肺炎支原体感染和耐药机制的研究现状

肺炎支原体（mycoplasma pneumonia，Mp）是引起人类非典型性肺炎和许多呼吸道疾 病的病原体之一，在获得性肺炎病例中约有 1030是由该病原菌引起的。肺炎支原体 只能黏附在呼吸道上皮细胞表面，而不进入组织和血液中，通过宿主细胞吸收营养，并从 宿主细胞膜获得脂质和胆固醇，继而释放出核酸酶及过氧化氢等有毒物质，导致细胞及机 体的病理损害。黏附和定植在宿主细胞是 Mp 致病的关键，p1 蛋白、p116 蛋白、高分子量 蛋白、p65 蛋白等黏附蛋白发挥了重要作用。Mp 膜脂蛋白可诱导某些细胞分泌细胞因子， 如白细胞介素 8（IL8） 、肿瘤坏死因子 （TNF） 、白细胞介素 1（IL1） 、白 细胞介素 10（IL10） 、白细胞介素 12（IL12）等，从而引起全身各系统的并发症，并 以此加重机体的炎性反应。过分应用大环内酯类抗生素可使 23 S rRNA 基因发生选择性突 变1 ，由此揭示了 23 S rRNA 基因突变是导致 Mp 耐药的因素之一。近年来，由于抗生 素的大量使用和不规范治疗等原因，Mp 耐药菌株逐年增加，多重耐药也明显上升，导致 治疗难度加大。Mp 的感染和耐药机制是当前研究的的热点，本文就 Mp 黏附蛋白、膜脂蛋 白、23 S rRNA 基因、核糖体蛋白 L4 和 L22 等领域的研究现状进行综述。 1 Mp 感染机制 1.1 黏附蛋白 与宿主呼吸道上皮细胞的黏附是 Mp 感染和成功定植的关键，黏附是 由 Mp 细胞的尖端样结构特殊的黏附细胞器完成的。对宿主细胞黏附起主要作用的黏附 蛋白包括 p1 蛋白、p116 蛋白、p30 蛋白、高分子量蛋白（high molecular weight proteins，HMW） 、p65 蛋白等。Seto 等2，3首先证实了黏附蛋白是按照一定次序组装 到 Mp 上的，即先是 HMW1，再是 HMW3、p1、p90，最后是 p65，用免疫荧光显微镜观 察到在 Mp 黏附细胞器顶端中有 3 个独特的亚细胞蛋白定位点，即 HMW1HMW3、p1p90p40 和 p30p65。 p1 蛋白是 Mp 主要的保护性抗原和毒力因子，含有多个抗原决定簇，位于黏附细胞器 的顶端，是一种对胰酶敏感的跨膜蛋白，介导与靶细胞的特异黏附过程。p1 蛋白正确定位 于黏附细胞器是其发挥黏附功能的前提。p1 基因用限制性核酸内切酶酶切图谱分析可分为 从 AN 共 14 个区，其中 F、G、L、M 为单拷贝区，其余为多拷贝区。编码 p1 蛋白的结 构基因在单拷贝区，位于 Mp 基因组的第 180858185741 位，由 4884 个碱基组成。Mp 在 进化过程中染色体基因组减少了很多，其基因组中包含大量的重复序列，存在重复性和可 塑性4 。根据 p1 基因的限制性片段长度多态性（RFLP）将 Mp 分成两型：型是以 M129 菌株为代表的 Group1，型是 FH 菌株为代表的 Group2。p1 蛋白的结构基因包含于 5.6 kb 的基因区内（EcoRI） ，从第一个 EcoRI 酶切位点到 nt580，Group1 和 Group2 的核酸 序列及蛋白序列相同；nt580 到 nt640，两组的基因序列中有三个核苷酸的差异,但蛋白序列 相同；Group1 的 nt641 至 nt1110 的核酸序列对应于 Group2 的 nt641 至 nt1125，Group2 在 这一区域比 Group1 长出 15 个核苷酸，相应增加了 5 个氨基酸；Group1 的 nt2188 至 nt3456 和 Group2 的相对应的 nt2830 至 nt3480 有 90的同源性，该区域 Group2 比 Group1 基因长 12 个核苷酸，多 4 个氨基酸；Group1 的 nt3457 至 p1 基因的结尾，与 Group2 相对 应的区域比较有 3 处以上的差异5 。p1 蛋白是 Mp 直接结合到宿主细胞受体分子的主要 黏附蛋白，也是主要的免疫原，可刺激机体产生较强的免疫反应。目前应用 p1 蛋白的特异 序列作为引物进行聚合酶链反应（PCR）扩增来检测 Mp 的报道较多6，7 。 p116 蛋白含有 1 030 个氨基酸，分子量为 116 kD，是由一段长 3 093 碱基对（bp）的 开放阅读框（ORF）编码，由 ATG 起始密码子开始转录的 3.7 kb 的 mRNA，在此基础上 翻译为蛋白质。Svenstrup HF 等8重组表达了几乎完整的 p116 蛋白，该重组蛋白能与 Mp 多抗反应，且重组 p116 蛋白的特异性多抗可以抑制 Mp 对肝癌细胞株 Hep2 细胞的 黏附，证明 p116 蛋白是独立于 p1 蛋白之外的重要细胞黏附因子，且具有较强的免疫学活 性。此外该多抗还与致病株 FH 反应，且不与生殖器支原体交叉。 p30 蛋白在维持 Mp 黏附细胞器的细胞结构和生物功能以及单向移动方面起重要作用， p30 蛋白缺失的突变株并不影响 p1 蛋白在黏附细胞器上定位，p30 蛋白与 p1 蛋白、p40 蛋 白、p90 蛋白所组成的复合物是受体识别所必需，这一复合物可使 Mp 有效黏附于宿主细 胞。 高分子量蛋白(HMW)包括 HMW1、HMW2 和 HMW3，是由肺炎支原体两个非连锁基 因位点编码的，这些蛋白参与或协助 Mp 的细胞黏附作用。HMW1 有一近似胞浆域和一跨 膜结构，此亚结构分布可使 HMW1 在支原体膜和细胞骨架之间形成链接，而这是黏附细 胞器正常形成和发育的关键。HMW1 是其他黏附蛋白定位的基础，其最先被安装到黏附细 胞器上，定位于黏附细胞器基底附近。HMW2 是 p1 蛋白正确定位所需，HMW2 与 HMW1 的缺失将无法使 p1 蛋白有效地从胞浆池定位到细胞骨架结构，最终不能到达 Mp 细胞表面。 Willby MJ 等9研究显示 HMW1 是 HMW2 定植在 Mp 黏附细胞器上所必需的。Balish 等10推测 HMW2 是黏附细胞器的电子密度核成分。HMW3 蛋白为高度疏水性并含有 大量脯氨酸，HMW3 缺失可使 p65 蛋白的水平下降、使 p65 蛋白定位变得更加模糊、使 p1 蛋白无法聚集在黏附细胞器，进而导致 Mp 细胞黏附性下降。p65 蛋白分子量为 65 kD，编码基因为 p65 操纵子的第一个基因，与编码 HMW2 蛋白的基因紧密相邻。p65 蛋白 是 Mp 细胞骨架的构成部分，如果 HMW1 或 HMW2 蛋白部分或完全缺失，将导致 p65 蛋 白含量极低并不能正确定位，而且无论是移码突变还是转座子插入引起的 HMW2 缺失， 都会导致细胞黏附蛋白 HMW1、HMW3 和 p65 水平下降，并使 Mp 失去细胞黏附能力。 1.2 膜脂蛋白 Mp 感染除了引起原发性非典型性肺炎、咽炎、气管炎、支气管炎等 呼吸道感染外，还可引起全身各系统的合并症11 。支原体的免疫活性物质主要存在于膜 脂蛋白中，在体外具有诱导人单核巨噬细胞分泌 TNF、IL1 的能力12 。 Kazachkov 等13研究表明，Mp 及其胞膜物质在体外可以活化人单核巨噬细胞并诱导其 产生 TNF、IL1、IL10、IL12 等多种前炎性细胞因子。其活化机制是巨噬细 胞通过其胞膜上的 Toll 样受体 2(TLR2)识别 Mp 膜脂蛋白成分，并完成信号转导过程。在 识别 Mp 膜脂蛋白的过程中，TLR2 起着主要作用：TLR2 超表达而 Toll 样受体 6(TLR6)表 达缺陷的人胚肾 293（HEK293）细胞受到巨噬细胞活化脂肽 2(MALP2)刺激后，同样可 以通过 TLR2 介导 NFB 活化并释放前炎性细胞因子；而 TLR2 受体被阻断后的单核细 胞对 Mp 膜脂蛋白的反应性明显受到抑制12，14 。 Chmura 等15实验证明人的支气管上皮细胞在 Mp 抗原的刺激下，IL8 的分泌明 显增加，且与感染的抗原量呈量效关系。Sohn 等16实验结果也显示 Mp 能显著诱导肺 腺上皮癌细胞株 A549 细胞 IL8 的分泌，且分泌的 IL8 的量与 Mp 的感染程度具有一定 的相关性。Mp 诱导的 A549 细胞 IL8 的产生与细胞外信号调节激酶（ERK）的活化途径 有关，使用丝裂原活化激酶（MAPK）ERK 的抑制剂 PD98059 可明显的降低 Mp 诱导的 IL8 的表达16 。国内研究显示17，18 ，A549 细胞、人脐静脉内皮细胞株 ECV304 细胞受到 Mp 膜脂蛋白作用后，细胞膜结合型细胞间黏附分子 1(mICAM1)的表达水平明 显上调，且对 Mp 膜脂蛋白具有浓度依赖性，随着 Mp 膜脂蛋白作用时间的延长，A549 细 胞、ECV304 细胞 mICAMI 表达水平逐渐上升，作用 16 h 达到高峰，然后下降。说明 Mp 膜脂蛋白中的脂质成分可以诱导 A549 细胞、ECV304 细胞 mICAM1 表达水平上调， 在很大程度上影响着 Mp 所致炎性反应的强弱。 2 Mp 的耐药机制 由 Mp 感染的某些病人长期用药治疗可引起临床患者对大环内酯类抗生素的耐药。从 临床病人标本中分离出的 Mp，发现有 1/3 感染支原体的病例在 23S rRNA 基因发生了点突 变1 。由此提示过分应用大环内酯类抗生素可使 23S rRNA 基因发生选择性突变，从而 导致 Mp 对大环内酯类抗生素的耐药。 Matsuoka 等19在 76 株耐药 Mp 中分离出 13 株对红霉素耐药，其中 12 株高耐药， 最低抑菌浓度（MIC）均大于 256 g/ml,1 株低耐药（MIC=8 g/ml） ，对红霉素耐药的 13 株 Mp 核苷酸测序显示，23 S rRNA 基因功能区中，10 株在 2 063 位发生 AG 突变，1 株在 2 064 位发生 AG 突变，对红霉素低耐药株在 2617 位发生 CG 突变；在 23S rRNA 基因功能区和核糖体蛋白质 L4 和 L22 没有发现突变。 Morozumi 等20研究显示，12 株对 6 种大环内酯类抗生素（阿奇霉素、克拉霉素、 红霉素、西他霉素、四环素、左氧氟沙星）耐药的 Mp（MIC1 g/ml）中，有 11 株在 23 S rRNA 基因功能区发生 2 063 位 AG 突变和 2 064 位 AG 突变。由红霉素、阿奇 霉素、交沙霉素、奎奴普丁/达福普汀、替利霉素诱导 M129 的变异株在 23 S rRNA 基因功 能区发生两点突变，即 2 611 位，CA 突变；2 062 位，AG 突变。由氯洁霉素、替 利霉素诱导 M129 的变异株，在核糖体蛋白质 L4 有单个氨基酸的改变（H70R 或 H70L）, 同时加入链阳性菌素，其诱导的变异株，在 60 位会插入一个、二个或三个连续的氨基乙酸 21 。 Stakenborg 等22的实验表明，十六元环大环内酯类抗生素对 Mp 耐药菌株的 MIC 浓度为 816 g/ml,而对敏感菌株的 MIC 仅为 0.030.125 g/ml，十五元环大环内酯类 抗生素和氯洁霉素对 Mp 耐药菌株的 MIC 浓度超过 64 g/ml，而对敏感菌株仅为 0.060.5 g/ml。Mp 对十四元环大环内酯类抗生素的耐药是由于 23 S rRNA 基因发生 2 057 位 GA 的突变，另外，对大环内酯类耐药的 Mp 中亦发现 23 S rRNA 基因发生 2 058 位 AG 的点突变，但其核糖体蛋白质 L4 和 L22 没有发生变化。Okazaki 等22在体外 红霉素诱导产生的耐药 Mp 中，11 株均有 23 S rRNA 基因点突变，3 株发生 2 063 位 AG 突变，5 株发生 2 064 位 AG 突变，3 株发生 2 064 位 AC 突变。 3 结 语 本文从 Mp 的 p1 蛋白、p116 蛋白、高分子量蛋白、p65 蛋白等方面阐述了 Mp 黏附蛋 白的研究现状，随着从分子水平对 Mp 黏附细胞器研究的深入，可进一步探知黏附蛋白的 致病机制，为 Mp 感染疾病的治疗及预防提供理论依据。Mp 膜脂蛋白越来越受到关注，通 过 Mp 膜脂蛋白可探讨炎性反应机制。对大环内酯类抗生素耐药的 Mp 是近年研究的热点， 23 S rRNA 基因突变是导致 Mp 耐药的因素之一，随着认识的深入，从基因水平的全面研 究一定会取得新进展，从而解决临床因 Mp 耐药而带来的治疗问题。 【参考文献】 1 金倩;氯地酊联合激光治疗痤疮 158 例疗效观察J;广东医学;1997 年 10 期 2 董新亭,李卫莉,张随学;自拟粉刺消治疗痤疮 126 例J;中国中医药科技;1999 年 06 期 3 查旭山,陈修飏;寻常痤疮治疗体会J;江西中医药;/xyfm/class/.2002 年 05 期 4 张随学 ,谭正辉 ,孙叶梅 ,李梅 ,俞玉芳 ,韩峰;3003 例痤疮患者特征分析与控制对策J; 中华医学美学美容杂志;/xyfm/class/.2002 年 06 期 5 刘勇,王冬梅;痤疮的药物治疗J;临床医药实践杂志;2003 年 09 期 6 高宜云;痤疮从肝论治J;中医药临床杂志;2004 年 03 期 7 欧其平,林维山;中西医结合治疗痤疮J;中华皮肤科杂志;2004 年 09 期 8 陈五一;痤疮辨治体会J;世界中医药;/yisheng/main/index.php.2007 年 03 期 9 雷放;中药热敷治疗痤疮有效J;新中医;/book/main/index.php.1992 年 09 期 10 李东华;异维生素 A 酸治疗痤疮J;新医学 /;1993 年 10 期 11 黄灿奇;针刺联合中药内服外