猪O型口蹄疫新型基因工程疫苗毒株的构建论文33514.doc

猪o型口蹄疫新型基因工程疫苗毒株的构建目 录摘 要iii关键词iiiabstractiiikey wordsiii英文缩略词表iv1前言11.1口蹄疫的基本特征11.1.1口蹄疫病毒基本概念11.1.2口蹄疫病毒生物学特征11.1.3口蹄疫病毒危害11.2泛素蛋白及其对抗原的影响21.3 sirna干扰机制31.4 干扰素与口蹄疫免疫41.5 fmd疫苗研究进展51.6本实验研究的目的与意义62实验材料62.1菌种、毒株、载体与质粒62.2主要药品与试剂62.3主要培养基及配制72.4缓冲液及其配制72.5其他溶液72.5空斑筛选与纯化相关试剂82.6寡核苷酸引物83实验方法83.1转移载体piecmvubip1p1sififn的构建策略83.1.1限制性内切酶酶切反应93.1.2酶切产物的琼脂糖凝胶电泳检测93.1.3酶切产物的回收93.1.4回收产物的去磷酸化反应93.1.5目的基因与载体的酶连反应93.2 感受态细胞的制备、质粒的转化、质粒制备与纯化103.2.1大肠杆菌感受态细胞的制备（氯化钙法）103.2.2质粒的转化103.2.3质粒的小量制备（omega试剂盒）103.2.4质粒的大量制备（omega试剂盒）113.2.5阳性质粒的酶切鉴定113.3以prv为载体表达fmdv抗原蛋白基因p1，泛素蛋白与抗原p1的融合基因ubi- p1，rna干扰基因shrna，干扰素基因ifn-的重组病毒的构建123.3.1细胞的培养、冻存与复苏123.3.2 prv tk-/ge-/lacz+基因组dna的提取123.3.3脂质体介导的共转染133.3.4重组病毒空斑纯化和pcr鉴定133.3.5鉴定用pcr模板处理143.3.6重组病毒pcr鉴定144结果与分析154.1转移质粒piecmvubip1的构建154.2转移质粒piecmvubip1p1的构建154.3转移质粒piecmvubip1p1sififn的构建164.4共转染产物接毒第三代pcr鉴定174.5重组病毒的空斑纯化及pcr鉴定184.5.1空斑的形成184.5.2在pk-15细胞上的第一轮空斑筛选194.5.3在vero细胞上的第一轮空斑筛选204.5.4 重组病毒的空斑筛选结果205讨论205.1 载体的构建205.2 细胞的传代培养215.3 空斑筛选实验215.3.1 空斑筛选细胞的选择215.3.2 rna干扰对空斑筛选结果的影响225.3.3干扰素对空斑筛选结果的影响22参考文献：22致 谢24猪o型口蹄疫新型基因工程疫苗毒株的构建the construction of recombinat virus for generating a novel genetic engineering vaccine agansit o type fmdv of pig摘 要口蹄疫是一种急性、高度传染性的病毒性传染病，虽自20世纪初口蹄疫疫苗已经在世界部分地区应用，但目前全球口蹄疫疫情依然严重，也构成了世界动物及动物产品贸易的障碍。由本实验室构建的猪伪狂犬病毒基因缺失株prv tk-/ge-/lacz+作为一种病毒载体，具有安全性好、容量大、重组效率高等优点，本研究用人工合成的o型口蹄疫p1基因作为抗原基因，用和泛素（ub）融合的ubip1作为另一个抗原基因同时达到增强细胞免疫效果，再将针对口蹄疫3b基因设计的shrna和具有抗病毒及免疫调节效果的猪ifn-与以上两个功能基因串联，构建了具有四个功能基因的转移载体，将此转移载体和prv缺失株tk-/ge-/lacz+共转染细胞，发生基因重组后进行了空斑纯化，经鉴定，初步得到了含有p1基因、ubip1、shrna、ifn-四个功能基因的重组伪狂犬病毒，为进一步构建新型基因工程疫苗打下基础。关键词：抗原基因；泛素蛋白基因；干扰素基因；重组病毒abstractfoot and mouth disease (fmd) is an acute, highly contagious virul infection disease. although vaccines, available since the early 1900s, have been used in parts of the world, the disease still is a serious globe outbtreak and become sanitary barrier to the commerce of animals and animal products. the vector virus prv tk-/ge-/lacz+ , constructed by our laboratory , has the advantages of safety, high capacity, high restructuring efficiency. 朗读显示对应的拉丁字符的拼音this study we selecte synthetic o type fmdv p1 gene as antigen gene, p1 and ubiquitin (ub) fusion gene ubip1 as another antigen gene to enhance cellular immune effect. then use shrna designed for 3b gene of fmd, ifn- gene of porcine has anti-viral and immunomodulatory effects tandem with the above two function gene, constructed transfer vector with four functional gene. making the transfer vector and the prvtk-/ge-/lacz+ cotransfected in cells. after the occurrence of recombinant, plaques were purified, identified, initially received recombinant pseudorabies virus with four functional genes of p1 gene, ubip1, shrna and ifn-, in order to further build a new foundation for the construction of genetic engineering vaccine.key words：antigen gene; ubiquitin; interferon gene; recombinant virus 英文缩略词表abbreviation缩写英文名称中文名称fmdfmdvubupsrnaisirnashrnasififnprvncsamp dmem lb pbs pcr sdsebodedtapkverodmsomemfoot-and-month diseasefoot-and-mouth disease virusubiquitin ubiquitin-proteasome systemrna interferencerna interference generna interference geneinterference gene fragment-interferon genepseudorabies virusnewborn calf serumamplicillumdulbeccos modified eagle mediumluria-bertani medium phosphate buffer solutionpolymerase chain reactionsodium dodecylsulphateethidium bromideoptical densityedta disodium saltpig kidney cellsafrican green monkey kidney cellsdimethyl sulfoxideminimal essential medium 口蹄疫口蹄疫病毒泛素泛素蛋白酶系统小rna干扰小rna干扰基因小rna干扰基因干扰基因区段干扰素基因伪狂犬病病毒新生牛血清氨苄青霉素改良eagle培养基lb培养基磷酸盐缓冲液聚合酶链式反应十二烷基磺酸钠溴化乙锭光密度乙二胺四乙酸猪肾细胞非洲绿猴肾细胞二甲基亚砜微小型培养基iii1前言1.1口蹄疫的基本特征1.1.1口蹄疫病毒基本概念口蹄疫(foot-and-month disease, fmd)是由口蹄疫病毒（foot and mouth disease virus, fmdv）感染引起的人畜共患的急性、烈性传染病，该病全世界分布广泛，主要感染偶蹄类，一旦爆发常造成巨大的经济损失。由于存在制作灭活苗灭活不彻底和毒力返强造成的潜在危险，开发新型基因工程疫苗已引起人们的重视。1.1.2口蹄疫病毒生物学特征口蹄疫病毒呈球形，正二十面体结构，直径20-25nm;无囊膜，对酸碱敏感，口蹄疫病毒粒子由衣壳和病毒核酸构成，衣壳由60个不对称的亚单位组成，每个亚单位含一分子的vp1、vp2、vp3和vp4，其中vp4位于病毒颗粒内部。fmdv属于小rna病毒科，口蹄疫病毒属，有7个血清型，即o，a，c，sat 1, sat 2, sat 3和asia型(rodriguez and grubman, 2009)，各个血清型间无交叉反应（陆承平等，2005），病毒的这种特性，给其检疫、防疫带来极大的困难。fmdv基因组为具有感染性的单股正链rna，大小约8.5kb，只有一个开放的读码框(open reading frame, orf)，两侧各有一个非编码区(non coding region, ncr)。开放读码框首先翻译为一个多聚蛋白，经过蛋白酶切割为成熟的结构和非结构蛋白以及一些中间体。fmdv基因组p1区编码结构蛋白，p12a前体物在3c蛋白酶作用下形成由vp4-vp2，vp3和vp1组成的原体。5个原体组成一个五聚体，十二个五聚体组装成包含rna的前病毒粒子或者缺乏rna的空衣壳。在感染细胞中，fmdv 3c蛋白酶基因编码的蛋白能催化加工p12a前体衣壳蛋白为vp0、vp1、vp3，这三种蛋白能相互作用形成5s原体，成为病毒粒子结构的组件，形成病毒样颗粒，这种没有病毒核酸的病毒样颗粒具有与全病毒相同的免疫原性。1.1.3口蹄疫病毒危害fmdv主要感染偶蹄类物种如猪、牛、绵羊、山羊、水牛等，许多野生偶蹄类物种也可能容易受到感染，其中骆驼被证明对口蹄疫是易感的(larska et al, 2009)。因感染口蹄疫而患病动物的口、舌、唇、蹄、乳房等部位发生水泡，破溃、形成烂斑。口蹄疫发病率几乎达100%，该病一旦暴发，能迅速演变为生物灾害，直接受到重大甚至于毁灭性打击的是畜牧业及其相关产业。为了控制病情的蔓延，一般采取的措施是直接将大批动物扑杀销毁，这样的措施不仅不能从根本上解决疫情往往还会引发严重的公共卫生问题，造成社会的恐慌。口蹄疫爆发的破坏力还会波及到其它行业，如对外出口被迫关闭，疫区被严密封锁，旅游受阻等，如去年4月份韩国爆发的fmd呈全国蔓延状态，让韩国防疫当局进入紧急状态。根据口蹄疫的危害程度，世界动物卫生组织将口蹄疫列为a类动物传染病，我国农业部将口蹄疫列为一类动物疫病，将口蹄疫病毒列为一类动物病原微生物。1.2泛素蛋白及其对抗原的影响图1：泛素-蛋白酶体系统图解（smalle and vierstra, 2004）fig.1:schematic of the ubiquitin-proteasome system泛素(ubiquitin, ub)是一个由76个氨基酸组成的高度保守的多肽链，泛素化过程是一个复杂的，并受到高度调控的过程，由三个级联反应组成，需要三类酶参与催化。这三类酶分别被称为e1泛素激活酶，e2一泛素耦联酶，e3一泛素连接酶。整个过程大致如下：首先在atp的参与下，在e1的半胱氨酸活性位点与泛素c末端的甘氨酸形成硫酯键(ciechanover et al., 1981; hershko et al., 1981)；接着，连接在e1的泛素被转移到e2的活化半胱氨酸位点；最后，在e3的催化下，泛素c末端与底物的某个位点的赖氨酸结合(ciechanover, 1993; weissman, 2001)。当第一个泛素分子连接到靶蛋白上后,另外一些泛素分子在e3 的催化下相继与底物相连的泛素分子的第46位赖氨酸残基相连,形成一条多聚泛素链，作为底物被蛋白酶体识别和降解的靶向性信号(ii ito et al., 1997)，一旦靶蛋白被4个以上的泛素分子修饰,它们就被蛋白酶体降解。完成泛素化的蛋白质结构被展平进入26s蛋白酶体，经过它的处理，蛋白质就被切成由7至9个氨基酸组成的短链，泛素分子可被水解下来,重复利用(groll et al., 1997; davies 2001; smalle and vierstra, 2004)。泛素系统广泛参与了多种基本的细胞过程并由此引起了特别的关注(huang et al., 1995)，其中泛素-蛋白酶体途径(ubiquitin-proteasome pathway)是一个新近受到关注的调节蛋白质降解与功能的重要系统(pickart and eddins, 2004)。这是真核细胞内除溶酶体外的另一种非常重要的蛋白降解系统，也是调节各种细胞生物学过程的重要机制，为人们提供了一个增强抗病毒效果的新思路。1.3 sirna干扰机制图2：rna干扰现象的机理（provenzano and mocellin, 2004）fig.2: the mechanism of rna interferencerna干扰（rnai）是一个基因表达的沉默机制，细胞内的复合酶切割双链rna（dsrna）分子为21-25个核苷酸的长度，这些短干扰rna（rnai）引导rna干扰，诱导沉默复合体（risc）去剪切与干扰rna序列互补的mrna(fire et al., 1998; sharp, 2001; hannon, 2002; mcmanus, 2004)，转录受抑制或翻译受到抑制，从而在转录水平或转录后水平干扰基因表达(如图2)。1998年fire等首次把双链rna(dsrna)注射入一种线虫（caenorhabditiselegans） 体内，dsrna使互补的mrna降解，诱导了靶向性的基因表达沉默(genesilencing),这一现象称为rna干扰（rna interference，rnai）。同植物中的共抑制(co suppression)或转录后基因沉默（post transcriptional gene silencing，ptgs）、真菌中的基因表达压抑（quelling）一样，rnai也是一种典型的转录后基因表达调控方式，是美国science和nature评出的2002年度最重要的科技成果之一，这成为基因功能研究和基因治疗研究的热点。康奈尔大学的guo等利用反义rna(antisense rna)技术特异性地阻断秀丽新小杆线虫(c.elegans)中的par1基因的表达以期得到与对照组注射正义rna(sense rna)相反的结果，但最终的结果却令他们费解:二者同样阻断了par1基因的表达途径。直到1998年，fire等的研究结果证明，在正义rna也阻断了基因表达的试验中，真正起作用的是双链rna，这些双链rna是体外转录正义rna时生成的，这种双链rna对基因表达的阻断作用被称为rnai。随后的研究结果发现，rnai现象在从植物到人类的多种生物中存在(mcmanus, 2004)。生物体可利用rnai来抵御病毒的感染，阻断转座子的作用。rnai属于转录后基因沉默机制，其本质是sirna高效、特异地阻断体内同源基因表达，致使mrna降解和基因表达受抑。自然界中，rnai可能是动植物体内的一种保护机制，主要作用在于防御病毒感染，维持基因组中转座子的稳定，参与胚胎发育等。有实验表明，添加外源合成的sirna分子到哺乳动物细胞能诱导rna干扰(elbashir et al., 2001)，此后诱导参与基因遗传中或后天失调的信使rna降解的rna干扰疗法便迅速发展起来，同时有研究证明rnai技术有很多非常适合作为抗病毒治疗的原因(leonard and schaffer, 2006)，所以本研究选择shrna基因作为该新型病毒疫苗的一个重要基因。1.4 干扰素与口蹄疫免疫图3：ifnr 在apc与t细胞和b细胞作用机制中的作用(索布林那，2009)fig：the role of ifn- in the mechanism of apc with t cells and b cells-干扰素(iterferon-，ifn-)具有免疫干扰素之称，其受体是特异性的糖蛋白(harris et al., 2005)，有广泛的抗病毒和免疫调节功能。特异性免疫反应被激活时，t细胞产生包括-干扰素在内的与免疫应答相关的细胞因子(sainz et al., 2005)，ifn-可使巨噬细胞表面mhc类分子的表达量增加，增强其抗原递呈能力；增强巨噬细胞表面表达fc受体，促进巨噬细胞吞噬免疫复合物、抗体包被的病原体；促进b细胞和cd8+t细胞的分化；增强th1细胞的活性，增强细胞免疫功能；对th2细胞的增殖有抑制作用，从而抑制th2细胞产生il-4，同时抑制il-4对b细胞的作用，特别是抑制b细胞生成ige，所以能增强细胞免疫抑制体液免疫。尽管、三种干扰素激发的基因有所相似，然而它们调节的很多基因仍然存在一定的差异(der et al., 1998)，其中干扰素所激发的基因是干扰素的两倍，此种干扰素诱导基因的不同也部分解释了干扰素比干扰素具有更好抗prv的现象。空斑形成单位及病毒增殖试验的结果均显示猪干扰素是三种干扰素中对抗prv最有效的细胞因子（姚清侠，2007）。但是干扰素生物活性以调节fc受体和mhci、ii类抗原的表达尤为突出；对细胞生长的抑制能力也比干扰素和干扰素强(jarosinski and massa, 2002; giroux et al., 2003)，在抗体产生的信号通路中起到免疫调节作用对中和抗体的产生有很大的意义，研究表明牛-干扰素(boifn-)在重组口蹄疫疫苗中可显著提高体液和细胞免疫反应(shi et al., 2006)，故本研究选用猪干扰素基因与其它功能基因重组在口蹄疫疫苗中有很大意义。从图3可以看出ifn-在抗口蹄疫过程中的作用机理：当活fmdv或灭活fmdv疫苗侵染机体时一部分在体液免疫阶段被消灭掉，另一部分在apc的作用下促使细胞产生mhcii、il-1，被t细胞表面的tcr识别后促进干扰素的分泌，同时干扰素能促使t细胞分泌干扰素，此时t细胞增殖并分泌细胞因子il-2、 il-4、 il-5、 il-6，这些细胞因子刺激b细胞使其分泌大量的特异性抗fmdv的抗体，这些特异性抗fmdv的抗体与吸附在apc表面被传送到此处的活fmdv或灭活fmdv疫苗结合产生免疫反应。在此过程中，ifn-不仅是一种有效的免疫佐剂，同时也是重要的免疫调节分子，它不仅能增加细胞免疫应答，最重要的是能增加疫苗介导的针对特异性病原体攻击的保护性，另外显著增强抗原递呈细胞膜表面mhci、mhc类抗原表达，因而激发更有效的抗原递呈过程。1.5 fmd疫苗研究进展在各种动物疾病的防控中疫苗接种是特异性预防动物疾病的可靠工具和有效手段，在fmd预防中也取得了显著的成效。发生fmd时，需用与当地流行的相匹配病毒型、亚型的疫苗进行免疫预防。传统的疫苗一般指的是弱毒疫苗和灭活疫苗，在长期的fmd防控过程中，常规疫苗取得了显著的成效，但同时也存在着一些不容忽视的缺陷和安全隐患：（1）生产成本高阻碍其推广使用；（2）病毒灭活不全或活毒逃逸带来疫情暴发的危险，欧洲几次fmd的爆发就是由于病毒灭活不完全或是由于活病毒从生产场地逃逸而造成的（孙元，2006）；（3）易出现病毒毒力返强或减毒株突变现象。这些局限性限制了传统疫苗在畜牧业中的应用。为了克服这种种弊端，各种fmd新型疫苗特别是基因工程疫苗被逐渐开发出来，如亚单位疫苗、可饲疫苗、合成肽疫苗、蛋白质载体疫苗、基因缺失疫苗、活载体疫苗、核酸疫苗等（钱平等，2003），这些疫苗具有许多传统疫苗无以比拟的优点，更为安全、有效且价廉，将逐步替代常规疫苗在畜牧业中的使用。1.6本实验研究的目的与意义伪狂犬病和口蹄疫是严重危害全球养猪业的两大重要传染病，分别由伪狂犬病病毒和口蹄疫病毒引起。prv主要引起猪繁殖障碍性疾病，随着我国养猪业规模化发展，猪伪狂犬病有流行蔓延趋势，给养猪业带来巨大损失。口蹄疫则是人畜共患的急性、烈性传染病，由于其传染性极强，而传统的灭活疫苗在生产使用过程中有灭活不彻底导致病毒逃逸工厂而发生口蹄疫的风险，因此口蹄疫基因工程疫苗的研究受到高度重视。本实验将猪ifn-基因、靶点位于fmdv 3b区段的shrna和两个串联起来的fmdv抗原基因 p1-ubp1共同插入到转移载体piecmv中，然后和伪狂犬缺失株prv tk-/ge-/lacz+共转染，通过空斑筛选的方法得到能够双表达o型口蹄疫抗原基因p1基因和跟泛素基因融合的ubi-p1基因，同时又能表达猪ifn-基因以及产生针对o型口蹄疫3b区段的rnai效应，来共同达到最终的抗病毒效果。2实验材料2.1菌种、毒株、载体与质粒伪狂犬弱毒疫苗株prvtk-/ge-/lacz+由农业微生物学国家重点实验室构建保存。该突变株是将prvea株tk基因缺失205bp，并在ge编码区插入lacz表达盒，导致ge失活的基因缺失标志性疫苗株。本研究所用工程菌dh5a、xl-gold由本实验室保存。载体piecmv由本实验马锐硕士研究生构建。puc57pansubip12a由上海英骏公司合成。pcasifngsif由本实验室郝根喜硕士研究生构建。 pcapansubip12asif由本实验室郝根喜硕士研究生构建。猪肾传代细胞pk-15与非洲绿猴肾细胞vero购自中国典型物保藏中心。2.2主要药品与试剂新生牛血清(ncs)购自杭州四季青材料有限公司，使用前经56灭活30min。培养细胞用的dmem粉剂为gibco公司产品。氨苄青霉素(amp)、胎牛血清均为invitrogen公司产品。各种限制性内切酶、连接酶、taq酶、dna marker均为大连宝生物公司产品。dna回收试剂盒为takara公司产品。质粒小量和大量制备试剂盒为omega公司产品。脂质体转染试剂盒lipofectin2000和无血清培养基opti-mem均为invitrogen公司产品。2.3主要培养基及配制lb液体培养基：胰蛋白胨10.0g，酵母浸出物5.0g，nacl10.0g，溶于ddh20中，完全溶解后用5mol/lnaoh调ph值至7.0-7.2，定容至 1000.0ml，在15磅高压下蒸气灭菌20min，室温保存。lb固体培养基：在刚配好尚未灭菌的lb液体培养基中加入琼脂粉至终浓度为1.5%，高压蒸气灭菌20min。待培养基温度降至50左右，加入相应的抗生素，铺制平板。待培养基凝固后，倒置于4保存备用。dmem基础培养液(用于常规细胞培养)：取dmem粉末(gibic, usa)13.5g溶于950 mlddh2o中，加入3.7g nahco3，用1mol/l hcl调ph值至6.8-7.0，定容至1000.0 ml，0.22m滤膜过滤除菌，分装后室温保存备用。dmem细胞生长液：在dmem基础培养液中加入10%的已灭活新生牛血清、100g/ml青霉素、100g/ ml链霉素，4保存备用。dmem细胞维持液：在dmem培养液中加入1%-3%的新生牛血清、100g /ml青霉素、100g/ml链霉素，4保存备用。细胞消化液：将nacl 8.0g、kcl 0.2g、na2hpo4 1.15g、kh2po4 0.2g、胰酶2.5g，依次溶于900.0mlddh2o中，待完全溶解后，定容至1000.0ml，0.22m滤膜过滤除菌，分装后置-20保存备用。2.4缓冲液及其配制tae(50)：242.0g tris碱，57.1ml冰乙酸，100.0ml0.5mol/ledta(ph8.0)，加ddh2o定容至1000.0 ml。pbs buffer：将nacl 8g、kcl 0.2g、na2hpo4 1.42g、kh2po4 0.27g溶于800.0mlddh2o中，待完全溶解后，滴加浓hcl调节ph至7.4，定容至1000.0ml，高温高压灭菌后室温保存。10%sds：称量10g高纯度的sds溶于80mlddh2o中，68加热溶解后，滴加浓hcl调节ph至7.2，定容至100.0ml，室温保存。0.5 m edta：称取186.1g na2edta. 2h2o溶于800.0mlddh2o中，充分搅拌，滴加naoh调节ph至8.0，定容至1000.0ml，高温高压灭菌后室温保存。2.5其他溶液ten：100.0mol/lnacl，10.0mol/ltris-cl，1.0mol/ledta(ph 8.0)lcm：30.mol/ltris(ph7.5)，5.0mol/lmgcl2，3.6mol/lcacl2，0.5mol/ledta 6.0 mmol/l-moracptoethnael，0.5%np-40，125.0mol/lkci空斑筛选pcr样品细胞裂解液：0.5%sds，100.0mmol/lnacl，10.0mmol/l tris-cl，1.0mmol/ledta，0.25mg/ml蛋白酶k。2.5空斑筛选与纯化相关试剂2dmem（无酚红）：称取13.4g无酚红的dmem粉剂，溶于约400.0 ml三蒸水中，再加入3.7g nahco3，用浓盐酸调ph值至6.8-7.0，定容至500.0 ml，0.22m滤膜过滤除菌，分装后4保存备用。低熔点琼脂糖（2%）：称取2.0g低熔点琼脂糖粉剂，溶于100.0 ml三蒸水中，高温高压灭菌30min后室温保存（用前于70水浴锅中融化或微波炉小心融化）。蛋白酶k（20mg/ml）：取100mg蛋白酶粉剂，溶解于5.0 ml三蒸水中，分装小份，保存于-20。10%sds(m/v)：称取10gsds粉末，溶解于100.0 ml去离子水中，室温保存。0.5mol/ledta：称取18.61g edta-na. 2h2o粉末，溶于约80.0 ml水中，naoh调ph至8.0后定容至100ml，室温保存。空斑筛选pcr样品细胞裂解液：05%sds，100.0mmol/lnacl，10.0mmol/l tris-cl，1.0 mmol/ledta，0.25mg/ml蛋白酶k。2.6寡核苷酸引物本实验pcr所使用的寡聚核苷酸引物如表1。表1：本研究中所用的寡核苷酸引物table 1:the oligo primer used in the research编号序列用途r primerf primer5- agctttgcgtgactttgtgtttttc- 35- gcagggggctgtttcatatactgat- 3鉴定阳性重组子3实验方法3.1转移载体piecmvubip1p1sififn的构建策略重组转移载体piecmvubip1p1sififn的构建流程如图4所示piecmv载体pcapansubip12asifpcasifngsifpiecmvubip1p1sififnpuc57pansubip12asifngsifubip12ap12a图4：转移载体piecmvubip1p1sififn构建流程fig.4：building process of piecmvubip1p1sififn3.1.1限制性内切酶酶切反应酶切产物仅用于检测时，取1l质粒dna并加入相应的限制性内切酶反应缓冲液，混合后加入限制性内切酶，指弹混合，瞬时离心后置于37水浴3h。若酶切产物用于回收，根据实际情况可增加质粒的量扩大酶切反应体系。3.1.2酶切产物的琼脂糖凝胶电泳检测配制0.8%琼脂糖凝胶（胶的浓度要根据目的条带的大小适当调整，如果是大片段则需浓度低的琼脂糖凝胶）：20mlddh2o中融入400l（50）tae，再加入0.16g琼脂糖，加热至完全溶解，稍微冷却后加入适量eb。凝胶倒入胶槽，如有气泡用梳子赶走，插好梳子，等待凝胶冷却凝固。拔出梳子，凝胶放入装有1tae电泳缓冲液的电泳槽，确保缓冲液要淹没凝胶。然后取酶切产物1.5-3l与微量6loading buffer混合，加于点样孔中，同时取约2l的dna marker点样作对照。以100-120v电压进行电泳。待溴酚蓝电泳到凝胶2/3处时，则可结束电泳。取出凝胶于凝胶成像系统拍照，保存照片。3.1.3酶切产物的回收酶切产物经琼脂糖凝胶电泳，鉴定正确后，于长波紫外灯下切取目的条带用琼脂糖凝胶dna回收试剂盒进行回收获得目的dna片段（具体回收方法参考该试剂盒说明书）。回收过程如下：（1）将切下的目的dna条带放入1.5ml离心管；（2）加入600lpn液，50水浴10min，翻转离心管使充分溶解；（3）将上步所得溶液加入吸附柱，室温静置2min后12000r/min离心60sec，弃废液；（4）加入600lpw液，静置5min后12000r/min离心60sec，弃去废液；（5）再次加入600lpw液，12000r/min离心60sec，弃去废液；（6）12000r/min离心2min，开盖静置5min；（7）弃掉收集管，将吸附柱放入离心管，悬空滴加30-50leb洗脱液（或ddh2o），37温箱静置5min。（8）12000r/min离心2min收集dna溶液，离心管标记保存。3.1.4回收产物的去磷酸化反应在做分子克隆时，为防止单酶切制备的载体在连接反应时发生自连，我们需将载体进行去磷酸化处理。具体步骤：回收时溶34l ddh2o在50l体系中加入2l ciap，4lbuffer置于37反应30min后加入1lciap置于50反应15min，用试剂盒进行液体回收溶20l ddh2o，跑胶检测。3.1.5目的基因与载体的酶连反应将回收所得的dna片段与载体用t4 dna连接酶进行连接，酶连体系根据大连宝生物工程有限公司提供的t4 dna连接酶的说明书进行配备，如表2所示。表2：目的基因与载体酶连体系table 4：reaction system of enzyme with target gene and vector反应体系体积（l）载体目的基因t4 dna ligase(25ul)10t4 dna ligase bufferddh2ototal14121220置于16或4过夜。3.2 感受态细胞的制备、质粒的转化、质粒制备与纯化3.2.1大肠杆菌感受态细胞的制备（氯化钙法）从大肠杆菌dh5平板中挑取一个单菌落，接种于2mllb液体培养基中，37200r/min摇床振荡培养过夜，按1：100转接到装有50mllb的盐水瓶中，继续培养约3-4h，在无菌条件下将细菌转移到一个无菌的用冰预冷的50ml聚丙烯离心管中，冰上放置30min，于44000r/min离心10min。弃上清，将离心管倒置1min使残留培养液流尽。加10ml 冰预冷的0.1mol/lcacl2重悬沉淀，冰浴30min后，44000r/min离心10min。弃上清，沉淀中加入2ml用冰预冷的0.1mol/l cacl2重悬。悬浮的感受态细胞可马上用于转化。如保存，则需加入无菌甘油到终浓度为15%，分装0.1ml/管，-80冰箱保存备用。3.2.2质粒的转化将载体与cdna或dna基因片段的连接产物与100l感受态细胞混匀，冰浴30min；42水浴热冲击90sec；冰浴2min；若是转化质粒，则取3050l菌液直接涂布含相应抗生素的lb平板；若转化连接物，则加入0.4ml 37预热的lb培养基，37振摇培养45min；5000r/min离心3min，弃去450l的上清后，将剩余的部分直接涂布含相应抗生素的lb平板，37培养1216h后，出现转化菌落。3.2.3质粒的小量制备(omega试剂盒) （1）将带有质粒的e.coil接种于5mllb/抗生素培养液中，37搖床培养1216 h；（2）取1.05.0ml的菌液，室温下10,000g离心1min收集细菌。（3）倒弃培养基。加入250ulsolution i/rnasea混和液，漩涡振荡使细胞完全悬浮。（4）往重悬混和液中加入250ulsolution ii，轻轻颠倒混匀4-6 次。此操作避免剧烈混匀裂解液且裂解反应不要超过5 min。（5）加入350ulsolution，温和颠倒数次至形成白色絮狀沉淀。（6）室温下，10,000g离心10min。（7）转移上清液至套有2ml收集管的hibind dna结合柱中，室温下 10,000g离心1 min，倒去收集管中的滤液。（8）把柱子重新装回收集管，加入500ulhb buffer，按上述条件离心，弃去滤液。（9）把柱子重新装回收集管，加入700uldna wash buffer，按上述条件离心，弃去滤液。（10）弃去滤液，重复第9步骤一次。(11)弃去滤液，把柱子重新装回收集管， 10,000g离心空柱2min以甩干柱子基质。(12)把柱子装在干净的1.5ml离心管上，加入30-50ulelution buffer(10mmol/l tris-hcl, ph8.5)或无菌水到柱子基质中，静置1-2min，10,000g离心1min洗脱出dna。3.2.4质粒的大量制备（omega试剂盒）(1)将带有质粒的e.coil接种于100-200mllb抗生素培养液中，37摇床培养12-16h。(2)取100-200 mllb菌液，室温下3,000-5,000g离心10min收集菌液。(3)倒弃培养基，加入10mlsolutionirnasea混合液，漩涡振荡使细胞完全悬浮。(4)往重悬混合液中加入10mlsolution，轻轻颠倒混匀10-15次后可将混合液室温放置2min以提高产量。(5)加入5ml冰浴buffern3，并温和颠倒离心管数次至形成白色絮状沉淀。准备好过滤器。(6)把hinbind大量柱套在收集管中，加入5mlbuffer gps至柱中，静置3-10min。室温3,000-5,000g离心5min。去滤液，把柱子重新放回收集管中。(7)把裂解液倒入事先准备好的针筒过滤器中，静置2min。(8)插入并轻推活塞使裂解液流进下面的收集管中。(9)在过滤澄清的裂解液中加入110体积的etr，颠倒7-10次后溶液变得浑浊，冰浴10min。(10)42水浴5min后，253,000-5,000g离心5min，etr溶液将在管底形成蓝色分层。离心后，如果溶液有大量的液滴悬浮，静置10min让液滴自然沉降。(11)转移上清液至离心管中，加入0.5倍体积的无水乙醇，混匀后室温静置1-2min。(12)取一干净的hinbind 大量柱装在50ml收集管中。转移20ml混合液至柱子内，室温下3,000-5,000g离心3-5min，倒去滤液。(13)重复第（12）步，把剩余的过滤液转移至柱子，直至所有的溶液都从柱子滤出。(14)把柱子重新放回收集管，加入10mlhb buffer，按上述条件离心，弃滤液。(15)把柱子重新放回收集管，加入15mldna wash buffer，按上述条件离心，弃滤液。(16) 弃去滤液，重复步骤（15）一次。（17）弃去滤液，把柱子重新放回收集管，最大速度（6,000g）离心10-15min以甩干柱子基质。（18）把柱子放在干净的50ml离心管中，加入1-3mlelution buffer，弃上清，室温下静置2min后最大速度（6,000g）离心5min以洗脱dna。3.2.5阳性质粒的酶切鉴定挑取转化的菌落，接种于4ml含相应抗性的lb液体培养基中。37培养过夜，小量制备质粒dna，用合适的限制性核酸内切酶消化，琼脂糖凝胶电泳，eb染色，紫外灯观察，鉴定重组质粒。另外，可以通过测序的方法进一步鉴定阳性质粒。3.3以prv为载体表达fmdv抗原蛋白基因p1，泛素蛋白与抗原p1的融合基因ubi- p1，rna干扰基因shrna，干扰素基因ifn-的重组病毒的构建3.3.1细胞的培养、冻存与复苏（1）细胞的培养：无菌台上将已长成单层的细胞培养瓶倾去培养液，用pbs液洗1-2遍后，加入1ml胰酶37消化数分钟，弃去胰酶，加入新鲜生长液吹打分散，按1:3或1:4传代。（2）细胞的冻存：无菌台上将刚长成单层的细胞用胰酶消化好后，弃尽胰酶，用少量细胞冻存液（100ml瓶冻存1-2管）吹打分散细胞，按约1.5ml每管分装于细胞冻存管中。先于4放置40min-1h，-80过夜后转入液氮罐中可保存数年（或-80可保存1-3个月）。（冻存液配法有二：一为9份的血清+1份的dmso；另一种为70%dmem+20%血清+10%dmso）（3）细胞的复苏：将水浴锅预先调至37，生长液加入细胞瓶并37预热，然后从液氮罐中（或-80冰箱）取出一管冻存的细胞，置水浴锅中快速融化，于无菌台中将细胞液转入细胞瓶中，375%co2培养箱静置培养，6h换新生长液（已预热）继续培养。）3.3.2 prv tk-/ge-/lacz+基因组dna的提取将prv弱毒株tk-/ge-/lacz+接种于已长成单层的pk-15细胞，37培养至80%的细胞出现病变，用吸管吹打使细胞从瓶壁上脱落，在48000r/min离心15min收集细胞。将细胞沉淀重悬于细胞裂解液lcm使细胞裂解，冰浴5-10min后，加入三氯三氟乙烷抽提，摇匀5min，43000r/min离心10min，吸取上清于另一干净离心管，再加入三氯三氟乙烷抽提一次，摇匀5min，43000r/min离心10min，取上清，48000r/min离心10min，取上清，加到5%-45%的甘油梯度上（加入的上清体积不超过甘油体积的10%），在电子天平上平衡，26000r/min离心2h，小心弃去上清，将沉淀重悬于ten缓冲液后，加入10%的sds至终浓度为0.5%，室温作用30min，加入等量饱和酚，轻轻摇动约10min，10000r/min离心10min，吸取上清于另一离心管，用等体积酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）抽提两次，取上清加入2倍体积的无水乙醇，混匀置-20 3h或过夜，于410000r/min离心20min，弃去上清，70%乙醇洗涤沉淀，室温干燥后，溶于适量的含rnasete中，置37 1h，最后贮存于-20备用。3.3.3脂质体介导的共转染 利用脂质体介导法按其试剂盒说明书进行。在24孔细胞培养板中培养细胞，于转染前4h，即细胞单层长至40%60%，换新鲜培养基继续培养。转染时，取2个1.5ml的无菌eppendorf管，管a加入12g 转移质粒、12g基因组和50l无血清培养基opti-mem，管b加入3l lipofectin reagent和50l无血清培养基opti-mem于室温作用5min。随后，将管b中的试剂加入至管a，室温作用20min。在混合物作用20min过程中，吸弃24孔培养板中的培养基，用不含血清的dmem洗涤细胞1次。将混合物加至细胞单层，于37，5%co2培养箱中培养6h，然后吸弃细胞培养物上的液体，加入完全培养基继续培养至细胞病变。3.3.4重组病毒空斑纯化和pcr鉴定 空斑纯化和pcr鉴定筛选流程如图5所示。24-36h后冻融两次发生病变将经pcr检测为阳性的转染产物以10-4-10-6 接长满90%细胞的六孔板。挑取空斑22个阳性率达到100%提基病毒因组，pcr检测接24孔板下一轮空斑纯化实验图5：重组病毒的空斑纯化及pcr鉴定流程fig.5: process of plaque purification and pcr of recombinant virus将出现细胞病变的共转染产物反复冻融3次，作连续10倍稀释，将10-4-10-6稀释度的病毒液分别取400l接种至6孔细胞培养板的pk-15细胞单层，于