细胞分裂指数测定及曲线绘制

细胞分裂指数测定 实验原理： 体外培养细胞生长、分裂繁殖的能力，可用分裂指数来表示。它与生长曲线有一定的 联系，如随着分裂指数的不断提高，细胞也就进入了指数生长期。 分裂指数指细胞群体中分裂细胞所占的百分比，它是测定细胞周期的一个重要指标，也是 不同实验研究选择细胞的重要依据。 1， 实验材料： 细胞传代用品，培养细胞常用染色用品。18x18mm2盖玻片，95%乙醇. Gimsa 染色液（称取 Giemsa 粉末 0.5g,加入几滴甘油研磨，再加入甘油，加入的甘油 总量为 33ml,56中保温 90-120min,然后加入 33ml 甲醇，置入到棕色瓶中保存，即为 Gimsa 原液，使用时一般用 PBS 稀释 10 倍） 。(来自：丁香园) 姬姆萨染色液：配方（姬姆萨氏染料 0.60g,甘油 50ml,无水乙醇 50ml） 配制：称取姬姆萨氏染料粉末 0.6g,加入预热至 60甘油 50ml,置入到 55-60的水浴中，1.5-2h 后，加入 60的五水甲醇 50ml,静置 1 天以上，滤过后即成姬姆 萨染色原液。 ） 使用：方法一：临染色前，在每毫升蒸馏水中加入上述原液 1 滴，即成 姬姆萨染色液，注意，所用的蒸馏水必须是中性或者微碱性，如果偏酸用 1%碳酸钾调整. 方法二：在 5ml 新煮过的中性蒸馏水中滴加 5-10 滴姬姆萨染色 原液，即稀释成常用的姬姆萨氏染色液。摸片经过甲醇固定干燥后，在其上滴加足量染色 液或将摸片浸入到盛满染色液的染缸中，染色 30min,或者染色数小时至 24h,取出水洗，吸 干或烘干，镜检，细菌呈蓝青色，组织细胞胞浆呈红色，细胞核呈蓝色。 （来自：兽医微生 物学实验指导） 2， 实验步骤： （1）用 0.25%胰蛋白酶消化第 3 代细胞，以 1x104接种到铺有盖玻片的 6 孔培养板 中，37，5%CO2 培养箱培养。 （2）每隔 24h 取出观察一次，用 PBS 洗 3 遍后，用 95%乙醇固定 10min（甲醇： 冰醋酸=3：1 固定 30min）. （3）然后用 Giemsa 液染色 10min（5 微克/mlDAPI 染色 10min） （4）用自来水或 PBS 冲洗。 （5）待盖玻片晾干后反扣在载玻片上镜检（或者盖在滴有甘油的载玻片上，封片后 在荧光显微镜下观察） 。 （6）细胞计数：选择细胞密度适中区域观察分裂细胞，进行细胞计数，最好一个视 野一个视野进行，对每一时间组的玻片各取细胞数多，中，少 3 个区域各一区， 共数 1000 个细胞，计算出每 1000 个细胞中的分裂相平均数值和所占百分比 （或者同倍镜下取 5 个不同视野，计数分裂相细胞，取平均值，连续 7 天，以 时间（天）为横坐标，细胞分裂相的千分率为纵坐标，绘制分裂指数曲线图。 5,分裂前期，6 分裂中期，7，分裂后期，8 分裂末期 2012-4-1 成年猪 MSCs 分裂后期及末期 hoechest 标记 2012-4-1 成年猪 MSCs 分裂中期及后期 hoechest 标记 2012-4-1 成年猪 MSCs 分裂前期 hoechest 标记 2012-4-2 成年猪 MSCs 培养 F2 53h 的核分裂相，分裂后期。Giemsa 染色 2012-4-2 成年猪 MSCs 培养 F2 53h 的核分裂相，分裂末期。Giemsa 染色 2012-4-2 成年猪 MSCs 培养的 F2 26h 细胞状态，分裂前期 Giemsa 染色 实验误差分析： 1， 接种时按照检测细胞生长曲线的细胞接种原则将悬液接种到事先放置有小盖玻片 的培养瓶内。 2， 细胞