不同浓度sn对aa大鼠滑膜细胞表达课件

正清风痛宁治疗类风湿关节炎 临床与作用机制研究 国家中医药管理局重点中西医结合风湿病专科 第三军医大学西南医院风湿病诊疗中心 方勇飞 正清风痛宁有效成份为盐酸青藤碱 以青风藤为原料提取 本草纲目称青风藤“主治风疾，风湿流注，历节鹤 膝” 本草汇言记载：“青风藤散风寒湿痹之药也，能舒 筋活血，久服必大建奇功” 。 。 青藤碱的特性 青藤碱(sinomenine,SN)是从青 风藤根茎中分离提取的一种单 体生物碱。 药用多为其盐酸盐，分子式 C19H23NO4，分子量329.38。 从化学结构上看，由氢菲核和 乙胺桥组成，结构类似吗啡 青藤碱抗炎抑制免疫的机制研究 国家自然科学基金（30300452）、重庆市 中医药基金（2003C77）及正清基金资助 本项目研究目标 与氨甲喋呤（MTX）相比较，初步探讨SN对胶 原诱导性关节炎（CIA）小鼠的关节积分，IFN -，抗型胶原抗体的影响 初步探讨SN对佐剂性关节炎（AA）及CIA大鼠 滑膜细胞表达与分泌IL-1、TNF-、IL-10的 影响；从NF-B信号通路中相关环节来探讨其 具体的抗炎机制及可能的量效关系 研 究 方 法 本研究分三部分 第一部分：建立CIA小鼠关节炎模型，行关节评分；夹 心ELISA法检测脾细胞分泌IFN-的能力；间接ELISA法 检测血清中抗型胶原抗体的水平，同时与MTX相比较 第二部分：建立AA及CIA大鼠模型，分离培养大鼠双膝 滑膜细胞，运用反转录-PCR检测IL-1、TNF-、IL-10 的mRNA表达、EMSA检测NF-B的DNA结合活性、免疫印 迹检测IB-的表达，间接免疫荧光法检测P65的核转 位情况 第三部分：临床研究：ELISA检测RA中IL-1、TNF-、 IL-10及CCP抗体经SN或MTX治疗前后的变化 第一部分 研究结果 正常DBA/1小鼠关节正常（A），其后爪的H lane 2 contrl; lane 3 AA; lane 4 AA+ SN 30g/ml; lane 5,AA + SN 60g/ml; lane 6, AA+ SN 120g/ml. SN对AA大鼠滑膜细胞IB-表达的影响 lane1lane2lane3lane4lane5 lane 1 contrl; lane 1 AA; lane 3 AA+ SN 30g/ml; lane 4,AA + SN 60g/ml; lane 5, AA+ SN 120g/ml. SN对关节炎大鼠滑膜细胞P65核转位的影响 正常对照 关节炎PDTC阳性对照组 50uM SN 500uM SN 细胞NF-B信号通路的调控作用 第二部分初步结论 SN通过抑制NF-B活性及IB-的降解而呈 浓度依赖性地下调关节炎大鼠滑膜细胞内 TNF- mRNA、IL-1 mRNA的表达 SN对关节炎大鼠滑膜细胞内IL-10 mRNA的 表达亦呈下降趋势，但无浓度依赖性 SN可呈浓度依赖性地抑制关节炎大鼠滑膜 细胞P65的核转位 第三部分 研究结果 SN或MTX对RA患者血清TNF、IL-10 及CCP抗体的影响 SN或MTX对RA患者血清TNF-a、IL- 1、IL-10及CCP抗体的影响 与正常对照组相比，RA患者血清中TNF-含量明显增加， CCP抗体的相对滴度显著增高（P0.05） SN或MTX在治疗后1月及2月时均能显著降低RA患者血清中 TNF-的含量（P0.05） RA患者有较高的IL-1的表达， SN或MTX在治疗1月及2月 后IL-1beta的含量明显降低（低至无法检测出，未用图表显 示） SN可通过降低RA患者中TNF- 、 IL-1 的含量而治疗类风 湿关节炎 青藤碱对类风湿关节炎患者滑膜细胞 凋亡的影响及机制的研究 重庆市中医药基金（2003C77）、正清基金资助 本项目研究目标 初步探讨SN对RA患者滑膜细胞的致凋亡 及抑制增殖作用 进一步探讨SN对RA患者滑膜细胞凋亡蛋 白Bcl-2表达及细胞周期的影响，以了解 其诱导凋亡的相关机制 研 究 内 容 收集RA患者滑膜组织（由我院关节外科中心提供），培 养滑膜细胞，观察滑膜细胞形态，并测定其生长曲线 凋亡效应的研究：SN对滑膜细胞增殖的抑制及致凋亡作 用 凋亡机制的研究：凋亡蛋白Bcl-2的表达及滑膜细胞周 期的变化 滑膜细胞形态 成纤维样滑膜细胞光镜下的结构40 光镜下见呈梭形或柱形，细胞核呈卵圆形， 位于细胞中央，核仁明显 滑膜细胞生长曲线 RA滑膜细胞接种后第7天数量达到高峰 滑膜细胞凋亡效应的研究 一、MTT法检测SN对RA滑膜细胞的增殖抑制作用 滑膜细胞加药处理后OD值均明显低于于未加药组（P0.01,n=5） 二、光镜下RA滑膜细胞凋亡形态 加药后部分细胞由贴壁脱落而呈悬浮生长，贴壁能力减弱，细胞形态变圆，体积 缩小，核固缩出现。3.2mmol/LSN作用48h组尤为明显。不含药培养液培养的对照 组细胞贴壁生长，几乎无脱落，胞浆饱满，生长舒展，相邻细胞生长融合成片 RA滑膜细胞光镜下的结构 40 3.2mmol/LSN作用滑膜细胞48h 40 三、荧光显微镜下RA滑膜细胞凋亡形态 荧光显微镜下见正常对照组细胞核较大，呈均匀弥散荧光；处理组细胞出现典型的凋 亡核形态学改变，表现为核体积缩小，大小不一，染色不均匀，呈致密浓染的颗粒或 块状增强荧光 正常滑膜细胞核 （200） 青藤碱终浓度2.8mmol/L（200） 12小时 24小时 48小时 青藤碱终浓度3.0mmol/L（200） 12小时 24小时 48小时 青藤碱终浓度3.2mmol/L（200） 12小时 24小时 48小时 四、流式细胞仪检测滑膜细胞凋亡率 滑膜细胞加药处理后凋亡细胞百分率均明显高于未加药组（P0.05,n=5 ） 结 果 uMTT法显示2.8mmol/L、3.0mmol/L、3.2mmol/L的SN作用24、48 h能够抑制滑膜细胞增殖，其中以3.2mmol/L作用48h最明显 u光镜、荧光显微镜下发现2.8mmol/L、3.0mmol/L、3.2mmol/L 的SN分别作用后滑膜细胞出现凋亡表现，如细胞变圆、胞体皱 缩、细胞核荧光染色增强等 u不同浓度的SN分别作用于滑膜细胞，凋亡率呈浓度依赖性，与 对照组比较有显著差异(P0.05)，其中3.2mmol/L浓度的SN作 用48h对滑膜细胞凋亡影响最为显著 滑膜细胞凋亡机制的研究 一、SN对RA滑膜细胞周期时相分布的影响 不同浓度SN作用RA滑膜细胞48h对G0/G1期的影响（xs，n=5） SN（mmol/L） G0/G1（） t P 正常对照 85.98600.8125 2.8 88.13401.5070 2.743 P=0.0230.05 3.0 89.64603.1585 2.509 P=0.0360.05 3.2 92.09001.6589 7.389 P=0.0000.01 不同浓度SN作用RA滑膜细胞48h对S期的影响（xs，n=5） SN（mmol/L） S（） t P 正常对照 0.8540.6172 2.8 1.20400.4202 1.048 P=0.3250.05 3.0 1.18400.6744 0.807 P=0.4430.05 3.2 1.11800.4437 0.777 P=0.4600.05 不同浓度SN作用RA滑膜细胞48h对G2/M期的影响（xs，n=5） SN（mmol/L） G2/M（） t P 正常对照 13.16201.2309 2.8 10.66401.2241 3.218 P=0.0120.05 3.0 9.17602.7400 2.967 P=0.0180.05 3.2 6.79001.8416 6.432 P=0.0000.01 不同浓度SN对RA滑膜细胞作用48h，实验结果表明G0/G1期的 细胞百分比逐渐增加（P0.05）；S期细胞百分比无明显变化 ；G2/M期比例显著减少（P0.05） 二、Bcl-2蛋白表达水平的变化 经流式细胞仪检测Bcl-2蛋白的表达随药物浓度的增加而下降 * * 20 30 40 50 60 70 80 Bcl-2 （） NC 2.8 3.0 3.2 SN concentration （mmol/L） （注：*与对照组比较P0.01） 结 论 1.SN可诱导RA患者滑膜细胞凋亡 2.SN阻滞G1期细胞向S期移行，并下调Bcl-2 基因的表达，这可能是SN诱导RA滑膜细胞 凋亡机制之一 盐酸青藤碱对类风湿关节炎患者 CD28/CTLA-4表达的影响 辅助刺激分子CD28/CTLA-4在RA中 的表达及临床相关性研究 实验方法： u32例RA患者外周血和16例双关节积液 u流式细胞学技术 uSpearman相关分析 结 果 CD3+CD28+ /CD3+CTLA-4+ 在RA病人PBMC上的表达 CD3+CD28+/CD3+CTLA-4+ 在RA病人SFMC上的表达 RA患者PBMC和SFMC上CD3+CD28+和 CD3+CTLA-4+的表达 :P0.01,vs control group； * P:0.05，* P:0.01，RA-PBMC group vs RA-SFMC group CD28/CTLA-4分子与RA病人ESR、RF 和抗 CCP的相关关系 * P0.05 CD28/CTLA-4分子与RA病人晨僵时间、关节 肿胀指数、压痛指数、总体平分的相关性 * P0.05 讨 论 uCD3+CD28+ 、CD3+CTLA-4+的表达在RA- PBMC、RA-SFMC和正常人PBMC上有差异； u通过Spearman相关分析发现上述差异与 RA的临床活动性存在着一定的相关关系 ，提示CD28/CTLA-4是RA病情进展的影响 因素之一，但并非决定性因素。 盐酸青藤碱对类风湿关节炎患者 CD28/CTLA-4表达的影响 实验方法： 流式细胞术双标染色技术： 采用全血直标法检测经SN治疗前后RA病人PBMC 上CD3+CD28+和CD3+CTLA-4+的表达。 结 果 治疗前 治疗后 RA病人经SN治疗2月后PBMC上 CD28/CTLA-4的变化 * P0.05 uSN上调了T细胞上CTLA-4的表达后，更多的 负性信号抑制了T细胞活化或诱导了T细胞 的失能(Anergy)，从而抑制RA患者体内T细 胞活化反应. 正清风痛宁治疗RA的作用机制 uRA是免疫介导的炎症性疾病 u滑膜组织中的巨噬细胞、成纤维样滑膜细胞、T细胞产生大量 的前炎症性细胞因子如IL-1、TNF-、IL-6、IL-17等，促进 了破骨细胞的分化与激活，在RA的关节破坏中起重要作用。 抑制滑膜内衬巨噬细胞样细胞TNF-合成 减少滑膜细胞IL-6mRNA的表达 降低血清内IL-1、TNF-水平 下调人外周血单个核细胞IL-1、IL-6mRNA表达 抗炎免疫抑制 正清风痛宁治疗RA的作用机制 uIL-4、IL-10可通过抑制Th1细胞介质导的免疫应答，并抑 制IL-6、TNF-等炎性细胞因子的功能和生成，从而达到 抗炎目的。 SN能使佐剂性关节炎大鼠血清及关节浸液内IL-1，TNF水 平显著降低， IL-4及IL-10水平显著增高，从而抑制细胞因子的促炎效应 ，增强细胞因子的抗炎效应 正清风痛宁治疗RA的作用机制 uRA患者关节滑膜组织内环氧化酶-2(COX-2)、诱导型一氧化氮 合酶(iNOS)过度表达，其诱导产物PGE2、NO大量合成，引起炎 细胞浸润、滑膜组织异常增生、新生血管翳形成，导致关节肿胀 、退变 。 SN抑制COX-2活性的同时，较强地抑制了PGE2的合成 动物实验上，SN对大鼠佐剂性关节炎继发病变显著抑制，且 关节浸液NO，PGE2水平显著降低 正清风痛宁治疗RA的作用机制 uRA存在着NF-B持续的激活，促进RA滑膜细胞的大量增生， 导致血管翳的形成。因此抑制NF-B的过度活化很可能成为 治疗RA较好的方法 SN可能通过下调单核/巨噬细胞核转录因子-B(NF-B )的活 性，干预NF-B信号通路的某些环节，抑制细胞因子TNF- mRNA、IL-1mRNA及IL-10mRNA的表达及分泌，而产生抗炎 作用 正清风痛宁治疗RA的作用机制 SN通过影响钙离子依赖的T细胞活化信号传导途径从而显著降 低T细胞内细胞因子IFN-、TNF-分子的表达 SN能显著抑制CD4+T细胞的增殖，使细胞周期停滞在G0/G1期 SN可能通过阻断NF-B信号通路，抑制树突状细胞激活T细胞 的能力 SN可能通过抑制DCTLRs的表达，阻断了TLRs信号转导途径介 导的DC成熟和细胞因子的分泌，间接阻止了T细胞的异常活化 阻止T细胞异常活化 正清风痛宁治疗RA的作用机制 lOM-lmM的SN对于体外培养的人RA滑膜细胞增殖有直接抑制 作用 SN可通过下调突变型P53来抑制滑膜细胞增生和诱导细胞,最终 减轻CIA大鼠的关节炎症状 不同剂量的SN诱导RA滑膜细胞凋亡，并在一定浓度及作用时间 内可通过阻滞G1期细胞向S期移行及下调Bcl-2基因的表达而抑 制RA患者滑膜细胞增殖，诱导凋亡 对滑膜细胞增殖及凋亡的影响 正清风痛宁治疗RA的临床研究 （一）单药治疗 杨小恒等采用正清风痛宁治疗类风湿性关节炎118例， 总有效率为91.52%，副作用小 谌曦等运用正清风痛宁治疗类风湿性关节炎，对患者四 肢功能、关节晨僵时间、关节疼数、血沉及类风湿因子 的改进均较显著，且副作用较小 正清风痛宁治疗RA的临床研究 正清风痛宁与MTX、萘普生、泼尼松、柳氮磺吡啶联