法制备感受态细胞等。一 般的实验室都应用 CaCl2 处理细菌，改变细胞膜的结构，使质粒 DNA 能穿过细 菌细胞膜进入细胞。然后在选择培养基中培养转化处理过的细菌，转化成功的 细菌可在抗菌素培养基上生长形成菌落。这一方法是分子生物学常用实验方法。 2. 实验材料 2.1 LB 液体培养基 2.2 0.1mol/L CaCl2 溶液：称取 1.1g 无水 CaCl2，溶于 90ml 双蒸去离子水 中，定容至 100ml，用 0.22m 滤器过滤并装入灭菌试剂瓶中，4保存。 2.3 DH5 菌株，冰，牙签，无菌滤纸，50ml 离心管，枪头（以上需灭菌） ； 移液器，摇床，冷冻离心机，涡旋震荡器，恒温摇床，恒温培养箱，超净 工作台，普通冰箱，-70冰箱 3. 操作方法 3.1 从 37培养 1216h 的平板上，用无菌牙签挑取一个单菌落，转移到 含有 3ml LB 培养基的试管内，37振摇过夜。次日取菌液 1ml，接种到含有 100ml LB 培养基的 500 ml 烧瓶中，37剧烈振摇培养约 23h（振摇速度为 200300r/min） ，待 OD600 值达到 0.30.4 时，将烧瓶取出立即置冰浴 10 15min。 3.2 自该步骤起皆需无菌操作。在无菌条件下将细菌转移到一个灭菌处理 过的、冰预冷的 50 ml 离心管中。 3.3 4离心，4000g5min 回收细胞。 3.4 弃去培养液，将离心管倒置于滤纸上 1min，以使最后残留的培养液流 尽。 3.5 加入冰预冷的 0.1mol/L CaCl2 溶液 10ml 重悬菌体，置冰浴 30min。 3.6 4离心，4000g5min,弃去上清液，倒置于滤纸 1min。 3.7 再加 4ml 用冰预冷的 0.1mol CaCl2 重悬菌体（重悬时操作要轻） 。 3.8 置 4冰箱置 1224h，即可应用于转化。 思考题： 制备感受态细胞时加入 CaCl2 的作用是什么？ 钙离子结合于细胞膜上，使细胞膜呈现一种液晶态。在冷热变化刺激下液 晶态的细胞膜表面会产生裂隙，细胞膜的通透性发生变化，使外源 DNA 进入。 实验二 质粒转化 1. 原理 当宿主菌接受 CaCl2 处理后，细胞膜通透性改变，感染细 菌的质粒很容易地透过细胞膜，在宿主菌酶系统的作用下，质 粒大量繁殖。通过进一步实验，可获得大量的质粒 DNA，以供 分子生物学实验所用。一般的实验室都应用 CaCl2 处理细菌。 2. 实验材料 2.1，质粒 GFP-SNAT2-pBK-CMV （kan 抗性） 2.2，LB 固体培养基平板 (kan 抗性) ，LB 液体培养基 2.3，感受态细胞 2.4， 1.5ml 离心管，枪头，三角耙（以上物品需灭菌处理） ；移液器， 冰，恒温水浴锅，恒温摇床，恒温培养箱，超净工作台，-70冰箱 3. 操作方法 3.1 无菌状态下取新鲜感受态 50l 置于无菌的 1.5ml 离心管。 3.2 每管加质粒 50100ng，轻轻旋转以混合内容物，在冰上放置 30min。 3.3 42热休克 90s，不要摇动离心管。 3.4 每管加无抗生素的普通 LB 培养基 950l，37(150180r/min) 摇 床，温和摇振 45min。 3.5 用无菌弯头玻璃铺菌器（三角耙） ，将 10l 菌液铺于含卡那青霉素 (Kan)的琼脂平板表面，37 平放 20min，然后倒置培养 1014h。 4.结果观察 计数全皿菌落数 5.写实验报告（详细描述转化菌落的生长情况） 6.思考题 请说明每一步骤的原理：冰上 30 分钟、42 度热休克 90 秒、37 度温和震 荡 45 分钟等。 冰上 30 分钟：转化混合物中的 DNA 形成抗 DNA 酶的羟基-钙磷酸复合 物粘附于细胞表面。 42 度热休克 90 秒：42 度短暂的热刺激，细胞膜的液晶结构会发生剧烈扰 动，并随即出现许多间隙，促进细胞吸收 DNA 复合物。 37 度温和震荡 45 分钟：促使在转化过程中获得新的表型得到表达 实验三 质粒 DNA 的抽提和纯化 1.原理： 质粒为多数细菌和某些真核生物染色体的双链环状分子。一般情况下，质 粒并不是它的宿主细胞所必需的，如细胞分裂时，分裂的子细胞中不含质粒， 但子细胞仍能生长分裂。然而，许多质粒含有在特殊环境下所必需的抗生素抗 性。尽管质粒的复制有赖于宿主细胞的酶系统进行，但质粒 DNA 是独立于宿 主基因组以外的环状分子，对于碱的裂解具有较强的耐受性，因此，用碱裂解 法可将质粒 DNA 与宿主的线性 DNA 分开。 2 材料 2.1 质粒 DNA 小抽试剂盒，乙醇 2.2 含质粒的菌液（GFP-SNAT2-pBK-CMV ） 2.3 离心管，枪头（以上物品需灭菌） ；移液器，离心机 3步骤 见试剂盒说明书 实验四 琼脂糖凝胶电泳 1. 原理： 带电物质在电场中向相反电极移动的现象称为电泳(electrophoresis) 。各种 生物大分子在一定的 pH 值条件下，可解离成带电荷的离子，在电场中向相反 的电极移动。分子生物学领域中，琼脂糖和聚丙烯酰胺作为支持介质的凝胶电 泳应用最多，它们是分离、鉴定和纯化 DNA 及 RNA 片段的主要方法。该方法 操作简便、快速，可以分辨其它方法(如梯密度离心法)所无法分离的片段。直 接嵌入荧光染料后，在紫外灯下可直接检出 DNA 片段所在的位置，如有必要， 从凝胶中回收 DNA 片段，用于各种克隆操作。 琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶均可制成各种不同大小、形状和孔径的凝胶块， 在不同的装置上进行电泳。琼脂糖比聚丙烯酰胺凝胶的分辨率低，但其分离范 围广，约 200bp50kb 的 DNA。琼脂糖凝胶电泳通常在水平装置上进行。聚丙 烯酰胺分离小片段(5500bp) 的效果较好，甚至可以分辨相差 1bp 的 DNA 片段。 长度大于 10 000kb 的 DNA 片段，可以通过电场方向呈周期性变化，在脉冲电 场胶中进行电泳。 2.琼脂糖凝胶的性质： 琼脂糖是从海澡中提取的长链状多聚物，琼脂糖凝胶点为 4045。当加 热至 90左右时，即可成清亮、透明的液体，浇在模具上冷却后固化形成凝胶， 琼脂糖凝胶可区分相差 100bp 的 DNA 片段。为了满足特殊的要求，可选择低 溶点琼脂糖(70,低于双链 DNA 的变性温度)。 3 材料 3.1 琼脂糖，10mg/ml 溴化乙锭，1kb DNAmarker 3.2 100ml 50TAE 缓冲液： Tris 24.2g,冰乙酸 5.71ml，0.5mol/L EDTA(PH6.8) 10ml 3.3 6上样缓冲液： 0.25%溴酚蓝、0.25% 二甲苯青 FF、30%甘油 3.4 枪头，移液器，锥形瓶，微波炉，制胶槽，梳子，水平电泳仪，稳压器， 凝胶成像系统 4 操作步骤： 4.1 将胶模槽放于水平工作台上。 4.2 用电泳缓冲液在微波炉中将琼脂糖颗粒用最短的时间完全溶解。熔化 琼脂糖溶液冷却至 60 度时，加入浓度为 0.5g/ml 溴化乙锭 10ul，充分混匀。 4.3 在胶模放置好梳子后，将具有一定温度的凝胶倒入胶模中，凝胶的厚 度在 3-5mm 之间。注胶时要避免产生气泡，若有气泡可用吸管小心吸去。 4.4 凝胶凝固后通常需要在室温中放置 3045min，小心移去梳子，并将 凝胶托盘放入电泳槽。可同时制作几块凝胶，待其固化后用保鲜纸包住以防水 分挥发，置 4 度保存，通常在数日之内可以使用。 4.5 加入电泳缓冲液，使液面高出凝胶表面 12mm，样品孔内有气泡，用 吸管小心吸去，以免影响加样。 4.6 将样品与上样缓冲液混合：上样缓冲液不仅能提高样品的密度，使样 品均匀沉到孔底，还可使样品带色，便于上样、估计电泳时间和判断电泳位置。 4.7 用微量移液器将样品依次加在样品孔内。 4.8 盖上电泳槽并通电，5V/cm 2,恒压电泳，使 DNA 向阳极方向移动。 4.9 电泳完成后切断电源，取出凝胶。如果凝胶中加有溴化乙锭，可直接 在紫外透射灯下观察，否则就将凝胶浸泡在 0.5 微克/ml 溴化乙锭缓冲液中浸泡 3045min。 4.10 用凝胶分析系统直接观察并拍照。 5. 注意事项： 5.1 加热溶解琼脂糖时应不断地摇动容器，并可对着光线肉眼检查凝胶溶 解情况，使附着在壁上的颗粒完全溶解。 5.2 在微波炉上加热时间不要过长，以免引起暴沸。如蒸发过多的溶液， 应补充部分缓冲液。 5.3 气温较高或用低熔点、低浓度（小于 0.5%）琼脂糖制胶、倒胶和电泳 时，最好在 4进行。 6. 结果观察 6.1 仔细观察 DNA 泳动的方向。 6.2 DNA 电泳结束后，记录正常组与 marker 组电泳条带的相应位置。 7.书写实验报告 实验五 DNA 限制内切酶技术 1. 原理： 限制性内切酶（即限制性核酸内切酶，简称限制酶或内切酶）是一类能识 别双链分子中特异核酸序列的水解酶，这类酶的发现和应用，促进了基因工程 和 DNA 序列测定以及基因诊断技术的发展。它的应用是当代分子生物学研究 最基本、最重要的技术手段。 从质粒、噬菌体或粘性质粒获得的含有目的基因重组分子，必须经过酶切、 电泳分离、回收基因片断，方可用于重组或探针标记。根据酶切的目的不同， 可采用小量酶切或大量酶切反应两种体系。 2实验材料 2.1 质粒 SNAT1-PBK-CMV(600ng/ul，150ul) 2.2 限制性内切酶 EcoRI 2.3 1kb DNAmarker 2.4 离心管，枪头，移液器，离心机，恒温水浴锅，琼脂糖凝胶电泳所需材 料 3.小量酶切反应体系 本实验主要应用于质粒的酶切鉴定。典型的反应是 20l 体积中含 0.2 1gDNA，酶切反应体系如下： 质粒 DNA 5l 10缓冲液 1l 限制酶（根据质粒酶切位点选择） 1l 双蒸去离子水 3l 总体积 10l 4.操作方法 4.1 在一灭菌的新的 Ep 管中加入 3l 双蒸水。 4.2 加入 10缓冲液 1l。 4.3 加限制酶 1l。 4.4 最后加入质粒 DNA 5l。 4.5 稍离心，混合。 4.6 37水浴 11.5h。 4.7 取出后电泳分析鉴定是否酶解。 5.注意事项 5.1 双蒸水为可变体积，当其他反应成分的量确定后，用双蒸水将反应体 积补足。 5.2 质粒 DNA 最后加入，以防止操作不当引起试剂的污染。 5.3 为保持限制酶的活性，将酶从低温冰箱取出后立即置于预先准备的碎 冰中冰浴，操作应迅速，用后立即放回低温冰箱中。 5.4 大多数酶多以浓缩液存放，吸取时需严格取量。若要取用多种酶，每 种酶必须单独使用吸头，避免交叉污染。 5.5 大多数限制酶均加 50%甘油缓冲液置于-20保存，其活力稳定，但在 配制反应混合物时，酶的加入量要准确限制小于体积的 1/10，否则甘油会抑制 酶解反应。 5.6 如欲节省酶的用量，可增加酶解时间，但酶解时间过长，易出现异常 条带。 5.7 当样品加入反应管之后，必须将装酶试管盖盖严，避免温育时水蒸汽 进入管内。 6. 结果观察 6.1 DNA 分子中分布的酶切位点的多少与酶解后条带呈正比。仔细观察 条带数量。 6.2. 与 Marker 对照，观察各条带中的 bp 数。 6.3. 书写实验记录并画图记录各条带的位置。 实验六 PCR 技术 1. 原理： PCR 技术实际上是一个在模板 DNA、引物和四种脱氧核苷酸等存在的情况 下，DNA 聚合酶依赖的酶促反应，扩增的特异性取决于引物与模板 DNA 的特 异结合。整个扩增过程分为三步：变性：加热使模板 DNA 双链间的氢键断 裂而形成两条单链；退火：突然降温后，模板 DNA 与引物按碱基配对的原 则互补结合。也存在 2 链之间的结合，但由于引物的高浓度、结构简单等特点， 主要结合发生在模板与引物之间；延伸：在 DNA 聚合酶及镁离子存在时， 从引物的 3端开始、结合单核苷酸，形成与模板互补的新的 DNA 链。上述三 步为一个循环，理论上讲，每经过一个循环，样本中的 DNA 量应该增加一倍， 新形成的链又可成为下一轮模板链循环的模板， 经过 25-30 个循环后 DNA 可 扩增 106-109 倍。 2.操作方法 针对本次实验的实验材料，体系和条件如下： PCR 产物约 800bp （一） 材料： 2Taq 聚合酶：康为世纪 模板：GFP-SNAT2-pBK-CMV （56ng/ul） 上游引物：12.5uM，35ul （5 ， - 3， CGTAATATTAGCGCGCATGTGATCGCGCTTCTCGTTGGG） 下游引物：12.5uM，35ul （5 ， - 3， CGTACATATGCGCGCCACTTTATGCTTCCGGCTCGTATG） （二）10ul 体系： ddH2O： 2.36ul 2Taq 聚合酶： 5ul 上游引物： 0.67