药物中间体(s)-3-氯-1-苯丙醇的生物合成

抗抑郁药（抗抑郁药（R R）- -托莫西汀重要中间体托莫西汀重要中间体(S)-3-氯氯-1-苯丙醇的生苯丙醇的生 物合成物合成 浙江大学药学院 杭虎 【摘要】研究了微生物法制备光学纯(S)-3-氯-1-苯丙醇，对实验室已有菌种进 行了筛选，已选育了一株还原能力好的 B5#菌种。对其还原反应的条件包括温 度，底物浓度，菌种量和反应时间的影响进行了考察。最后反应的转化率达到 99.8%，对映体过剩值达到 100%ee 【关键词】3-氯-1-苯丙酮，(S)-3-氯-1-苯丙醇，B5#菌，不对称还原 1.1. 前前 言言 随着抑郁症困扰着越来越多的现代人，抗抑郁药物的合成业越来越受到人 们的重视。3-氯-1-苯丙醇，特别是(S)-3-氯-1-苯丙醇是合成托莫西汀、氟西 汀、尼索西汀等抗抑郁药物的重要中间体。目前，在国内尚无厂家能够提供 3- 氯-1-苯丙醇成品，可见，在以 3-氯-1-苯丙酮为起始原料合成托莫西汀、氟西 汀和尼索西汀合成路线中， 3-氯-1-苯丙酮还原成为 3-氯-1-苯丙醇是非常重 要的一步。拆分外消旋体 3-氯-1-苯丙醇，可以获得(S)-3-氯-1-苯丙醇，但是 拆分效率最大只有 45%，生产效率不高。以 3-氯-1-苯丙酮为底物采用化学法和 微生物法不对称还原底物中的羰基均可以得到(S)-3-氯-1-苯丙醇。化学法不对 称还原需要制备手性化学催化剂，价格昂贵，制备过程繁琐。采用微生物法不 对称还原乙酰乙酸叔丁酯可以获得对映体过剩值较高的光学纯(S)-3-氯-1-苯丙 醇，反应条件温和，环境友好，成本低廉，易于实现辅酶的原位再生，微生物 易于大规模培养，易于工业化生产，是(S)-3-氯-1-苯丙醇的绿色合成工艺。 本文主要研究了微生物法制备光学纯(S)-3-氯-1-苯丙醇，对其还原反应的 条件包括温度，底物浓度，菌种量和反应时间的影响进行了考察。最后反应的 转化率达到 99.8%，(S)-3-氯-1-苯丙醇对映体过剩值达到 100%ee 2 2.2. 材料和方法材料和方法 2.12.1实验材料实验材料 2.1.1 菌株菌株 实验室现有的 21 种菌种，分别是 B1#, B2#, B3#, B4#, B5#, B6#, B7#, B8#, B9#, B10#, B11#, B12#, B13#, B14#, B15#, B16#, B17#, B18#, B19#，B20#, B21#。 2.1.2 培养基培养基 斜面培养基：每升含麦芽汁 10 g，酵母粉 3 g，蛋白胨 5 g，葡萄糖 10 g，琼脂 20 g，pH 自然。 液体培养基：每升含葡萄糖 30 g，酵母粉 3 g，硫酸铵 5 g，MgSO4 7 H2O 0.25 g， K2HPO33 H2O 1 g，KH2 PO3 1 g，pH 自然。 2.1.32.1.3.试剂与仪器 3-氯-1-苯丙酮购自公司，外消旋的 3-氯-1-苯丙醇采用硼氢化钠还原 3-氯 -1-苯丙酮制得液相色谱仪为：安捷伦 1200，安捷伦科技有限公司。手性柱色 谱柱为：Daicel OD-H，Daicel 公司。 2.2 实验方法 2.2.1 菌体培养菌体培养 从斜面挑取一环菌体接种于 100 ml 液体种子培养基中，置于 30摇床(200 r/min)中培养 24h 得到种子液；以 10的接种量将菌体接种到 100 ml 液体发 酵 培养基中，置于摇床中培养 24 h 后用于生物转化。 2.2.2 转化反应转化反应 将 2.2.1 中获得的菌液离心分离，倾去上层清液，沉淀用去离子水洗涤两 次，将菌体分散在 20 ml 水中，加入一定量的底物，放入 30，200 r/min 的 摇床中转化 36h。 2.2.3 标准品制备标准品制备 3 实验方案：用硼氢化钠在无水乙醇中还原3-氯-1-苯丙酮，反应温度在5- 10，需要进行4个小时。然后在用乙酸中和，抽滤除去盐分，再减压浓缩，用 乙醚抽提，再用无水硫酸镁干燥后转入三口烧瓶中，减压浓缩，收集馏分。 2.2.4分析方法 转化反应结束后，转化液用等体积的乙酸乙酯萃取后离心分离，采用安捷 伦 1200 液相色谱检测乙酸乙酯萃取液中底物和两种构型产物的含量。色谱柱为 手性柱 DaicelOD-H(0.46m25 cm)；流动相：正己烷/异丙醇(95/5，V/V)；紫外 检测波长：240 nm；柱温：25；流速：1.0ml/mim；进样量：5l 2.2.5 数据处理方法 产物对映体过剩值的计算： 100% CC CC RS RS 产物的对映体过剩值 式中，CR：R 型产物的浓度；CS：S 型产物的浓度 摩尔转化率的计算： 式中，Ms：底物的分子量：Mp：产物的分子量；q：反应初始时底物的质量； P：反应结束时产物的质量。 3 3 结果和讨论结果和讨论 3.1 检测方法的建立 分别对底物标准品以及产物的标准品进行检测，得到了如下的结果。 4 3.1.1 底物标准品的检测 图 3.1 底物标准品液相色谱图 如图 3.1 所示，3.837min 为溶剂乙酸乙酯峰，7.462min 为底物 3-氯-1-苯丙 酮峰，其余为杂峰，分析得 可能为乙酸乙酯中的一些杂质。 3.1.2 产物标准品的检测 图 3.2 产物标准品液相色谱图 如图 3.2 所示，3，843min 为溶剂乙酸乙酯峰，7.822min 为底物 3-氯-1-苯丙酮峰， 10.626min 为(R)-3-氯-l-苯丙醇峰，12.001min 为(S)-3-氯-l-苯丙醇峰，其余为杂峰。由此可 见，用化学合成的方法还原 3-氯-l-苯丙酮存在着如下的几个问题：产物为消旋品，不能得 到单一构型的某一种产物。反应不彻底，底物未完全转化。杂峰很多说明化学发法副产物 较多，得到的成品不纯。 3.2 菌种的筛选菌种的筛选 将培养好的 21 种酵母细胞分别用于还原 3-氯-l-苯丙酮的反应。将 2.8g 酵 母细胞分散在 20 ml 水中，底物 3-氯-l-苯丙酮的初始浓度为 0.04g/ml，置于 30，200 r/min 的摇床中反应 36h。反应结束后用适量的乙酸乙酯萃取底物和 产物，用高效液相色谱检测含量。 菌种构型转化率( % )ee 值( % ) 5 B1S50.1524.02 B2S65.7535.75 B3R80.2840.28 B4S25.0325.03 B5S74.54100 B6R 22.90 22.90 B7R33.7633.76 B8S 32.5628.91 B9R 16.7863.13 B10S54.3010.58 B11R13.0956.42 B12S17.9770.47 B13S40.4448.24 B14R26.8967.90 B15S13.9775.08 B16S34.8372.80 B17S21.9121.91 B18R36.5136.51 B19S22.8022.80 B20S29.2729.27 B21S14.5410.55 由于酵母细胞中分别将底物还原成 R 型和 S 型产物的酶含量不同，所得产 物的构型、转化率和对映体过剩值也不同。结果表明，B5#还原底物得到的 S 构型的产物对映体过剩值最高，且还原转化率较高。 3.3 底物浓度对转化反应的影响底物浓度对转化反应的影响 由于受反应体积和微生物本身酶量的限制，不同的第五浓度对反应的转化率 及对映体过剩值都会有一定的影响，因此本实验考察了底物浓度对转化反应的 影响。分别取培养好的 B5#湿菌体洗涤后分散在 20mL 水中，生物量为 0.14g/mL。5 瓶反应体系中底物浓度分别为 0.010g/mL、0.015g/mL、0.020g/mL、0.025g/mL、0.030g/mL，置于 30，200 r/min 的摇床中反应 36h，结果如表所示 底物浓度( g/mL )转化率( % )ee 值( % ) 0.01075.6100 0.01579.5100 6 0.02053.198.5 0.02547.298.1 0.03035.497.8 由表可见，反应的转化率随底物浓度的增加而迅速下降，转化率不高的原因 可能是由于底物浓度过高对微生物存在毒害作用，对羰基还原酶的活力存在抑 制作用。 3.4 时间对转化反应的影响时间对转化反应的影响 分别取培养好的 B5#菌体洗涤后分散在 20ml 水中，生物量为 0.14g/mL。5 瓶 反应体系中底物浓度为 0.015g/mL，置于 30，200 r/min 的摇床中分别反应 12h，24h，36h，48h，60h，HPLC 检测转化率及对映体过剩值，结果如下表： 反应时间( h )转化率( % )ee 值( % ) 1220.197.3 2450.999.3 3678.7100 4872.4100 6069.8100 反应 36h 时，转化率已接近最大值，继续延长反应时间，转化率没有大的变 化，其原因可能是一定量的产物对还原过程存在抑制作用。根据以上实验数据， 可以确定最适反应时间为 36h。产物(R)-3-氯-l-苯丙醇的对映体过剩值随反应 时间的变化不大，均为接近 100ee。 3.5 温度对转化反应的影响温度对转化反应的影响 本实验考察了温度对转化反应的影响。分别取培养好的 B5#湿菌体洗涤后分 散在 20ml 水中，生物量为 0.14g/mL。5 瓶反应体系中底物浓度为 0.015/mL， 置于 200 r/min 的摇床中反应 36h，温度分别控制为 20，25，30，35， 40，HPLC 检测转化率及对映体过剩值，结果如下表： 温度对转化反应的影响 反应温度( )转化率( % )ee 值( % ) 2040.1100 2560.9100 3077.3100 3529.8100 405.8100 当转化温度升高到 35时转化率明显下降，其主要原因是较高的温度可使羰 基还原酶失活速率加快，由此得出反应的最适温度为 30。在实验的各种温度 条件下产物的对映体过剩值均为 100ee。 7 3.6 辅助底物对转化反应的影响辅助底物对转化反应的影响 微生物法还原都需要辅酶(coenzymes or cofacters)的参与，以进行化学当量的 还原或氧化，可逆地催化还原酮(或醛)羰基。大多数的氧化还原所需的辅酶是 NADH(辅酶 I)或 NADPH(辅酶 II)。由于酶催化的氧化还原反应需要价格昂贵的 辅酶，往往需要高代价使其再生循环，这样利用全细胞进行反应显得更加方便 实用。微生物细胞含有可以接受广泛非天然底物的多种脱氢酶、所有必需的辅 酶和再生途径，这样辅酶循环可由细胞自动完成。进行不对称还原反应时也可 以加入少量廉价的碳源(如蔗糖和葡萄糖)作为辅助底物实现辅酶的再生。由于 辅酶在生物转化的过程中其着十分重要的作用，因此，本实验考察了两种辅酶 对转化反应的影响。 3.6.1 葡萄糖对转化反应的影响葡萄糖对转化反应的影响 分别取培养好的 B5#湿菌体洗涤后分散在 20mL 水中，生物量为 0.14g/mL。5 瓶反应体系中底物浓度为 0.015/mL，置于 30，200r/min 的摇床 中反应 36h，葡萄糖浓度分别控制为 0.02 g/mL，0.04 g/mL，0.06 g/mL，0.08 g/mL，0.10 g/mL，HPLC 检测转化率及对映体过剩值，结果如表 葡萄糖对转化反应的影响 葡萄糖浓度( g/mL )转化率( % )ee 值( % ) 0.0292.0100 0.0495.9100 0.0694.3100 0.0890.7100 0.1088.9100 加入葡萄糖对反应的转化率有明显的提高，考察葡萄糖添加量可得，当葡萄糖浓度为 0.04g/mL 时，转化率最高。在实验的各种温度条件下产物的对映体过剩值均为 100ee。3.6.2 乙醇对转化反应的影响乙醇对转化反应的影响 分别取培养好的 B5#湿菌体洗涤后分散在 20mL 水中，生物量为 0.14g/mL。5 瓶反应体系中底物浓度为 0.040/mL，置于 30，200r/min 的摇床 中反应 36h，乙醇的体积分数分别控制为 2.50%，5.00%，7.50%，10.0%，12.50%， ，HPLC 检测转化率及对映体过剩值， 结果如表: 乙醇对转化反应的影响 乙醇体积分数( % )转化率( % )ee 值( % ) 2.5094.7100 5.0099.8100 7.5093.6100 10.093.0100 12.592.6100 8 加入乙醇对反应的转化率有明显的提高，考察乙醇添加量可得，当乙醇体 积分数为 5%时，转化率最高。在实验的各种温度条件下产物的对映体过剩值均 为 100ee。 比较葡萄糖与乙醇对转化反应的影响来看，两者都对反应的转化率有明显的高且产物 的对映体过剩值均为 100%。但是比较而言，一醇对反应转化率提高的更加明显，其原因 可能为乙醇不仅起着辅酶再生的作用，而且对于底物有一定的溶解作用，使其转化率提高 较多。 3.7 产品的分离纯化产品的分离纯化 从微生物转化液中得到的(S)-3-氯-l-苯丙醇粗品中含有发酵过程中产生的杂质以及没有 反应完全的底物，需要对其进行分离纯化。以酵母 B5#还原 3-氯-l-苯丙酮得到(S)-3-氯-l-苯 丙醇的转化液为原料，采用有机溶剂萃取和硅胶柱层析相结合的方法分离纯化(S-3-氯-l-苯 丙醇。 小小 结结 本研究以 3-氯-l-苯丙酮为底物，用微生物转化法不对称还原底物制备了(S)- 3-氯-l-苯丙醇，通过对实验室保藏菌种进行筛选，并对还原条件及分离纯化工 艺进行优化，得到了高转化率、高纯度且对映体构型单一的产物。 ( 1 ) 对 3-氯-l-苯丙酮还原能力菌种的筛选及还原条件的优化 酿酒酵母 B5#可将 3-氯-l-苯丙酮还原为(S)-3-氯-l-苯丙醇。采用初始自然 pH 的液体培养基培养的酵母细胞用于 3-氯-l-苯丙酮的不对称还原，得到的(S)- 3-氯-l-苯丙醇对映体过剩值可以达到 100ee。反应转化率随底物浓度的提高而 迅速下降，以 0.04g/mL 葡萄糖为辅助底物，反应温度为 30，反应时间为 36h，底物浓度为 0.015g/mL，生物转化转化率及对映体过剩值可分别达到 99.8和 1 00ee。 ( 2 ) 从微生物转化液中得到的(S)-3-氯-l-苯丙醇粗品的分离纯化 用硅胶柱层析法对微生物转化液中得到的(S)-3-氯-l-苯丙醇粗品进行分离纯 化，确定最佳洗脱条件为：石油醚/丙酮=50：1(V/V)，上样量为 4.8 mg/mL 硅 胶，流速为 1.5mL/min，径高比为 1:12。分离纯化后产品(S)-3-氯-l-苯丙醇的纯 度为 98.2，对映体过剩值为 100%。 9 参考文献参考文献 1Robertson K，Wayne D，Greenwood D，etal1-phenyl-3-phthalenyloxyproan-amines P 02