乳酸杆菌ppt课件

重组hCG乳酸杆菌对小鼠阴道粘 膜免疫的效果 李大金 复旦大学妇产科研究所 避孕疫苗：安全、方便、不影响生殖内分泌 精子抗原、 hCG 、卵透明带、FSH Talwar, hCG-HSD疫苗 有效：50ng/ml hCG结合力 可逆： 35ng/ml, 内源性hCG无免疫原性 有效率：80-85% 原因：载体；免疫途径 系统免疫(1/10)、粘膜免疫 研究现状: 抗原 Dome T cell zoneB cell zone Surface IgA+ B Activated B Resting B CD4+ T-nave CD4+ T activated CD4+ T memory CD8+ CTLs MALT 血液 归巢 粘膜效应部位： 胃肠道 上呼吸道 泌尿生殖道 腺体 M cell lympoepithelium 共同粘膜免疫机制 活疫苗载体在粘膜部位持续表达抗原 细菌/ 病毒减毒株：减毒沙门氏菌、Bordetella pertussis，呼吸道合孢病毒等 细菌/ 病毒减毒株有潜在致病能力 乳酸杆菌是人体正常菌群，具有GRAS(generally regarded as safe)特性 阴道、肠道常驻菌，拮抗致病菌 在粘膜局部定居并持续表达抗原 避免体细胞表达抗原时可能的基因突变 方便、易于接受 用乳酸杆菌在生殖道局部表达外源蛋白并刺激产生 抗原特异性抗体 至今未见报道 乳酸杆菌表达抗原经粘膜免疫 可用乳酸杆菌表达多种细菌蛋白： 几丁质酶，噬菌体胞 壁水解酶，果聚糖酶，超氧化物歧化酶 S-层蛋白表达信号 获得了240mg/L表达效率 膜锚定序列将目的蛋白锚定在胞膜上 从未表达过哺乳动物功能蛋白 乳酸杆菌基因工程的发展 G细菌 不存在周质空间，可直接从上清中 获得分泌性表达的目的蛋白 优势 劣势 不易裂解，质粒抽提效率低 外源基因导入困难(不接受连接混 合物；需大量纯化的质粒：电转 一次，500ng) 无商品化的工具 乳酸杆菌基因工程的挑战： 整合型表达载体pIlac、表达菌Lb casei CECT5276 优点： 可在大肠杆菌中高拷贝 的扩增，便于基因克隆 ；获得大量纯化质粒， 使得转化方便 介导外源基因整合入宿 主菌的基因组中，稳定 表达；红霉素耐药基因 可自发缺失，安全 TAAAAAGGAGGCTGCAGCATATGCCCGGGGAATTCAATCGGAGGGAATG RBS PstI NdeI SmaI EcoRI LacF LacG ori Ap Em pIlac 4895bp 基因组DNA 基因组DNA 基因组DNA 目的基因 目的基因 Ery Ery 目的基因 目的基因 pIlac pIlac 研究目的： 构建乳酸杆菌hCG 稳定表达株 乳酸杆菌在小鼠阴道内表达hCG抗原 经阴道免疫小鼠，以在生殖道局部刺激产生抗hCG抗体 第一部分 hCG抗原在乳酸杆菌的分泌性表达 构建质粒pIlac-hCG 电穿孔转化乳酸杆菌 获得重组hCG 乳酸杆菌稳定表达株 技术路线: PCR扩增670bp片段并测序 与hCG基因连接 PCR扩增信号肽+ hCG 将信号肽+ hCG克隆入pIlac, 得到 pIlac hCG pIlac-hCG 的构建: EcoRI KpnI 670bpS-层蛋白表达信号 pUC18 KpnI BamHI XbaI HindIII EcoRI/KpnI双酶切 pUC18A EcoRI KpnI PCR Lb DNA 连接 EcoRI S-层蛋白表达信号 扩增670bp的S-层蛋白表达信号 S-层蛋白表达信号序列测序及blast 结果 agctgaagcagtcgttgaaacggcagcaacaccagcaaagctcaatgcggcaaggcccaa agctgaagcagtcgttgaaacggcagcaacaccagcaaagctcaatgcggcaaggcccaa gtaaagagatttctttaaacttgattgcataatttttcttcctccaaacataaaatatgc gtaaagagatttctttaaacttgattgcataatctttcttcctccaaacataaaatatgt aatttatcaagcaagaatagtataaccgaagttagcgcttttgttaagaaatttattcga aatttatcaagcaagaatagtataaccgaagttagcgcttttgttaagaattttatttca taacatcagcggacccgatcagctatcccctaactacgaagataagtatagcgatttcct taacattagcggacccgatcagctatcccctaactacgaagataagtatagcgatttcct taaggagatacaaggattacgccctgattgtcgttggattgaaacaattatgggtatcct taaggagatacaaggattacgctctgattgtcgttggattgaaacaattatgggtgtcct gtaatgttattgttacataactaaaagtctactaacctgcttaaagcctttgtaa gtaatgttattgttacataactaaaacgtcactaacctgcttaaagcctttgtaa 扩增S层蛋白信号肽序列hCG HindIII BamHI hCG KpnI pUC18A EcoRI KpnI BamHI S-层蛋白表达信号 pBShCG KpnI BamHI hCG EcoRI BamHI S-层蛋白表达信号 hCG 连接 KpnI BamHI双酶切 NdeI 信号肽 hCG EcoRI PCR S层蛋白信号肽序列hCG融合产物测序及blast分析 与S-层蛋白序列比较： atgcaatcaagtttaaagaaatctctttacttgggccttgccgcattgagctttgctggt 103 atgcaatcaagtttaaagaaatctctttacttgggccttgccgcattgagctttgctggt 327 gttgctgccgtttcaacgactgcttcagct 133 gttgctgccgtttcaacgactgcttcagct 357 agacaaggcaggggacgcaccaaggatggagatgttccaggggctgctgctgttgctgct 237 agacaaggcaggggacgcaccaaggatggagatgttccaggggctgctgctgttgctgct 60 gctgagcatgggcgggacatgggcatccaaggagccgcttcggccacggtgccgccccat 297 gctgagcatgggcgggacatgggcatccaaggagccgcttcggccacggtgccgccccat 120 caatgccaccctggctgtggagaaggagggctgccccgtgtgcatcaccgtcaacaccac 357 caatgccaccctggctgtggagaaggagggctgccccgtgtgcatcaccgtcaacaccac 180 catctgtgccggctactgccccaccatgacccgcgtgctgcagggggtcctgccggccct 417 catctgtgccggctactgccccaccatgacccgcgtgctgcagggggtcctgccggccct 240 gcctcaggtggtgtgcaactaccgcgatgtgcgcttcgagtccatccggctccctggctg 477 gcctcaggtggtgtgcaactaccgcgatgtgcgcttcgagtccatccggctccctggctg 300 cccgcgcggcgtgaaccccgtgggtctcctacgccgttggctcttagctgtcaatgtgca 537 cccgcgcggcgtgaaccccgt-ggtctcctacgccg-tggctctcagctgtcaatgtgca 358 与hCG序列比较： NdeI 信号肽 hCG EcoRI pIlac P SD PstI NdeI SmaI EcoRI NdeI/EcoRI ligate pIlac hCG P NdeI EcoRI 信号肽 + hCG pIlac hCG的构建 pIlac质粒在不同电压下的转化效率 pIlac hCG和pIlac 的转化效率比较： 1200v 1500v 乳酸杆菌基因组hCG整合基因鉴定 2000 750 500 250 100 Lb. casei hCG分泌性表达动态变化 乳酸杆菌表达hCG的分布 重组hCG乳酸杆菌培养上清免疫印渍分析 97KDa 66 KDa 45 KDa 30 KDa 20.1 KDa 14.4 KDa 红霉素耐药基因的重组缺失及建立稳定表达株 在无红霉素的MRS传50代后 在5g/ml红霉素的MRS平板上无生长 而未经传代的细菌可生长 说明红霉素耐药基因已自发缺失 Lb. casei hCG稳定菌株体外分泌hCG动态观 察 外源基因hCG整合对 Lb. casei 生长状态的影响 外源基因hCG整合对 Lb. casei培养上清pH值 的影响 葡萄糖对乳酸杆菌hCG表达的影响 乳糖对乳酸杆菌hCG表达的影响 pH值对乳酸杆菌hCG表达的影响 在无选择压力下培养50代并经2次冻存、复苏后，上 清中hCG浓度仍可达到 250 mIU/ml 红霉素耐药基因已自发缺失，可安全地应用于人体 更有效地裂解乳酸杆菌 较简便的电穿孔方法: 105转化子/ugDNA S层蛋白信号肽序列引导分泌 为用乳酸杆菌在阴道内表达功能蛋白奠定了基础 Lactobacillus casei CECT5267稳定、分泌、高效 表达了hCG蛋白： 小结1： 第二部分 表达hCG的乳酸杆菌对BAL B/c小鼠阴 道免疫及其免疫效果 免疫印渍鉴定hCG蛋白: 97KDa 66 KDa 45 KDa 30 KDa 20.1 KDa 14.4 KDa 转染COS-7细胞：180mIU/ml Lb. casei hCG经阴道免疫产生 抗hCG IgA抗体 109108107 109 Lb. casei hCGLb. casei pIlac 阴性对照 DNA免疫或经阴道免疫在阴道粘膜免疫效应 hCG特异性外周淋巴细胞体外增殖试验 外周免疫活性细胞在hCG抗原刺激下 IFN-和IL4分泌 粘膜免疫在对抗病原体入侵中发挥重要作用 脊髓灰质炎口服疫苗；伤寒、霍乱、流感、HIV 粘膜免疫途径：口服、喷鼻、阴道接种 沙门氏菌表达精子抗原用于免疫避孕（潜在致病能力） 乳酸杆菌表达抗原用于免疫避孕未见报道 讨论： 重组菌可在阴道粘膜局部定居并分泌hCG抗原 经