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Chignolin 蛋白的高压变性研究蛋白的高压变性研究 （题目：小二号黑体加黑） 王贞营（姓名：小四黑体） (德州学院物理系，山东德州 253023)（院系：五号黑体） 摘 要 随着计算机模拟技术的发展，本文利用 GROMACS 软件，对 Chignolin 在 2000bar 和 10000bar 两个压强下进行的独立的分子动力学模拟，以揭示压强对蛋白质去折叠（变性）的影响并探讨其机理。 通过分析模拟结果发现：Chignolin 蛋白在高温下 RMSD 最大时去折叠程度明显不同;小蛋白随着压强 的增加其折叠与去折叠过程有一个反复阶段;高压下的蛋白质去折叠不是完全折叠;高压对 Chignolin 的 构象影响较大，变性明显，甚至出现了完全去折叠的情况。 关键词 Chignolin； 分子动力学模拟； 去折叠； 高压 （“摘要”和“关键词”字样用五号黑体字，后空一格用五号宋体字单倍行距打印摘要内容， “摘要”两字中间空两空格，关键词用五号宋体，每个关键词后用“；”再空两格。摘要内容 在 200-300 字之间，不分段。 ） 1 绪论（一级标题：小三号黑体，顶格写） （正文部分均用小四号宋体，1.5 倍行距） 蛋白质是一切生命活动的主要物质基础，结构决定其功能。蛋白质折叠和去折叠问 题是当前生物信息学、生物物理学等生命科学领域面临的一项长期而具有极其重要地位 的课题。其重要任务之一便是通过施加外界驱动力（如温度，压强，机械力等）来致使 蛋白质变性，通过研究其去折叠过程探索蛋白质的折叠和去折叠机制。近年来随着实验 手段和计算机水平的不断提高，许多实验仪器和理论方法被用来研究蛋白质的折叠和去 折叠过程。从实验上研究蛋白质高压去折叠存在着各种问题,如时间周期长，设备复杂、 昂贵；且技术难度大等，无法在原子层次和飞秒分辨率下进行研究。用计算机模拟的理 论方法研究蛋白质的高压去折叠是实验研究的有利补充，可以在原子层次和很高的时间 分辨率上研究实验无法实现的新现象，对实验研究有重要的指导作用。分子动力学模拟 可以从原子水平和飞秒分辨率上研究蛋白质的高压去折叠，这一点目前实验上无法实现。 目前对蛋白质折叠的研究采取的策略之一就是用加速去折叠过程来研究蛋白质的折叠问 题。蛋白质去折叠可以通过诱导变性条件加速其进程，这样可以对蛋白质构象膨胀的早 期阶段进行观察，而这种过程在一定程度上反映了蛋白质的折叠过程1 。蛋白质高压去 折叠（变性）的研究是当今蛋白质工程中还未完全解决的一项重要内容。对温度导致去 折叠过程已经进行了广泛的研究,而对压强导致蛋白质去折叠（变性）的研究相对较少， 2 仅做了少量的模拟研究1。上角标1：表示参考文献，要求与后面参考文献标号一一对 应，正文中的参考文献按照先后顺序从1、2 2 蛋白质和分子动力学模拟原理 21 蛋白质（二级标题：四号黑体，顶格写） 蛋白质是一类重要的生物大分子，在体内占有特殊的地位，是生命活动的主要承担 者，是生命现象的主要物质基础。它是由一系列-氨基酸通过缩水过程而聚合成一种线 性的高分子物质。作为构成蛋白质的基本单元，自然界共有 20 种-氨基酸。它们具有相 似的结构特征，差别在于连接在残基原子上的侧链 R 的不同。不同的侧链形成各种氨 基酸各种不同的理化特性。根据它们在水溶液中的表现，可分为疏水性氨基酸和亲水性 氨基酸。 为了表达蛋白质的不同组织层次，经常使用一级结构和空间结构（二、三、四级结构） 等术语对其分子结构进行阐述。 从能量的角度看，蛋白质系统有很多自由度，其能量曲面可看作是高维的曲面。蛋白 质折叠的过程可看作是顺着折叠漏斗发生的过程。折叠被看成一个链状分子系统的平行 流的过程，就像很多溪水从具有复杂地形结构的山坡上流下，而不仅仅是一条溪水从单 一山谷中流下。 图 2-1 具有高低起伏的能量面（图标：五号宋体） （所有图标的标注以章节为基础，如图 2-1、2-2、；3-1、3-2、） 研究蛋白质的折叠过程，对于了解蛋白质的折叠机制，理解蛋白质的快速折叠的来 源，都是必不可少的一个方面。我们通过一个简化的统计模型中勾画出折叠过程的简单 图像，通过引入短程相关的协作性特征，在一定程度上刻画了蛋白质动力学对折叠结构 德德州州学学院院 物物理理系系 2010 届届 物物理理学学专专业业 毕毕业业论论文文（ （毕毕业业设设计计） ）二二选选一一 （页码居右下角） 3 的依赖性；并根据统计物理的方法讨论了复温度场中体系的配分函数的零点，并由此分 析了体系相变的特征，这不仅重新检验了原有理论，为其提供了理论上的可靠性，而且 提供了一条途径，对蛋白质的折叠转变的热力学性质进行更为细致的刻画，为不同模型 之间的比较提供了有益的参考。 2 22 分子动力学（MD） 生物大分子的分子动力学模拟方法，无论是在模拟算法和力场参数，还是在模拟体 系的大小，模拟时间的长短上，都取得了巨大的进步。这些进步使得计算机模拟技术成 为了除 X 射线晶体学方法和核磁共振波谱学方法外又一个研究蛋白质结构和功能关系的 重要工具。通过对生物大分子的模拟，一方面我们可以从原子水平上解释实验现象和结 果，另一方面我们可以得到一般实验无法获得的微观信息。 在分子动力学模拟中，我们把每个原子看作一个粒子，对于一个含有 N 个粒子的体 系，我们把第 i 个粒子的质量记为 Mi，它的空间位置计作矢量 ri，而空间坐标的一级和二 级导数我们用和来表示。根据牛顿第二定律：r r （2.2） iiii i Fm am r （重要公式的标注：同图标，以章节为基础，如：2.1、2.1、等） 这里的是所有其它粒子作用到粒子 i 上的合力，这可以由 N 个粒子的位能函数 V i F 的负梯度表示，即： （2.3） i i V F r 在笛卡尔座标中，可以用它的 3 个分量来表示。若 Xi(t)是时刻 t 粒子 i 在 x 方向的座 标。使用泰勒（Taylor）展开，我们可以得到： （2.4） 2 ()( )( )( )/2 iiii X ttX tX ttX tt （2.5） 2 ()( )( )( )/2 iiii X ttX tX ttX tt 其中和分别表示 t 时刻粒子 i 在方向的速度和加速度。上述两式的方程是( ) i X t ( ) i X t 精确的，但是含有无限项。在实际中我们通常用 Verlet 方法进行近似求解。方法如下： 将 2.4 和 2.5 两式分别相加和相减得到： （2.6） 2 ()2( )()( ) iiii X ttX tX ttX tt AAA 4 其中： （2.7）/( )()()/2 i ixiiii Xfm X tX ttX ttt 由于在 t 和 t-t 时刻，第 i 个粒子位置是知道的，加速度可以从位能函数的负梯度 求出。所以以后任何时刻粒子的位置，速度和加速度都可迭代求解。这就是计算牛顿运 动方程的 Verlet 方法。 分子力学模型是从量子力学模型简化得到的。在分子力学模型中，每个粒子通常代 表一个原子，有时也可以代表一个非极性基团，例如甲基基团。从理论上来说，分子力 学中体系的能量应该等于对同样的体系在量子力学分子力学模型是从量子力学模型简化 得到的。通常体系的能量被经验性的划分为若干个能量项，每个能量项用一个简单的函 数形式来表示。其一般的形式为 22 00 2 0 126 ()() (1 cos()/2() b bondsangles dihedralsimproper ijijij ijij ijijij EK bbK KMK ARq q rrr 等号右侧的六项分别描述了化学键的伸缩，键角的弯曲，二面角的旋转，二面角 的弯曲，范德华相互作用和静电相互作用。前四项合称为成键相互作用，除了二面角的 旋转采用了三角函数叠加的形式来描述，其他三项都使用了谐振势的形式。后两项合称 为非键相互作用，范德华相互作用用 Lennard-Jones 势来表示，而静电相互作用用库仑相 互作用的形式来描述。这些函数形式，连同它们相关的参数，统称为分子力场。现在常 用于研究生物大分子的分子力场主要有 AMBER2-4,，CHARMM5，GROMOS6,7和 OPLS-AA8,9，它们都采用了公式 1 的形式来描述分子能量，只是在实现上有些细微的 差别。 分子动力学（MD）模拟预测蛋白质结构方法，主要是作为其他预测方法的补充手段 和应用于结构优化。分子动力学的优点是利用有限的实验数据构造分之的结构模拟并研 究它的能量与结构的动态变化。而这些数据对于用实验方法来确定结构是远远不够的。 MD 方法可以得到体系的各种构象，进而根据统计力学可求得体系的各种热力学性质。 如焓、熵，并从自由能数据判断体系不同状态的稳定性。如何在众多的局域极小中寻找 相应于整体能量极小的构象是重要的多体制问题，而模拟退火是非常有用的工具。 3 德德州州学学院院 物物理理系系 2010 届届 物物理理学学专专业业 毕毕业业论论文文（ （毕毕业业设设计计） ）二二选选一一 （页码居右下角） 5 23 经验力场和位能函数 分子动力学模拟方法是把分子体系看作在势能面中质点的运动4。为了便于描述往往 选用某些与原子座标相关的函数对势能面进行拟合，得到势能面的近似解析表示。这种 势均力敌能面的表示方法称为力场（force field）,而这和与坐标相关的函数称为位能函数。 近 10 多年来已发展了多种力场，它们基本形式是相似的，只是在能量函数各项的选 取和参量化上有差别。其中常用的有 AMBER CHARMM GROMOS 和 CVFF 等力场。 一个典型的原子位能函数包括：键长畸变能，键角畸变能，二面角畸变能，静电能， 范德华能和氢键能，形式为： 2222 612 000 126 0 1111 ( )()()(1 cos()()() 22224 ij b ijijr ij qq cc V rk bbkknk rrr （2.14） （214）式右边的第一项是键长畸变能，它用简单的弹簧来模拟，这里 Kb是弹性强度 常数，b0是成键原子间的平衡距离。这一项的求合遍历所有共价键。 （214）式的第二 项是键角畸变能，它采用了第一项类似的形式。是键角畸变的强度常数，是平衡角。k 0 求合遍历所有实在键角。第三项与第四项均与扭角有关。第三项代表沿着一个给定的键 角旋转时引起二面角畸变的能量，它在本质上是周期的。这里是力常数，n 是周期，k 为一参考角。第四项代表共平面原子偏离平面的程度，这里是力常数，是平衡位k 0 置。第五项反映了体系的范德华力相互作用。它通常用 Lennard-Jones 位能表示，项代 6 ij r 表亲和力，而项代表近程排斥力。和为常数。本式的最后一项是体系中的库化 12 ij r 12 c 6 c 相互作用。这里分别为原子 I，j 的电荷。和是真空的介电常数。在实际使用时 ij q q 0 r 往往取作与距离成正比。 r 在整个位能函数中反映非键相互作用的范德华项和静电项对维持蛋白质的构象是很重 要的。为了节省计算时间，在实际的运行程序中往往总是指定一个距离，只计算距离小 于这一指定值的非键相互作用。 前面所述的位能函数也被称为分子类型的位能函数。随着计算机技术的发展和计算 能力的提高，将量子力学力场与分子力学力场（QM/MM）相结合也是一种趋势，即对某 6 些关键部位使用精确的量子力学能量函数，而其它部位使用分子力学的位能函数。 4 2.3.1 能量优化（三级标题：小四黑体，前面空两空格两空格（一个汉字字符） ） 分子动力学模拟与能量优化是紧密相关的，但又是存在明显差别的两种方法。两者 紧密的联系是都使用相同的力场和位能函数，因而在程序化时，他们有大量相同的子程 序。两者最大的差别是与时间的关联上。分子动力学模拟考虑体系结构与能量的时间演 化，而能量优化则只是搜寻构象空间的某个静态点，在这一点上作用在每个原子上的力 都达到平衡，因而体系是稳定的。能量优化得到的构象仅是体系的局域极小构象。 尽管能量优化不能给出构象演化的信息和体系的总体能量极小构象，但它可以用于 优化 X 射线晶体学，多维 NMR 波谱学方法所测定的实际验结构；它还可以用于研究生 物大分子的局域构象（如 loop 区等） ；可以分析配体与受体的对接（docking）过程；可 以为分子动力学模拟准备初始构象，等等。 在 GROMOS 中经常使用的能量优化方法有：(1)最速下降法、(2)共轭梯度法。 （1）最速下降法（Steepest Descents(SD) method） 若经 k 次迭代分子体系的构象用表示，这里是一个 3N 维的矢量，那么，对 k+1 k r r 次迭代有： （2.15） 1kkkk rrp 其中，是一个待选择移动方向上的单位矢量，是一个标度值，代表移动步长。 k p k 若将力在附近用 Taylor 展开，并忽略最高次项，可得 1k F k （2.16） 1 () kkkkkkkk FF rpFgp 这里的是能量函数的梯度。为了实现目标函数的极小化，总是期望，也 k g 1k F k F 就是0。将上式改写为： （2.17） kk gp 1 |cos kkkkk FFgp 这里的是矢量和的夹角。为了使目标函数通过迭代尽快减小，期望取最 k g k p cos 小值，当取时，满足这一条件，此时=- （2.18） k p k g (2.18)式说明，能理函数的负梯度方向使目标函数最速下降的方向，因此称该方法为 最速下降法。 最速下降法对梯度的依赖性大，这是它的优点，也是它的缺点。在体系远离最小点 德德州州学学院院 物物理理系系 2010 届届 物物理理学学专专业业 毕毕业业论论文文（ （毕毕业业设设计计） ）二二选选一一 （页码居右下角） 7 时，这个方法十分有效，但在最小点附近时由于梯度接近于零，因此收敛很慢。 ；因而最 速下降法适用于远离最小点的构象。 （2）共轭梯度法（Conjugate gradients method） 用此方法可以使最速下降法收敛慢的缺点得到改善：目标函数的下降方向不是仅选 取能量函数的负梯度方向，而是选取本次迭代时的能量函数负梯度方向与前次迭代时的 能量函数负梯度方向的线性组合。这样的两个梯度称为共轭梯度，这样的优化方法称为 共轭梯度法。与 2.18 式比较，有 （2.19） 1kkkk pgp 这里的是权重因子，共轭梯度法比最速下降法收敛快的多。对于一个 N 个自由度的体 k 系，共轭梯度法经过步就可以达到最小点。共轭梯度法可以用于较大的体系。但对于非 简谐体系可能不收敛。对于起使模型远离平衡点的蛋白质体系，共轭梯度法更容易陷入 局部势阱。 5 2.3.2 SHAKE 方法 积分的时间步长t 是分子动力学积分过程的一个关键参数。为了加快计算速度，往往 用大的时间步长，但太长的时间步长会引起积分过程失稳和积分值不准确。选择积分步 长的主要限制是体系的高频运动。如果能够冻结不太感兴趣的分子内部高频运动，像键 的伸缩、键角的张合等，那么在进行分子动力学模拟时，就能够选择较大的时间步长。 冻结的办法就是限制距离，比如原子 i、j、k、形成了两个键 i-j 和 j-k 及一个键角ijk， 那么，当把原子 i,j 及原子 k 之间的距离限制在一个期望的值时，这两个键长的高频运动 就被冻结了。在 GROMOS 中通过 SHAKE 方法来实面限制。 设在体系存在 NC个距离限制，第 k 个限制与 k1和 k2个两个原子间距离有关则： （2.20） 1 21 2 2 ( )0 kk kk k rrd 这里是 k1和 k2原子间的实际距离，为限制距离。此时的运动方程（2.12）和 1 2 k k r 1 2 k k d （2.13）和积分求解应满足（2.20）的条件。采用拉格朗日待定乘因子方法，将一个包含 待定乘因子的零项加到运动方程中，为此由（2.9）和（2.10）式得：( ) k t （2.21） 1 ( )( )( ) Nc i ikk k i mrV rtr r 上式右边第一项代表限制不存在时的相互作用，第二项代表限制力，写为： 8 （2.22） 1 ( ) ( )( ) Nc c k ik n i r Ftt r 这个力的方向总是沿着限制方向。当（2.22）中的时间依赖乘因子要通过满足条件( ) k t （2.20）来确定。当使用蛙跳法解方程（2.21）时，根据（2.12） （2.13）式，在限制不存 在的条件下： （2.23） 2 ( ) ()() i ii i F t r ttr ttt m 其中为第 i 个原子在时刻的位置矢量，是非限制相互作用力。当考虑 ( ) i r tt tt( ) i F t 力时，原子 i 在时刻的位置矢量可写成：( ) c i Ft tt （2.24） 2 ( ) ()() c i ii i F t r ttr ttt m 此时，距离限制应满足条件（2.20） ，有 k=1,2,，Nc (2.25) ()0 k r tt 将（2.24）代入(2.25)式，再应用（2.20）式 (2.26) 12 121 2 12 22 22 ( )( ) ()()0 cc kk kkk k kk FtFt rtttrtttd mm 这里 k=1,2,，Nc。若将（2.22）式代入（2.26）式就得到 Nc个关于待定乘因子的( ) k t 二次方程，求解方程可确定的值。此后应用(2.22)式可求得限制力，再应用( ) k t( ) c i F t （2.24）式可求出限制存在下的原子位置矢量。这方法称为 SHAKE 方法，它可() i r tt 以使积分的时间步长提高 23 倍。 6 2. 4 GROMACS 的介绍 GROMACS 是用于研究生物分子体系的分子动力学程序包.它可以用分子动力学，随 机动力学或者路径积分方法模拟溶液或晶体中的任意分子，进行分子能量的最小化，分 析构象等。它的模拟程序包包含 GROMACS 力场(蛋白质，核苷酸，糖等)，研究的范围 包括从玻璃和液晶，到聚合物，晶体和生物分子溶液。GROMACS 是一个功能强大的分 子动力学的模拟软件，其在模拟大量分子的大系统的牛顿运动方面具有极大的优势。 GROMACS 的运行过程，主要由一系列的文件和命令组成。GROMACS 一般的模拟 过程可以分成以下三个阶段： 德德州州学学院院 物物理理系系 2010 届届 物物理理学学专专业业 毕毕业业论论文文（ （毕毕业业设设计计） ）二二选选一一 （页码居右下角） 9 （1） 前处理过程：生成模拟对象的坐标文件、拓扑结构文件以及平衡参数及其外力作 用参数等文件。 （2） 模拟过程：首先要对系统进行能量最小化，避免结构的不合理而在模拟中出现错 误； 然后是对系统升温过程，先给系统的各个原子以 Boltzmen 分布初速度，再模拟较短的时 间 以达到初步的平衡；最后进行真正的分子动力学模拟，即平衡过程。此过程一般时间步 长 为 1 fs，运行时间在 ns 量级，以保证模拟系统尽可能找到势能的最低点。当然，对于其 他 的操作，如施加外力（模拟 AFM 加力）需要在平衡之后进行。在 MD 模拟的过程中，用 户可以运用配套的可视化软件，如 VMD 等随时观测模拟的过程及系统的状态。 （3） 后处理过程：MD 模拟结束后，GROMACS 会产生一系列文件，如.pdo 文件(受力 分析文件)、.trr 文件(模拟过程结果文件)、.edr 文件(能量文件)等。同时，GROMACS 本身还提供了多种分析程序，可以对这些文件进行分析，可以得到分子体系的各种信息 。 7 3 Chignolin 小蛋白的去折叠研究 3. 1 分子动力学模拟的准备工作 本实验就是利用 GROMACS 这一软件对 Chignolin 小蛋白进行高压去折叠研究。本 实验的工作平台是 Linux。Linux 系统作为 GROMACS 程序软件包的工作平台，分子动力 学模拟的前期准备工作是做好本次模拟实验至关重要的一个环节，其步骤如下： 1、对 pdb 文件的转换 先将 pdb 文件转化为 GROMACS 文件（*,gro） 。Pdb 文件中的原始数据经常不完全， 与碳原子相连的氢原子常常会漏掉。转换工具 pdb2gmx 检查结构文件中每一个残基并补 充上所有缺失的氢原子。在转换过程中它同时会生成一个拓扑文件以记录原子间的相互 作用。在此过程中我们使用的是 gromos9643a1 力场（标准力场） 。 2、盒子的生成 在模拟过程中我们要将蛋白质置于含水的环境中。首先我们确定盒子的大小要适中， 然后在盒子中加满水。这两个步骤分别是由 Editconf 和 Genbox 两个子程序来完成。 10 3、能量极小化 能量极小化是由分子动力学程序 mdrun 来进行的。它的目的是用来除去蛋白质中的 氢原子产生的内力，以及结构过于紧密而导致的不正确的范德华力。Mdrun 只输入一个 grompp 结合拓扑文件（.top） 、结构文件（.gro）和参量文件（minim.mdp）而生成的轨迹 文件（.tpr）。 4 4、分子动力学模拟 分子动力学分为平面动力学模拟和自由动力学两部分。 （1） 、为了使蛋白质和水组成的体系保持平衡，在能量极小化的基础上首先进行适 当时间的平衡动力学模拟，如在此我们进行了 100ps 的平衡动力学模拟。 （2）在平衡动力学基础上，把蛋白质、水组成体系的分子约束放开，进行自由动力 学模拟，模拟时间的长短视研究问题而定。本文进行了两次独立的分子动力学模拟，每 次模拟时间都是 50ns，共 100 个 ns。 5、数据分析 经过自由动力学模拟后，生成多个文件其中最主要的是记录每一时刻蛋白质结构的 轨迹文件 fullmd.trr 和能量轨迹文件 fullmd.ene。基于这两条轨迹文件，可以对蛋白质的结 构功能关系进行分析研究。也可以通过程序 trjconv 截取每一时刻的构象以便直观地观察 它的变化。 本文对蛋白质的二级结构（do_dssp） 、方均根偏差（RMSD）等参数进行了分析。 do_dssp： do_dssp 读取一个轨迹文件并调用程序 dssp 计算每一个时刻的二级结构。每一个残基 和每一个时刻的情况都被写入一个扩展名为.xpm 矩阵文件中。每一个二级结构类型的残 基数和总二级结构数作为时间的函数被写入文件（_sc） 。 3. 2 Chignolin 蛋白的系统参数设置 3.2.1 Chignolin 小蛋白 以人工设计的最小蛋白质Chignolin（PDB 代码为 1uao）为研究对象 。Chignolin 是 最近人工合成的迄今为止最小的蛋白，仅有十个残基（GYDCPETGTWG），它的晶体结 构是由两个 片组成的发卡（图 1） ，是蛋白质折叠/去折叠研究很好的模板，目前国内外 还尚未见有关 chignolin 高压去折叠的有关报道。本文用充分含水模型对该蛋白在 300K 下，高压影响去折叠过程进行研究，揭示压强对蛋白质去折叠（变性）的影响并探讨其 德德州州学学院院 物物理理系系 2010 届届 物物理理学学专专业业 毕毕业业论论文文（ （毕毕业业设设计计） ）二二选选一一 （页码居右下角） 11 机理。 3.2.2 系统参数的设置 1、系统大小 系统大小由程序 editconf 决定并将信息通过一个.out 文件输出。 本次模拟将蛋白质与盒子边沿距离设定为 1.0nm，最终系统大小为 3.95nm,3.72nm 和 3.11nm，系统体积为 45.91nm。 2、系统的组成 由 editconf 生成的盒子限制了系统的大小后，经过 genbox 填充了系统中未被蛋白质 分子占据的空间，可以从拓扑文件(.top)看出在这个过程中加入了 1764 个水分子。 由输出的结果可以看出，系统中共有 20 个氨基酸残基和 1764 个其它原子团，非氨 基酸残基原子团的数目恰好与拓扑文件中的水分子数目相等。 在此之后，要对系统的典型进行中和，本次模拟是在系统中加入 2 个钠离子，同时 去掉一个水分子，最终系统有 10 个氨基酸、718 个水分子和 2 个钠离子组成。 由于水的压缩性系数随着压强的升高而改变，在模拟中我们充分考虑了各高压下压 缩性系数的改变情况（见表 3-1） 。 表 3-1 不同压强下的压缩性系数值 （表头：五号宋体，居中，其标注同图标，以章节为基础编号） Pressure (bar)Compressibility (bar-1) 145.6 10-6 200035 10-6 1000010.5 10-6 3、模拟环境设置 模拟环境设置是通过自由动力学(fullmd)过程中需要调用的文件进行控制。在 grompp 运行时需要调用 gromppfullmd.mdp 作为控制参数文件。与模拟环境有关的参数都可以在 此文件中进行摄制。对此次模拟而言，时间步长设置为 0.005ps，步数设置为 10000000 步， 即模拟时间为 50ns；在压强分别为 2000bar、10000bar 两个压强下对小蛋白去折叠进行模 拟，每次模拟 50ns，共 100ns。 3. 3 实验结果分析 基于上述 2000bar 和 10000bar 两个压强下进行的独立的分子动力学模拟，通过分析 12 模拟结果发现，高压对 chignolin 的构象影响较大，变性明显，甚至出现了完全去折叠的 情况。进一步研究蛋白质与周围水分子的作用情况发现，水分子对 chignolin 的去折叠有 着重要作用。 图 2 给出了 Chignolin 在高压 2000bar 和 10000bar 时的 RMSD（root mean square deviations）和 Rg(radius of gyration)随时间变化图。由图 2a 可见，在 2000bar 时， Chignolin 的 RMSD 在前 5ns 急剧增加，一致到 13ns 相对平稳，在 13ns 达到第一个极大 值，然后又一直到 20ns 平稳上升，20ns 左右急剧增加，达到极大值，此后出现剧烈震动， 在 30ns 附近达到最大值，此时 RMSD 最大值为 0.8（angstrom） ，图 3a 给出了此时的构 o A 象快照，可见此时 Chignolin 已经完全去折叠。在 10000bar 时，从图 2a 可以看出， RMSD 在前 3ns 一直上升，3ns 后经过一段时间的回落以后又持续上升在 35ns 附近到达 最大值，由图 3b 给出的在 10000bar 时 Chignolin 的构象快照可见，在 35.3ns 小蛋白已经 完全去折叠。 4 结论 图 2 是高压影响下小蛋白去折叠的 RMSD 和 Rg 随时间变化图，由图中可以发现， chignonlin 在高压影响下产生了比较明显的变性，同时由图 2-a 和图 2-b 也可以看出，两 个压强时 RMSD 和 Rg 变化趋势较一致。图 3 的结构图表明，小蛋白 chignonlin 在高压下 达到了完全去折叠。由于技术条件和其它因素的限制，对高压诱导变性的研究相对较少， 本论文研究的高压诱导 chignolin 变性首次发现了小蛋白出现完全去折叠，这是原来没有 发现的，但蛋白质折叠机制是一个长期而复杂的课题，要解释其机理还需要理论学家和 实验学家共同努力。希望我们的工作能为相关研究提供有用的理论依据。 参考文献（“参考文献”字样要求同一级标题， ） 文献标号以方括号加阿拉伯数字，后空一格，文献正文部分为五号字。参 考文献不能少于15篇，其中至少三篇外文文献，15篇文献中要求有至少五篇至少五篇 近三年的参考文献。 1 阎隆飞，孙之荣主编.蛋白质分子结构.北京: 清华大学出版社,1999:250-256 2 赵南明，周海梦主编. 生物物理学.北京:高等教育出版社,2000:3-5 德德州州学学院院 物物理理系系 2010 届届 物物理理学学专专业业 毕毕业业论论文文（ （毕毕业业设设计计） ）二二选选一一 （页码居右下角） 13 3 王骏.蛋白质折叠和蛋白质组成复杂性简化的研究:博士论文,南京:南京大学物理系 ,2001:4-6 4 赵立岭.蛋白质折叠的计算机模拟:硕士论文 ,德州:德州学院生物物理研究所,2005:1-2 5 王恒粱,谭天伟.蛋白质生物化学与生物技术.北京:化学工业出版社,2001,12-14 6 梁毅. 结构生物学.北京:科学出版社,2005:157 7 何忠效.生物化学实验技术.北京:科学出版社,2003:167 8 Jihua Wang,Zhiyong Zhong, Haiyan Liu, Yunyu Shi.Quasiequilibrium unfolding thermodynamics of a small protein studied by molecular dynamics simulation with an explicit water model. PHYSICAL REVIEW,2003:E67,316-322 9 Liewei Wang, Tien V. Nguyen, Richard W. McLaughlin, Human thiopurine S-methyltransferase pharmacogenetics: Variant allozyme misfolding and aggresome formation . PNAS. originally published online Jun 20, 2005; 102;9394-9399; 10 Ida Berglin Enquist, Eva Nilsson, Andreas Ooka, Effective cell and gene therapy in a murine model of Gaucher disease . PNAS .originally published online Sep 5, 2006; 006;103;13819-13824; 11 John R. Duguid, Craig W. Bohmont, Changes in Brain Gene Expression Shared by Scrapie and Alzheimer Disease . PNAS.1989;86;7260-7264 （英文摘要和关（英文摘要和关键词键词（ （Abstract、 、Keywords） ）为为 12 磅加粗磅加粗 Times New Roman 字字,其其 余余为为 12 磅磅 Times New Roman 字。字。 ） ） Study of High Pre