乙型肝炎血清学诊断新进展（课件）

南方医科大学南方医院 侯金林 乙型肝炎血清学诊断新进展 肝功（肝功（LFTLFT） 血清标志物血清标志物 HBV DNAHBV DNA YMDDYMDD cccDNAcccDNA HBV mRNAHBV mRNA 内质网内质网 高尔基体高尔基体 HBV 复制周期(Replication cycle of HBV) DNADNA 依赖聚合酶依赖聚合酶 RNARNA依赖聚合酶依赖聚合酶 胞核 肝细胞 HBsAgHBsAg HBeAgHBeAg HBV DNA 血 清 耐药突变 cccDNAcccDNA HBV mRNAHBV mRNA 内质网内质网 高尔基体高尔基体 HBV 复制周期(Replication cycle of HBV) DNADNA 依赖聚合酶依赖聚合酶 RNARNA依赖聚合酶依赖聚合酶 胞核 肝细胞 HBsAgHBsAg HBeAgHBeAg HBV DNA 血 清 耐药突变 HBsAg 我们了解什么? HBsAg 最老标志， 经典，简单? 易检测，难清除 未知不少: 清除机理？半衰期？ EM 回归归血清学? 量 基因型/亚型 变异体 肝组织/血清浓度的比例 HBsAg定量检测：i2000的缺点 检测范围窄：0.05-250 IU/ml； 稀释步骤：手工，耗时 ； 大部分样品需要稀释后重新测定 大部分样品需要稀释后测定 HBsAg定量检测的应用 一、了解影响血清HBsAg水平的因素 二、了解抗病毒治疗下血清HBsAg的 动态变化特点 HBsAg与HBV DNA水平正相关 B基因型的HBsAg水平更高 独立影响血清HBsAg水平： HBV DNA 和基因型 基因型C: 肝内HBsAg水平更高 HBV/C: HBsAg转运障碍？ 基因型HBsAg转运临床结局 ？ 基因型C感染 肝内HBsAg滞留 肝细胞对细胞因子引起的损伤更敏感 1 HBsAg转运障碍？ 肝细胞表面内源性肽高水平递呈 2 内质网压力（ER stress)增高 3 基因C型患者肝脏损伤更严重 1, Kalinina, et al. Hepatology, 2001 2, Gilles, et al. Hepatology, 1992 3, Xu, et al. J Virol, 1997 HBsAg动态变化 研究目的 HBV 复制持续抑制时HBsAg的动态变化 HBsAg的动态变化 入选标准 HBeAg阳性 拉米夫定长期治疗，之前无抗HBV治疗 ； 病毒抑制快速：治疗24周HBV DNA阴性 病毒抑制持久：HBV DNA阴性持续至 156周 基线资料 HBsAg动态变化特征 与HBeAg转阴与否无关 基因型影响HBsAg的变化特点 个体患者HBsAg变化的主要类型 cccDNAcccDNA HBV mRNAHBV mRNA 内质网内质网 高尔基体高尔基体 HBV 复制周期(Replication cycle of HBV) DNADNA 依赖聚合酶依赖聚合酶 RNARNA依赖聚合酶依赖聚合酶 胞核 肝细胞 HBsAgHBsAg HBeAgHBeAg HBV DNA 血 清 耐药突变 HBeAg定量检测 亚培公司曾经提供过HBeAg定量检测服 务，但目前没有商品化的HBeAg定量试 剂 0 2 4 6 8 Non-infected Infected lg (HBV DNA copies/ml ) n=25n=4 P=0.04 Fig 3 cccDNAcccDNA HBV mRNAHBV mRNA 内质网内质网 高尔基体高尔基体 HBV 复制周期(Replication cycle of HBV) DNADNA 依赖聚合酶依赖聚合酶 RNARNA依赖聚合酶依赖聚合酶 胞核 肝细胞 HBsAgHBsAg HBeAgHBeAg HBV DNA 血 清 耐药突变 HBV cccDNA HBV共价闭环(covalently closed circular, ccc)DNA是前基因组(pg)RNA合成的模 板。是病毒复制的模板, 其数量决定病 毒复制水平, 宿主免疫控制肝细胞的 cccDNA数量, 肝内病毒复制和清除强度 的平衡表现为血清病毒水平。 HBV cccDNA的定量 均依据松弛环状DNA和cccDNA在结构 上的差异而设计，一些报告还采取酶消 化的附加步骤以减少松弛环状DNA相对 于cccDNA的比例以增加特异性 过高估计cccDNA水平, 有些方法甚至可 以检测到血清中极高拷贝数的HBV cccDNA 不准确,不标准,不实用 HBV cccDNA的定量检测方法在特异性的提 高上仍有空间； 同时采用目前的HBV cccDNA定量方法可能 会对HBV生活周期的认识以及抗病毒治疗的 策略制定产生误导，值得警惕 肝脏活检的不普遍性，HBV cccDNA定量的 临床应用目前仍不现实。 cccDNAcccDNA HBV mRNAHBV mRNA 内质网内质网 高尔基体高尔基体 HBV 复制周期(Replication cycle of HBV) DNADNA 依赖聚合酶依赖聚合酶 RNARNA依赖聚合酶依赖聚合酶 胞核 肝细胞 HBsAgHBsAg HBeAgHBeAg HBV DNA 血 清 HBV DNA 检测 斑点杂交 （Dot-blot hybridization） 非PCR定量（Non-PCR based quantitative HBV DNA assays 定量 PCR-based quantitative HBV DNA assays 1980s 1990s 2000s 血清HBV DNA定量 方法目前多以聚合酶链式反应（PCR）作为检测手段； HBV DNA定量的表达多以拷贝/毫升（copies/ml）或国 际单位/毫升（IU/ml）表达，二者之间粗略的换算方法 为1 IU/ml = 5 copies/ml。 血清HBV DNA定量检测的发展方向为更高敏感性（ sensitivity）和更宽的动态范围（dynamic range）。 Minor fluctuation或minor rebound 例如罗氏公司的Cobas Taqman（敏感性为60IU/ml， 动态范围可至108IU/ml)，目前刚完成或正在进行的 临床试验多采用此方法，并将HBV DNA下降速率作 为疗效的评价指标。 亚培公司的RealTime方法的检测范围与前者类似， 检测下限可达10 IU/ml。 更早地监测到接受抗病毒治疗患者血清HBV DNA的 波动甚至是反弹（minor fluctuation或minor rebound） ， 不同试剂HBV DNA检测范围 1021031041051061071081091010 Ultrasensitive Digene II Cobas Amplicor Versant HBV DNA 3.0 HBV DNA (copies/ml) Digene II bDNA NAXCOR Cobas TaqMan 国产试剂盲区 国产试剂盲区 (无天, 无地,无标,无法,) HBV 标准品 HBV DNA levels determined by different tests cannot be compared directly WHO standard genotype A Eurohep standard (IU/ml) High prevalence of genotype recombinations in China N=1096; from 9 centers Zeng GB. J Viral Hepatitis 2005; Wang ZH J General Virology 2005 C,B B,C B,C, C/D, D C:77% B: 59% B: 23% C:41% D,C/D 29% B, C 71% C6, C7? C1Cs C2Ce C6 C7 Different geographical distribution of subgroups of HBV genotype C in China (n=526) Wang ZH. J Viral Hepatitis 2007; Wang ZH J General Virology 2005 Chan H. J Infect Dis. 2005 Prevalence of subgenotype C in China N=534; from 9 centers C2: 99% C1: 1% C1: 55% C2: 45% C6: 20% C2: 77% C7 2% C1 1% 0 10 20 30 40 50 60 70 80 BaC1C2 PC BCP P0.001 49/134 35/1345/106 83/106 Cs 14/45 24/45 Ce 37 5 31 26 78 53 Wang ZH. JCM 2007; Wang ZH J General Virology 2005 HBV Genotypes and subgenotypes in China Pure B (Bj strain) Pure D C/D Hybrid (C6) Pure C (C1, C2) B/C hybrid (Ba strain) EcoR I site HBV Genome 0 3200 Genotypes SPreC/C nt1742 2495 nt10 799 For Genotyping ayw adr ayw adw adw Zeng GB. J Viral Hepatitis 2005; Wang ZH. J General Virology 2005 nt10 1499 ayw C/D Hybrid (C7) HBV Genotypes and subgenotypes in China Pure B (Bj strain) Pure D C/D Hybrid (C6) Pure C (C1, C2) B/C hybrid (Ba strain) EcoR I site HBV Genome 0 3200 Genotypes SPreC/C nt1742 2495 nt10 799 For Genotyping ayw adr ayw adw adw Zeng GB. J Viral Hepatitis 2005; Wang ZH. J General Virology 2005 nt10 1499 ayw C/D Hybrid (C7) Ox head and body but horse face (牛头马面) CD B C D Inner Mongolia Mongolia Xinjiang 5.1% Tibet 71.4% Qinhai 63.5% Gansu 15.3% Ninxia 15.3% INDIA Geographical location and HBV genotypes distribution in different regions of western China Ethnical distribution of CD hybrid in Western regions Tibetan 81% Han 19% Hui (Gansu) 57% Hui (Ningxia) 15% Uygur 5% cccDNAcccDNA HBV mRNAHBV mRNA 内质网内质网 高尔基体高尔基体 HBV 复制周期(Replication cycle of HBV) DNADNA 依赖聚合酶依赖聚合酶 RNARNA依赖聚合酶依赖聚合酶 胞核 肝细胞 HBsAgHBsAg HBeAgHBeAg HBV DNA 血 清 耐药突变 LVD(0-26)ETV(51-64) ADV(27-50) Mo 14Mo 26Mo 34Mo 39Mo 50Mo 53Mo 5