hbv基因定量分析技术的应用价值、存在问题及展望--hbv基因定量分析技术的应用价值(1)

HBVHBV 基因定量分析技术的应用价值、存基因定量分析技术的应用价值、存 在问题及展望在问题及展望-HBV-HBV 基因定量分析技术基因定量分析技术 的应用价值的应用价值(1)(1) 近年来 HBV 基因定量分析的价值受到越来越多研究者的重 视1。过去由于过分强调了 HBV 感染后过强的细胞免疫应 答介导肝细胞损伤，忽视了对病毒复制水平与致病性之间 因果关系的研究。目前普遍认为，尽管 HBV 不直接破坏寄 生细胞，但病毒的活跃复制是启动或激发肝脏组织炎症反 应的因素。这表明确定感染者体内 HBV 复制状态，即从 HBV 基因定量的角度作病情分析是十分有意义的。事实上，真 正引起人们关注 HBV 基因定量分析价值的重要原因是最近 发现了干扰素治疗与 HBV 基因水平两者之间有非常密切的 关系。HBV 基因定量分析还在转基因动物、基因治疗、蛋白 疫苗和核酸疫苗、抗 HBV 药物体外试验和动物试验及耐药 研究、流行病学研究、HBV 血液制品污染监测等方面具有重 要的应用价值。 一、HBV 基因定量分析在干扰素治疗中的应用 尚无药物可以清除所有 HBV 感染者体内 HBV 颗粒。干扰素 是目前唯一有一定疗效的一类生物制剂2,它在病毒等诱 导下由几种相关细胞产生，并发挥抗病毒作用。但是无论 使用何种干扰素，也无论治疗剂量或疗程如何，干扰素治 疗后 HBV 转阴率迄今仍保持在 40%左右，无法进一步提高， 究竟有哪些制约因素起作用尚无定论。 近年来发现干扰素的治疗效果，即干扰素治疗后的反应性 很大程度上取决于 HBV 在体内的复制水平2,3。以下几点 事实值得注意:治疗前 HBV 低水平复制者的反应性明显优 于高水平复制者。HBV 转阴的几乎都是那些治疗前血清 HBVDNA 含量较低者，而治疗前 HBVDNA 含量特别高者大多没 有疗效；治疗中病毒复制水平迅速降低者，有望治愈。 相反，治疗期间 HBV 基因水平下降较慢，或下降幅度较小， 或变化不明显者，大多是无效者；治疗结束后，采用 PCR 定量法检测，HBVDNA 完全转阴者可能不再复发，而终止治 疗后 HBVDNA 仍保持较低水平者，反跳的可能性较大。可见， 使用干扰素治疗 HBV 感染时，在各种近期和远期疗效指标 中，除了病人的临床表现是否好转，生化指标是否改善， 肝组织炎症反应是否减轻等以外，血清 HBVDNA 定量分析是 一个十分重要的观察项目。从现有研究资料看，除病理检 查外，HBVDNA 定量检测，也许是干扰素治疗效果判断依据 中最直接、最可靠和最有价值的指标。多数研究者认为， 通过 HBVDNA 定量分析来指导干扰素治疗，有重大意义。首 先，在治疗对象的选择方面，即确定干扰素治疗适应症时， 应对各侯选病例在某个时间段内定期反复检测 HBVDNA 水平， 那些长期保持 HBV 高复制水平者不宜接受干扰并素治疗， 或应当联合治疗；其次，干扰素治疗期间，可根据 HBV 基 因水平的动态变化适时调整治疗剂量，决定是否缩短或延 长疗程，及是否终止治疗。这不仅对制订合理的治疗方案， 也对减轻病人负担，避免不恰当用药有指导意义4。笔者 认为，目前国际上普遍采用的所谓“六个月疗程”及某些 中高剂量治疗方案均缺乏充分和足够的立论依据，有必要 结合基因定量分析结果，重新评价和制订干扰素治疗计划； 最后，干扰素治疗结束后，对有反应者定期作定量分析， 有助于发现复发者，并根据血清 HBVDNA 含量波动情况决定 是否实施再治疗。有人报告，首次干扰素治疗有效者，再 治疗的效果亦佳。如果第一次治疗无反应或反应较差者， 第二次干扰素治疗仍不能取得理想疗效5。 二、HBV 基因定量分析的其他临床价值 HBV 感染后，在临床表现方面的差异非常明显,可以表现为 无症状携带者、急性肝炎、慢性肝炎、暴发型肝炎、肝硬 化及肝癌等多种疾病状态。病毒在肝细胞内的复制水平与 各种临床疾病状态之间可能存在着某些必然联系。由于 HBV 基因定量技术的发展和成熟，目前已有可能从某些现象上 阐明 HBV 复制与致病性之间的“量效”关系。 “无症状携带者”可能为活动性乙肝患者6。有部分 HBV 感染者，由于免疫耐受或其它原因，体内 HBV 呈复制不 活跃的“潜伏”状态，但并不意味着不存在进行性肝损害。 Mels 等研究发现无症状携带者在其自然发展史上，HBV 复 制处于波动状态，时有加剧，病毒复制积累到一定程度后 ALT 水平增加。一般规律是:血清 HBVDNA 水平上升ALT 活 性增加IgM 抗 HBc 滴度提高。因此无症状携带者应采取积 极治疗措施，否则这类人群不仅作为重要的病毒库传播 HBV，而且由于隐匿性肝细胞损伤的不断积累，不经过慢性 肝炎阶段，直接向肝硬化和肝癌发展。 HBVDNA 水平与 HBV 感染者病情和预后的关系密切。上述 无症状携带者是一个特殊群体。而对那些急性和慢性乙型 肝炎患者而言，HBVDNA 水平对预后判断有帮助。研究发现 HBVDNA 一直保持较高水平的急性肝炎患者易慢性化，而 HBV 复制水平较高的慢性肝炎患者不仅对干扰素治疗的反应 性差，而且肝组织炎症反应更明显，病情更重，更易发生 肝硬化和肝癌。目前在能否用血清 HBVDNA 水平来判断肝组 织炎症损伤程度这类问题上尚有争议。动物实验表明，鸭 肝被 DHBV 广泛感染的同时，并不伴随明显病毒血症,肝细 胞清除病毒的同时也无病毒血症加重的证据7。然而最近 有人对 HCV 感染者进行基因定量分析研究，发现 HCVRNA 水 平与 ALT 水平以及肝脏 knodell 分级之间有密切关系8。 肝移植者 HBVDNA 定量的意义 Mazzaferro 等报告肝移植前患者血清 HBVDNA 水平的高低决 定移植后肝脏是否再感染 HBV9。作者观察到，14 例移植 前血清 HBVDNA 含量低于 103 拷贝/ml，移植后不间断地采 用 HBsAb 免疫预防，随访 36 个月，无一例再发肝炎，但另 外两例移植前病毒拷贝数大于 105/ml 则发生了严重 HBV 再 感染。建议移植前使用抗 HBV 药物，最大限度降低血清 HBVDNA 浓度，有助于防止 HBV 侵犯移植后肝脏，提高肝脏 移植的效果。 前核基因突变 HBV 定量意义 HBV 前核基因突变可导致 HBeAg 表达缺失。感染不表达 HBeAg 的 HBV 突变株，或野生型 HBV 在体内突变并成为优势 株均产生较严重的后果，如易发生暴发性肝炎，预后差， 干扰素治疗无效等9,10。目前已能采用核酸序列测定技 术、PCR 技术、限制性片段长度多态性分析技术等来定性检 测 HBV 前核基因突变。最近 Baxall 建立了一种 PCR 及产物 的显色反应点突变分析技术，用来定量分析突变前核基因， 有助于进一步探讨 HBV 突变与致病性之间的关系11。 基因定量分析是一项临床应用型技术，但对基础研究也有 一定的应用价值12，尤其是在当前基因治疗、转基因动 物、核酸疫苗等热点研究领域，基因定量分析可能是一种 很好的辅助手段，对发现一些有意义的现象也许有一定帮 助。比如 HBV 在转基因小鼠组织脏器分布规律可用定量标 准来衡量，以及用定量手段观察各种药物、细胞因子和其 它物质对转基因小鼠 HBV 基因复制的调节作用。又如对核 酸疫苗注入肌组织后的各种动力学变