猪胚胎体外培养影响因素的研究

猪胚胎体外培养影响因素的研究综述猪胚胎体外培养影响因素的研究综述 摘要摘要： 本研究以孤雌激活胚胎为研究对象，对猪胚胎体外培养过程中的相关 影响因素进行了探讨。体外成熟的猪卵母细胞经孤雌激活后，用添加.05%BSA 的 NCSU 一 23 培养的囊胚率(36.7%)极显著高于添加 5%，10%和 15%FCS 的 NCSU 一 23(11.8%，18.5%和 10.3%，P0.05)，但囊胚发育率随着 TCM199 比例的 增加而显著下降(30.1%vs25.0%，11.1%和 1.1%， P0.05)。将 NCSU23 中的亚 牛磺酸浓度从原来的 5mmo 比降低到.25，1.0 或.05mmol 几时，对猪卵母细胞激 活后的分裂率和囊胚发育率均无显著影响(介.005)，但完全去掉亚牛磺酸则导 致囊胚发育率极显著下降(l.4%)。在猪卵母细胞激活后的 0 币 oh 添加.034mmol 几丙酮酸钠和.54mmol 几乳酸钠，显著提高卵母细胞的分裂率 (71.0%vs63.9%，P0.05)，但 60h 后在培养液中添加丙酮酸钠和乳酸钠则极显 著降低其囊胚发育率(3.0，.63，.33%vs20.2%，P.001)。从胚胎培养开始就添 加葡萄糖可提高胚胎的囊胚发育率(20.1%vs10.3%，P0.05)。在 NCSU 一 23 中 添加 12mmoUL 的山梨醉，孤雌激活胚胎的囊胚发育率有所提高(32.4%vs26.0%)， 但差异不显著(产司.1875)。 以上结果表明:(1)BSA 的猪胚胎体外培养效果优于 FCS;(2)猪胚胎的体外培 养不需要成分复杂的培养液;(3)亚牛磺酸是猪胚胎培养液必不可少的重要成分， 但其浓度可下调到现行的 1/10;(4)乳酸盐和丙酮酸盐对猪胚胎的早期发育有促 进作用，但不利于后期发育;葡萄糖对猪胚胎的整个培养发育过程均有促进作用。 (5)山梨醇对猪胚胎的体外发育可能具有促进作用，但其效果有待进一步验证。 关键词关键词: 猪胚胎；体外培养；分裂率；囊胚率 1 1 前言前言 人们致力于猪胚胎体外生产的研究至少超过了 30 年且在不断的发展与进步 中 1- 3。长期以来, 大量的研究试图通过改善培养系统来提高体外胚胎生产 效率, 努力提高整个生产系统各个环节的技术水平 2 , 4- 5, 然而进展不大, 目前猪体外成熟 ( I VM ) /体外受精 ( IVF) /体外培养 ( I VC ) 的总体效 率仍然较低。卵子的体外成熟和胚胎培养是这一技术的重要环节, 提高这些环 节的技术水平对提高整个体外生产体系的效率尤为重要。因此, 本研究拟以猪 孤雌激活胚胎为研究对象, 着重探讨猪胚胎体外培养过程的相关影响因素, 以 便建立一套有效的猪胚胎体外培养系统。 2 2 材料与方法材料与方法 2 2 .1.1 试剂及药品试剂及药品 TCM - 199, Gibco 公司生产;犊牛血清 ( FCS) ,Hycl one 公司生产;人绒 毛膜促性腺激素 ( hCG) ,宁波激素制品厂生产。除特别注明外 ,其他所有无机 盐和生物化学试剂均为 Sigma 公司生产。卵巢保存及运输液:含有 K+、 Ca2 +、 Mg2 +的生理盐水。洗卵液: TCM - 199 + 2%发情牛血清 (OCS)。成熟液: NCSU - 23 基础液 + 10%卵泡液 ( PPF) +半胱胺酸 +激素。胚胎培养液: NCSU - 23 基础液 +0 . 5%牛血清白蛋白 (BSA)。以上配制的所有试剂均用孔径为 0 . 22m 的微孔滤膜过滤消毒。 2 2 .2.2 卵母细胞的采集与成熟培养卵母细胞的采集与成熟培养 从屠宰场收集青年母猪卵巢 ,将其置于含有 3035 生理盐水的保温瓶 内 ,在短时间内送回实验室;然后用 10 mL 注射器和 12 号针头穿刺抽吸卵巢上 面 38 mm 卵泡内的卵母细胞 ,在体视显微镜下挑选出具有完整卵丘细胞层或 部分致密卵丘细胞的卵母细胞 ,用洗卵液清洗 2 次 ,放入已装有 1 . 5 mL 含 有激素 (10 U /mL hCG, 0 . 1g/mL FSH)的成熟培养液 (无血清的 NCS U - 23 基础液 + 10% PFF +10 ng/mL EGF + 0 . 1 mg/mL 半胱胺酸 )的玻璃培养皿 (每皿 200300 枚 )中 ,在 38 . 5 、 5% CO2、 饱和湿度的培养箱中体外 成熟培养 2022 h,然后转移到不含激素的成熟液中再培养 2224 h。 2.32.3 血清的制备血清的制备 用无菌针头和离心管在发情当天的母牛颈静脉处采血 ,静置 30 min;在 4 冰箱中放置 24 h 左右 ,待血清全部析出后 ,以 3 500 r /min 离心 10 min; 吸取血清 ,再以同一转速离心 10 min;弃去沉淀 ,将血清在 56 水浴中灭活 30 min;最后将灭活的血清过滤消毒 ,分装 , - 20 保存 (使用时取出解冻 )。 2.42.4 卵泡液的制备卵泡液的制备 从卵巢表面 38 mm 的卵泡中抽取卵泡液收集于离心管中 , 3 500 r /min 离心 10 min;弃去沉淀 ,直接用 0 . 22m 的滤器过滤灭菌 ,然后小剂量 分装 ,于- 20 保存 ,备用。 2.52.5 卵母细胞的激活处理卵母细胞的激活处理 猪卵母细胞成熟培养 4246 h 后,用吸管反复抽打去掉周围的卵丘细胞, 然后在含有 5mol /L 离子霉素( i onomycin)的培养液中处理 5 min (38 . 5 ) ,随即用胚胎培养液洗 2 次,移入含有 2 mmol /L 6 -二甲氨基嘌呤(6 - DMAP)的培养液中培养 34 h (38 . 5 )。 2.62.6 卵母细胞体外培养卵母细胞体外培养 ( ( I I VC)VC)及早期胚胎发育潜力的评定及早期胚胎发育潜力的评定 将经人工激活处理后的卵母细胞置于 50L 的培养液微滴中培养 48 h,检 查裂情况 ,中间不换液 ,第 68 天检查囊胚发育情况。 2.72.7 试验设计试验设计 试验一试验一：蛋白添加物对猪胚胎体外培养的影响 本试验旨在比较牛血清白蛋白和不同浓度的胎牛血清的猪胚胎体外培养效 果。试验分为 4 组: (l)NCSU 一 23+0.5%BSA; (2)NCSU 一 23+5%FCS; (3)NCSU 一 23+10%FCS; (4)NCSU 一 23 十 15%FCS。 经激活处理的猪体外成熟卵母细胞随机分配到各处理组进行胚胎的体外培 养。各组结果以 4h8 的分裂率和 6 一 sd 的囊胚发育率来评定。 试验二试验二：NCSU 一 23 中添加 TCM 一 199 对猪胚胎体外培养的影响本实验旨在探 讨两种不同的培养液按不同比例混合后对培养效果的影响。将 NCSU 一 23 和 TCM 一 199 这两种培养液分别各自配制完成后，按照设定的体积比，在平衡前 混合均匀，平衡后将猪卵母细胞激活进行培养。试验分为四组，体积比分别为: (1)NCSU 一 23 培养液占 100%，TCM 一 199 培养液占 0%: (2)NCSU 一 23 培养液占 90%，TCM 一 199 培养液占 10%; (3)NCSU 一 23 培养液占 75%，TCM 一 199 培养液占 25%; (4)NCSU 一 23 培养液占 50%，TCM 一 199 培养液占 50%。经激活处理的猪体外成 熟卵母细胞随机分配到各处理组进行胚胎的体外培养，实验各组分别按前述的 方法进行胚胎发育能力评定。 试验三试验三：亚牛磺酸对猪胚胎体外培养效果的影响 本试验旨在探讨亚牛磺酸浓度对猪胚胎体外培养效果的影响。根据培养液 中亚牛磺酸的浓度实验分为 5 组(O，.05，1.0，.25 和 5.0mnlol 几)。经激活 处理的猪体外成熟卵母细胞随机分配到各处理组进行胚胎的体外培养，实验各 组分别按前述的方法进行胚胎发育能力评定。 试验四试验四：能量底物对猪胚胎体外发育的影响 本试验的目的是探讨能量底物对猪胚胎体外发育的影响。试验根据葡萄糖， 丙酮酸钠和乳酸钠在胚胎培养中的添加时间(O 一 60h 和 60h 以后)随机分为 7 组(见表 2 一 2)。经激活处理的猪体外成熟卵母细胞随机分配到各处理组进行 胚胎的体外培养。为了确保一致性，A、B、C、D 四组在 60h 时也换原液一次。 各组卵母细胞经成熟后分别按前述的方法进行激活及胚胎发育能力评定。 试验五试验五：山梨醇对猪胚胎体外培养的影响 本试验旨在探讨山梨醇对猪胚胎体外培养的影响。用改良的 NCSU 一 23 培 养液(亚牛磺酸的浓度为.05oIL/)为基础液，然后分别添加不同浓度的山梨醇 (O，3，6，12，18olL/)使试验分为 5 组。经激活处理的猪体外成熟卵母细胞 随机分配到各处理组进行胚胎的体外培养。实验各组分别按前述的方法进行胚 胎发育能力评定。 2.82.8 数据的统计分析数据的统计分析 所得数据均用卡方检验进行统计分析 ,确定差异的显著性。 3 3 分析与讨论分析与讨论 3.13.1 蛋白质添加物对猪胚胎体外培养的影响蛋白质添加物对猪胚胎体外培养的影响 己经表明，在培养液中添加蛋白质有利于胚胎的体外发育 (carolnaetal，1995)。血清和血清白蛋白通常被作为蛋白质来源添加到培养液 中用于支持哺乳动物胚胎的体外发育。有人认为，血清中的某些成分能够缓和 一些可能对胚胎发育有害因子的作用(Mauer，r1992;Bvaiste，r1995)。血清白 蛋白与血清相比，潜在的有害副作用可能更小(Bvaiste，r1995)。血清白蛋白 中不但含有各种低亲和力的物质成份，如类固醇、维生素、脂肪酸和胆固醇等， 同时包含有各种离子和大分子物质(Maure，1992)。当然，血清中所含有的某些 物质同样能够引起胚胎培养条件和环境的恶化和加重某些不利因素的影响 (Baviste，r1995)。血清对胚胎体外培养具有双重影响 (pinyopmunrintrandBaviste，r1991:Pinyopint:nadBaviste，r1994;Bavist e，r1995)。一方面，干预胚胎卵裂球的分化不利于胚胎的早期发育但能促进细 胞的增殖增加囊胚细胞的数量和囊胚的孵化 (pinyopmunrintrnadBvaiste，r1991;PinyopununinrtnadBaviste，r1994;Thom psonetal，1992;Rorieetal，1994:Limetal，1994)。利用血清在胚胎后期的作 用，可以修改培养液培养方式。他们的做法就是在胚胎期培养时每间隔 48 小时 依次从 10、15 到 20%血清浓度递增(Baviste，r1995)。pinyopununinrt 和 Bvaister(1994，1996)进一步深化研究，建立了一种二步培养法来进行牛体外 受精胚胎的生产，他在受精后 72 小时后才添加血清到培养液中。这种逐步添加 血清法和二步培养法已经被一些实验室用于进行牛体外胚胎生产 (Zhnagetal，1992;Bvaiste，r1995)。本研究比较 T 胎牛血清浓度(5、10 和巧%) 和猪胚胎的体外培养效果，结果发现，在培养液中添加牛血清白蛋白和不同浓 度的胎牛血清其培养效果明显不同。在分裂期，含.05%BSA 和 15%FCS 组分裂率 较高(87.9%和 87.7%)，比 5%、10%组的分裂率都高(80.8%和 80.0%)。单从分裂 看，FCS 的浓度增加可能会提高卵子分裂率，但在后期培养中与 10%FCS 培养液 比较囊胚率明显下降。FCS 在三个浓度梯度中，以 10%FCS 添加于培养液中较为 合适。但是，与添加 BSA 的培养液比较，效果却不如添加.05%BSA 的培养液。 已有报道(PinyPouinirnadBvaist，er1991)表明，血清能够明显抑制体外受精 后卵子的分裂，并且在 2 细胞到桑堪胚期没有明显的促进发育的作用。在牛的 胚胎体外培养研究中(Whngetal，1997)，在培养液中添加 FCS 比添加 BSA 更能 促进囊胚的孵化，但从桑堪胚发育到囊胚时段，添加 BSA 比 FBS 效果更明显。 本研究结果也表明，在猪胚胎培养时，在培养液中添加.05%的 BSA 比添加 FCS 更能促进胚胎的体外发育。 3.23.2 添加不同比例添加不同比例 TCMTCM 一一 199199 对猪胚胎体外培养效果的影响对猪胚胎体外培养效果的影响 长期以来，人们都在致力于如何提高胚胎体外培养效率的研究。培养环境 与体系对培养的效率关联很大。目前，多种培养体系用于猪胚胎的体外培养。 目前有 NCSU 一 23 培养液(NorthCmalinaStateUniversity 一 23NCSU 一 23)和 BECM 一 3(BeltsvilleEmb 叮。CutiureMdeuim 一 3)，两者均能成功的用于猪胚 胎的体外生产，其中 NCSU 一 23 是公认猪胚胎体外培养较好的培养液。在 NCSU 一 23 液中发育的猪胚胎卵裂球的皮质、连接处、核周围都存在肌动蛋白微丝， 但在 TCM 一 199 液中发育的猪胚胎卵裂球的核周围则无肌动蛋白微丝 (Wangetal，2000b)。TcM 一 199 含有丰富的氨基酸、维生素等物质，多用于牛 羊等大家畜动物的胚胎培养。本研究试图添加一定比例的 TCM 一 199(10%，25% 和 50%)到 NCSU 一 23 培养液中来提高猪胚胎的体外培养效果，但结果与预期的 相反，囊胚发育率随着 TCM 一 199 比例的增加而明显下降。猪胚胎可能与牛、 羊等动物的胚胎不一样，成分简单的培养液可能更有利于其体外发育。这可能 与猪囊胚形成所需的细胞数较少有关。 3.33.3 亚牛磺酸对胚胎体外培养的效果的影响亚牛磺酸对胚胎体外培养的效果的影响 母畜生殖道内的氧气压比标准体外环境低约三分一。胚胎在体外培养过程 中，高氧气压(20%)比低氧气压(5%)产生更多的自由基(erferdaieals) (FowlernadCallinghma，1978)。很明显，活性氧化基团(eractiveo 即 genspeeies，Ros)在体内的产生和消除的平衡对卵子的受精和胚胎的发育能力 至关重要。研究表明，胚胎体外培养时暴露于氧化压下时，胚胎本身的防御机 制不能够完全有效的保护本身精细的细胞结构不受侵害。在胚胎体外的培养过 程中，会受到氧自由基的损害，这己经在多种动物中得到证实。有报道表明， 活性氧化基团会造成线粒体的功能紊乱，使 DNA，RNA 和蛋白质受到损害 (Comporti，1989)。为防止胚胎在体外培养过程中因氧化压所受的损害，必须 在培养液中添加各种抗氧化剂。例如，为了调节胞外的 ROS 水平，可在培养液 中添加抗氧化酶物质如超氧化物岐化酶(supeorxidedismutase，soD)和过氧化 氢酶(catalase)。超氧化物岐化酶能促使过氧化离子(护)转化为 H20:然后被 过氧化氢酶和谷肮甘肤过氧化物酶清除。有研究报道，在小鼠的体内和体外胚 胎发育过程中，添加 SOD 能保护胚胎不受氧浓度因素的影响 (Nnogokaietal，1992)。在无蛋白添加物的培养液中添加 SOn 能提高兔胚胎发 育到囊胚的比率(Lim，Liouetal，1996)。亚牛磺酸和牛磺酸常添加于培养液中 进行 WF 和 WC，与 SOD、半肤氨酸、肤氨酸等成份一起，提高 GSH(glutathinoe，谷耽甘肤)水平，保护胚胎不受外环境因素的损害。曾申明 曾用 NCSU 一 23、SOF 等培养液对猪胚胎体外培养进行比较研究，NCSU 一 23 培 养液效果较其它的好，认为其原因就是 NCSU 一 23 培养液中含有的牛磺酸和亚 牛磺酸有利于猪胚胎发育。Lnog 等给 BECM 一 7 添加了牛磺酸和亚牛磺酸(即 BECM 一 7)后，虽不能提高囊胚率，但胚胎细胞数有所提高 (Longetal，1999:Dobrinskyetal，1996)。改良的 KSOM 中添加牛磺酸对牛的早 期胚胎发育有益(LiunadFoote，1995)。Petters 和 Reed 认为牛磺酸或亚牛磺 酸能显著提高猪胚胎发育能力(PettersnadRede，1991)。Elhassna 等(2001)发 现牛输卵管液和子宫液中牛磺酸等几种氨基酸含量很高，认为它们在胚胎发育 中可能起重要作用(Elhassnaetal，2001)。然而，由于亚牛磺酸非常昂贵，这 无凝会增加猪胚胎体外培养的成本。为此，本研究对 NCSU 一 23 中亚牛磺酸的 浓度进行了进一步试验，结果发现，将 NCSU 一 23 中的亚牛磺酸浓度降低到原 来的 1/10(0.5olL/)对猪胚胎的囊胚发育率没有显著影响，但完全去掉亚牛磺 酸则使胚胎的囊胚发育率显著下降。由此表明，亚牛磺酸是猪胚胎培养液中必 不可少的重要成分，但浓度可降低到目前通常所用的 1/10(0.5ol 几)。 3.43.4 能量底物对猪胚胎体外发育的影响能量底物对猪胚胎体外发育的影响 胚胎体外发育需要能量物质支持，早在 40 年前便得以证实，并提出乳酸盐在小 鼠早期胚胎发育中是非常重要的(Brinset:etal，1%5)。丙酮酸盐同样被证实是 小鼠早期胚胎体外发育的重要能源物质(Brinsetretal，1965)。在许多种属的 胚胎体外发育中添加葡萄糖、乳酸盐、丙酮酸盐对于成功地培养到囊胚是必要 的，这一点已得到广泛的认同。在培养液中添加乳酸盐和丙酮酸盐将猪体内胚 胎培养发育到囊胚期己有报道，同样，添加葡萄糖将体内胚胎培养到囊胚也见 有报道(wright，1977;Peettrseta，l1990)。不同于其它哺乳动物，猪胚胎在 整个体外培养过程中均能用葡萄糖作为能源物质。在早期分裂时便进行葡萄糖 代谢和利用(swainetal，2002)，直至囊胚时一直需要葡萄糖。但是近来有报道 表明，在培养液中添加葡萄糖反而会阻碍了胚胎的发育(swainetal，2002)。 IvMzlvF 胚胎先用含乳酸盐和丙酮酸盐的培养液培养，然后换用含葡萄糖的培 养液进行培养，能够促进胚胎的发育并生产出高质量的胚胎，最终能产出正常 的后代(Kikuehietal，2002)。猪体外受精和激活后胚胎的发育能力和囊胚的质 量明显受到葡萄糖添加时间的影响(Mdevedveetal，2004)。在培养 5h8 后添加 葡萄糖能够更好的促进体外受精或者激活后的胚胎发育到质量好的囊胚。但是 在 46h 后添加却不如 58h 添加的效果好，囊胚率只有一半，同时伴有较多的畸 形胚和死胚(Medvedveetal，2004)。为进一步提高猪胚胎的体外培养效果，本 研究将猪的胚胎培养分为两个阶段(0 一 60h 和 60h 以后)，在不同的培养阶段 添加不同能量底物。结果发现，乳酸钠和丙酮酸钠在 0 一 60h 添加对猪胚胎的 早期分裂具有一定促进作用，但在 60h 以后添加则明显降低胚胎的囊胚发育率， 这与 Kikuchi 等(2002)的研究结果一致。然而，延期添加葡萄糖不但不能提高 胚胎培养效果，反而降低胚胎的囊胚发育率，与 Mdevedev 等(2004)的研究结果 相反。这可能是实验条件不同所致，因本研究所用 NCSU 一 23 培养液的亚牛磺 酸的浓度仅有 Medvedev 等(2004)所用的 l/10。 3.53.5 山梨醉对猪胚胎体外发育的影响山梨醉对猪胚胎体外发育的影响 成功用于猪胚胎培养的另外一种培养液是 NCSU 一 37，其成分与 NCSU 一 23 的主要差异用山梨醇代替亚牛磺酸。Lnog 等(1998)的报道表明，培养液中添加 山梨醇后，猪卵母细胞同样能够发育成熟并能受精，而且单精受精的效果也比 较理想。而近年来的报道表明，利用 NCSU 一 37 进行猪胚胎体外培养至囊胚后 移植给受体，能获得更高的孕率和更多的子畜出生(心 kuehiKetal，2002)。 Poreh 敏 a 等(2004)将体内获得的二倍体和四倍体猪胚胎用 NCSU 一 37 进行培 养，评估其发育能力。其结果也显示，NCSU 一 37 适宜用于移植前的猪胚胎体 外培养。因此，山梨醇可能对猪胚胎的体外发育具有一定促进作用。但是一直 以来，没有人对山梨醇的作用机理以及对胚胎培养的影响进行过深入的研究。 为此，本研究用改良的 NCSU 一 23 为基础液，对不同浓度 (0，3，6，12，18ofL/)山梨醇猪胚胎培养效果进行了试验，结果发现，猪胚 胎的囊胚发育率均有不同程度提高，其中添加 12ol 几山梨醇组的囊胚发育率 达到 32.4%，说明其对提高猪胚胎囊胚率有一定作用。然而，在 NCSU 一 37 中 是将亚牛磺酸置换为山梨醇，本试验是在原来 NCSU 一 23 的基础上添加了山梨 醇，培养液中含有 0.5ol 几的亚牛磺酸，这两者的是否存在协同或者拮抗作用 从而影响了单独的作用，需要进行更进一步的研 究。同时由于试验数据较小，与对照组相比还未达到显著性水平，如进一步扩 大试验，则有可能确证其作用。 4 4 结论结论 4.1 BSA 的猪胚胎体外培养效果优于 FCS。 4.2 在 NCSU 一 23 中添加 TCM 一 199 影响猪胚胎的体外培养效果，猪胚胎的体 外培养不需要成分复杂的培养液。 4.3 亚牛磺酸是猪胚胎培养液必不可少的重要成分，但其浓度可下调到现行的 1/10，以节约胚胎培养成本。 4.4 乳酸盐和丙酮酸盐对猪胚胎的早期发育有促进作用，但不利于后期发育;葡 萄糖对猪胚胎的整个培养发育过程均有促进作用。 4.5 山梨醇对猪胚胎的体外发育可能具有促进作用，但其效果有待进一步确证。 参考文献参考文献: : 1 ABEY DEERA L R. 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