免疫缺陷动物模型课件

第十章 免疫缺陷动物模型及应用 免疫缺陷(immunodeficiency)是指机体免疫系统中任何一个成分缺 少、缺失或功能不全的现象。 免疫缺陷病(immunodeficiency diseases)则是一种由于人体免疫 系统发育缺陷或免疫反应障碍导致的人体抗感染能力低下，临床表现 主要为反复感染或严重感染性疾病，它是机体免疫功能不全所出现的 临床综合征。 免疫缺陷病通常可分为先天遗传性及后天继发性两大类，这两类疾 病均会导致机体免疫功能低下或缺失，并易发生严重感染或肿瘤。 第一节 概述 特异性免 疫缺陷 T细胞 缺陷 T和B 细胞 缺陷 B细胞 缺陷 占先天性免疫缺陷病的50%70%。 其缺陷发生在B淋巴细胞祖细胞阶段 ，特征为免疫球蛋白水平的降低或缺 失。 占先天性免疫缺陷病的5%10%。因 先天性胸腺发育不全导致机体内T细 胞数目减少，或因某些酶或膜糖蛋白 等分子缺乏而导致T细胞功能障碍。 体液和细胞免疫同时有严重缺陷的疾 病，一般T细胞缺陷更为突出。可能 与干细胞分化为T、B细胞发生障碍或 胸腺及法氏囊相应结构发育异常有关 。 先天遗传性免疫缺陷病 非特异性 免疫缺陷 补体系 统缺陷 吞噬 细胞 缺陷 指吞噬细胞的功能障碍引起的疾病， 其发病率较低，它约占先天性免疫缺 陷病的1%2%，最多见的为慢性肉 芽肿病。 机体内补体成分的组分或它的调控蛋 白发生遗传性缺陷所引起的疾病。 先天遗传性免疫缺陷病 继发性免 疫缺陷 恶性 肿瘤 蛋白 质异 常 感染 许多病毒、细菌、真菌及原虫感 染常可引起机体免疫功能低下。 患恶性肿瘤特别是淋巴组织的恶性肿 瘤时，常可进行性抑制患者的免疫功 能。广泛转移的癌症患者中常可出现 明显的细胞免疫与体液免疫功能低下 。 慢性肾脏疾病、急慢性消化道疾病，大 面积烧（烫）伤时，体内蛋白质可大量 丧失；慢性消耗性疾病时蛋白质消耗会 增加；机体内的蛋白质合成不足。 后天继发性免疫缺陷病 医源性免 疫缺陷 放射 线损 伤 长期 使用 药物 长期使用免疫抑制剂、细胞毒药 物和某些抗生素。 放射线治疗是一种有效手段，大多数 淋巴细胞对射线十分敏感，大剂量放 射性损伤可造成机体永久性免疫缺陷 。 后天继发性免疫缺陷病 免疫缺陷动物(immunodeficiency animal)：指由于先天性遗传缺陷 或用人工方法造成一种或多种免疫系统组成成分缺陷的动物。 获得性免疫缺陷动物（acquired immunodeficiency animal）,又叫 诱发性免疫缺陷动物，指采用人工方法干预造成其免疫功能缺陷或低下 的动物。 遗传性免疫缺陷动物（ hereditary immunodeficiency animal）,又 叫自发性免疫缺陷动物，指动物自然发生的免疫缺陷疾病或由于基因突 变的异常表现，通过定向培育而获得的免疫功能缺陷或低下的动物。 第二节 免疫缺陷动物及其发展史 免疫缺陷 动物分类 联合免疫缺陷动物 裸小鼠的发现及其意义 裸小鼠(Nude mice)或无胸腺小鼠是一种无被毛、胸腺的突变种小鼠 。 1962年，英国格拉斯哥鲁齐尔医院病毒研究室的格里斯脱医生从非 近交系小鼠中偶然发现了个别无毛小鼠。 1966年，英国爱丁堡动物研究所的弗拉纳根首先确定了新生裸小鼠 以无触须为主要特征；随后的遗传特性研究，发现小鼠无毛是其11号 染色体上的等位基因发生了突变，并发现裸小鼠的皮肤组织学和以往 无毛小鼠不同，它的体内常染色体退化，存在着一种新的无毛基因； 认为这是一种新的自发突变种小鼠，并提出将其命名为“裸体”小鼠 ，用“nu”表示其基因符号。 1968年，佩蒂路易斯发现裸体小鼠已失去正常胸腺，其原胸腺残留 结构中，部分上皮样细胞呈巢状排列且部分呈外分泌腺结构，这才引 起世界各国生物医学领域的高度重视。 免疫缺陷 动物分类 联合免疫缺陷动物 裸小鼠的发现及其意义 20世纪60年代后期，裸小鼠作为“活试管”，在肿瘤学、免疫学等 方面很快成为广为关注的研究领域. 20世纪70年代以来，国际上先后召开了很多届“免疫功能缺陷动物 模型及应用”国际学术会议，以裸小鼠为代表的各类免疫功能缺陷动 物引起了生命科学领域的广泛关注，至今方兴未艾。 目前国际上发现和培育了以B细胞功能缺陷为特征，来源于CBA/N小 鼠的Xid小鼠，自然杀伤（NK）细胞功能缺陷的Beige小鼠、巨噬细胞 机能异常的P/J小鼠等各类免疫缺陷动物模型。 借助生物遗传工程的研究手段，应用基因导入等育种技术，将不同 类型的基因异常整合在同一动物体上，人工建立了许多联合免疫功能 缺陷动物。 免疫缺陷 动物分类 联合免疫缺陷动物 裸大鼠的发现及其意义 1953年，裸大鼠（Nude rats）由英国阿伯丁的Rowett研究所在实验大 鼠种群中所发现，基因符号为rnu，属染色体隐性遗传，因难于饲养繁殖 ，当时仅维持至60年代初。 1975年，该研究所在大鼠种群中再次发现了纯合子裸大鼠（rnu/run） 。 1977年，英国MRC实验动物中心首次在世界上建立了裸大鼠种子群。 1978年，Festing通过研究首次详细描述了裸大鼠的免疫学特征，并在 世界上首先报道了采用裸大鼠开展人癌异种移植的实验结果。rnu裸大鼠 先后被分别引入欧洲大陆及美国及日本等国，并于1983年由我国科学家引 入中国。 除rnu裸大鼠以外，1976年5月在新西兰维多利亚大学的科研人员发现了 另一种裸大鼠，为了与rnu裸大鼠区别，他们将这种裸大鼠的基因符号命 名为nznu。目前绝大多数裸大鼠的研究资料均来自rnu裸大鼠。 实验诱导免 疫缺陷动物 免疫器官切除免疫抑制剂 大剂量激素 放射性照射 实验诱导免疫缺陷动物 免疫抑制 动物模型 TAR 小鼠 TRB 小鼠 联合使用胸腺切除、放射线照射 和骨髓重建的方法建立的实验诱 导免疫抑制动物模型，即TRB小 鼠模型。 采用胸腺切除、阿拉伯胶糖嘧啶 渗透加放射线照射的技术制作的 免疫缺陷动物模型，即TAR小鼠 模型。 实验诱导免疫缺陷动物 T淋巴细胞功能缺陷动物 裸小鼠、裸大鼠 B淋巴细胞功能缺陷动物 XID小鼠 NK细胞缺陷动物 Beige小鼠 免疫缺陷 动物分类 联合免疫缺陷动物 SCID小鼠、NOD-SCID小 鼠、BNX小鼠 第三节 免疫缺陷动物分类 按照临床上免疫缺陷疾病以始发部位或所含有成分分类的原则，根据免 疫缺陷动物的实际应用现状，免疫缺陷动物的分类并不可能十分严格； 利用基因敲除技术造成某些免疫细胞因子缺陷的免疫缺陷小鼠大多数还 无特定的名称。 BALB/c(nu/nu) (T cell-) BNX (T/B/NK cell-) NOD/SCID (T/B/NK cell-) SCID (T/B cell-) Nud rat (T cell-) 免疫缺陷动物 免疫缺陷 动物分类 联合免疫缺陷动物 一、T淋巴细胞功能缺陷动物 裸小鼠是一种全身无毛、先天性胸腺发育不良及T淋巴细胞功能免疫缺 陷的动物，其隐性突变的裸基因（nu）位于11号染色体上。 裸小鼠概况 已将nu基因成功导入不同近交系动物，世界上已建立了20余种具有不 同遗传背景和相同nu基因遗传特性的近交系裸小鼠；使用最多的裸小 鼠品系是BALB/c-nu小鼠，其它来源的裸小鼠如NIH-nu小鼠、NC-nu小 鼠、Swiss-nu小鼠、C3H-nu小鼠、C57BL-nu等品系也有较多应用。 生物学特征 裸小鼠的主要特征表现为无毛和无胸腺，随着鼠龄增加，其皮肤变薄 、头颈部皮皱褶、发育迟缓。不同品系的裸小鼠具有不同的生物学特 征。如BALB/C裸小鼠皮肤为浅红色，白眼；C3H裸小鼠皮肤为灰白色， 黑眼；C57BL裸小鼠皮肤为黑灰色至黑色。 CD-(ICR)裸鼠NU/NU 裸鼠 免疫缺陷 动物分类 联合免疫缺陷动物 一、T淋巴细胞功能缺陷动物 免疫学特征 胸腺缺损，可见少量胸腺痕迹或异常上皮，但胸腺依赖细胞明显减少 或缺失，故不能使T细胞正常分化，缺乏成熟T细胞的辅助、抑制及杀 伤功能，所以其细胞免疫力低下。体内B淋巴细胞数正常，但功能欠正 常，免疫球蛋白主要是IgM，只含少量IgG。68周龄以上的成年裸小 鼠较普通小鼠有较高水平的NK细胞活性，34周龄的幼龄裸小鼠则NK 细胞的活性相对低下；随着裸小鼠年龄增长或其他因素的影响（如微 生物感染），其体内正常T细胞数会增加，NK细胞活性也会代偿性增高 。 应用领域 已广泛应用于肿瘤学、免疫学、微生物、遗传学、寄生虫、临床医学 等专业领域。 CD-(ICR)裸鼠NU/NU 裸鼠 免疫缺陷 动物分类 联合免疫缺陷动物 一、T淋巴细胞功能缺陷动物 裸大鼠是一种全身无毛、先天性胸腺发育不良及T淋巴细胞功能免疫 缺陷的动物，其基因符号为rnu，属染色体隐性遗传。 生物学特征 主要特征类似于裸小鼠，但其躯干部仍有稀少被毛，并非如裸小鼠那 样基本无毛，其头部及四肢毛更多。26周龄期间其皮肤上有棕色鳞 片状物，随鼠龄增长出现稀少被毛直至终身。 免疫学特征 与裸小鼠极为相似，可见胸腺残体；其体内T细胞功能缺陷，B细胞功 能基本正常，NK细胞活力增强。对结核菌素无迟发性变态反应，血中 未测出IgM及IgG，淋巴细胞转化试验为阴性。 肿瘤移植实验中，裸大鼠具有移植瘤大、取血量多、可行某些外 科手术之优点。 免疫缺陷 动物分类 联合免疫缺陷动物 二、B淋巴细胞功能缺陷动物 XID（X-linked immunodeficiency）小鼠为B淋巴细胞功能缺陷疾病 模型，临床常表现为免疫球蛋白缺失，但细胞免疫正常。来源于 CBA/N小鼠，为X-染色体隐性遗传，其突变基因位于Pgk-1与Plp基因 之间，基因符号为xid。该基因使小鼠脾脏B淋巴细胞数目减少并有缺 陷，导致体内成熟B细胞缺少，从而对某些B细胞抗原缺乏免疫应答反 应。目前已培育出B细胞缺陷的小鼠已不少于15个品系。 免疫学特征 纯和型雌鼠(xid/xid)和杂合型雄鼠(xid/y)对型抗原(非胸腺依赖 性抗原)以及双链DNA等没有反应，对胸腺依赖性抗原缺乏抗体反应； 血清中IgG3、IgM低下。其免疫学特征与人类性联丙种球蛋白缺乏症 （Bruton型）和湿疹-血小板减少性紫癜(Wiskott-Aldisch氏)综合症 相似。 应用领域 免疫学领域，它是研究B淋巴细胞的发生和功能理想的动物模型。 免疫缺陷 动物分类 联合免疫缺陷动物 三、NK淋巴细胞功能缺陷动物 Beige小鼠为NK细胞功能缺陷疾病模型，它是隐性基因突变系，bg基因为 13号常染色体隐性突变基因，它起源于C57BL/6品系。它是经射线辐射的 小鼠生产的仔鼠中出现的变异动物，这种动物被称为Beige (bg/bg)小鼠 。 生物学特征 Beige小鼠表现为明显的黑色素体减少，外观很难与其他白色小鼠鉴别。 其外观表现为毛色变浅，但被毛完整，耳廓和尾尖色素减少，出生时眼睛 颜色很浅，成年后眼睛全变黑。 免疫学特征 Beige小鼠内源性NK细胞发育和功能缺陷，血液凝固和巨噬细胞活性也有 缺陷；其免疫抗肿瘤杀伤作用出现较晚，缺乏细胞毒性T细胞功能，对同 种、异种肿瘤细胞的体液免疫功能减弱，欠缺巨噬细胞的抗肿瘤活性、杀 伤细胞活性等。 应用领域 应用于免疫学领域，它是人类齐希二氏综合症的良好动物模型。 免疫缺陷 动物分类 联合免疫缺陷动物 四、联合免疫缺陷动物 SCID（Severe combined immunodeficiency, SCID mice）小鼠是先 天性T和B淋巴细胞免疫缺陷动物，即重度联合免疫缺陷小鼠，1983年由 美国学者Bomsa在C.B-17突变小鼠中发现。SCID小鼠的免疫球蛋白缺 乏具有遗传性特征，由位于小鼠第16对染色体被称为scid的单个隐性突 变基因所导致，表现为T、B淋巴细胞免疫功能缺陷。 生物学特征 SCID小鼠外观与普通BABC/c小鼠无差异，体重发育基本正常，体表有 毛呈白色；其淋巴器官发育有缺陷，胸腺相对重量仅为同龄正常小鼠的 6%左右，脾脏相对重量仅为同龄正常小鼠的30%，淋巴结极小，常散在 分布于脂肪组织中，难以用肉眼看见。 饲养繁殖 SCID小鼠极易感染，在高度洁净的SPF环境下可存活1年以上。采用纯 合子两性交配均可生育，但其繁殖能力较弱，窝产仔数平均为35只， 雌性小鼠生产两胎后其繁殖能力即明显下降。 免疫缺陷 动物分类 联合免疫缺陷动物 四、联合免疫缺陷动物 组织学特征 主要表现为淋巴细胞显著缺陷，其外周淋巴细胞组分减少，淋巴细胞仅 占白细胞总数的1020%。胸腺多被脂肪组织包围，无皮质结构仅保留残 存髓质，且主要由类上皮细胞和成纤维细胞构成，边缘偶见灶状淋巴细 胞群。脾脏白髓不明显，红髓正常，脾小体无淋巴细胞聚集，主要由网 状细胞构成。淋巴结无明显皮质区，副皮质区缺失，呈淋巴细胞脱空状 ，由网状细胞占据。 免疫学特征 所有T和B淋巴细胞的功能测试中均为阴性，对外源性抗原无抗体和细胞 免疫反应，细胞免疫和体液免疫功能缺陷，但巨噬细胞和NK细胞功能未 受影响。存在渗漏现象，少数SCID小鼠在青年期可出现一定程度的免疫 功能恢复；渗漏现象不遗传，但与小鼠的年龄、品系、饲养环境有关。 应用领域 已在肿瘤学、免疫学、微生物学、生殖医学等领域研究中得到广泛应用 。 免疫缺陷 动物分类 联合免疫缺陷动物 四、联合免疫缺陷动物 BNX（为bg、nu、xid三个基因首字母的缩写）小鼠是NIH-Beige-Nude- XID小鼠的简称，亦称为NIH-小鼠，它是由美国（NIH）培育成功的一 种T、B、NK细胞联合免疫缺陷小鼠，即重度联合免疫缺陷小鼠，基因型 为NIH-bg/bg-xid/xid-nu/nu(雌性)和NIH-bg/bg-xid/y-nu/nu(雄性)。 外观特征 外观与裸小鼠相似，呈裸体外表，先天性胸腺发育缺陷。从出生到成年 ，外观均为黑色裸体外表；随年龄增长，其皮肤颜色逐渐减弱变淡，至 老年时仅有肩部和尾椎等局部呈黑色，其余部位的颜色为灰色或浅黑色 。 饲养繁殖 BNX小鼠的繁殖培育与裸小鼠、SCID小鼠明显不同，后两者是由天然突变 通过人工选育而培育成功的；而BNX小鼠则是将源于不同品系小鼠的突变 基因导入到某一个品系的小鼠体内而获得的。有效的繁殖方式为杂合子 雌性与纯合子雄性进行交配, 所产后代有一半为纯合子，即为BNX 小鼠 。 免疫缺陷 动物分类 联合免疫缺陷动物 四、联合免疫缺陷动物 生物学特征 BNX小鼠在实验中有着裸小鼠和SCID小鼠无法比拟的优势。它既兼有裸小 鼠无毛、易观察、相对易饲养和SCID小鼠重度免疫缺陷等优点，又克服 了裸小鼠免疫缺陷程度不深、接受抗原刺激免疫机能易恢复以及SCID小 鼠有毛、不利于实验观察、难饲养、存在免疫渗漏等缺点。 实验优势 应用BNX小鼠建立肿瘤动物模型具有以下优点： 成瘤率高，通常可达到100%成瘤率； 成瘤时间早且一致性好，几乎同时成瘤； 肿瘤个体差异小，便于实验分组； 成瘤实验重复性好，某些即使在裸鼠和SCID小鼠体内重复性差的肿瘤 ，在BNX小鼠体内也能得到较好的重复性。 应用领域 已广泛应用于血液学、肿瘤学、免疫学以及微生物学等研究领域。 免疫缺陷 动物分类 联合免疫缺陷动物 四、联合免疫缺陷动物 NOD/SCID小鼠亦称非肥胖糖尿病/严重联合免疫缺陷小鼠(non-obese diabetes-SCID, NOD/LtSz-SCID, 简称NOD/SCID),它是在SCID小鼠的基础上 ，通过与非肥胖性糖尿病小鼠NOD/Lt杂交，由美国Jackson实验室建系并完 成的一种重度免疫缺陷动物。 建系目的 NOD/Lt鼠是一种胰岛素依赖性糖尿病小鼠，它具有T淋巴细胞介导的细胞免 疫,但NK细胞、抗原提呈细胞(antigen presenting cell,APC)功能缺陷。 SCID小鼠可以成功接种各种肿瘤细胞并反映其在体内的生物学行为，但其体 内存在正常的NK细胞、补体及髓系细胞的正常免疫，小部分周龄较大的SCID 小鼠会发生淋巴细胞免疫功能恢复(渗漏现象)，产生T和B细胞，降低了细胞 植入存活率，影响SCID小鼠的更广泛应用。 免疫学特征 既保留了SCID小鼠T、B淋巴细胞缺陷的特点，还具有NK细胞活性很低、无循 环补体、巨噬细胞和APC 细胞功能损害的特性；同时还具有放射敏感性高、 渗漏现象少、不能发生自发免疫性糖尿病的特点。 免疫缺陷 动物分类 联合免疫缺陷动物 四、联合免疫缺陷动物 生物学特征 外观与普通小鼠差别不大，有毛、白色、体重发育基本正常；其免疫力 低下极易感染；SPF环境下可存活1.5年以上，平均寿命为8.5个月左右。 不足之处 仍残留低水平的NK细胞活性； 生存时间较SCID小鼠短； NOD/SCID小鼠的人体移植瘤能较好地保留人体肿瘤特性，但肿瘤生长 的内环境与人体差异很大，不如SCID小鼠； 体内研究结果不一定能完全预测肿瘤在人体内的临床行为。 应用领域 对人类肿瘤学、血液学、组织工程、免疫系统重建和干细胞研究具有重 要价值，目前已在生命科学的相关领域得到高度重视及广泛应用。 致癌方法研究发病机制及转移机理 抗肿瘤药物筛选 肿瘤学研究 第四节 免疫缺陷动物的应用 所有类型的人类肿瘤，几乎均已在免疫缺陷动物体内建立了各种移植 模型。目前肿瘤学领域的研究已从单纯观察人类肿瘤的大体形态、病 理组织学特性及可移植性，转而不断向细胞及分子水平发展。 肿瘤细胞和分子遗传学 移植性肿瘤模型观察项目 1 2 3 4 观察项目 一般生物学特性 组织病理学观察 染色体分析 肿瘤标志物检测 免疫缺陷 动物分类 移植性肿瘤模型特点 人类肿瘤组织标本或成株细胞系，均可以用免疫缺陷动物建立移植性 肿瘤模型，但模型的移植成功率有差异。 人肿瘤细胞株 生物学特性稳定，用已建株的癌细胞建立移植性肿瘤模型，其移植成功 率远高于人癌手术标本移植。肿瘤细胞株是目前人体肿瘤异种移植模型 最主要的瘤源，很多常用肿瘤细胞株都能达到接近100的移植成功率 。 临床标本 它是异种移植肿瘤模型的重要来源，同时也是人肿瘤细胞株的主要来源 ，包括肿瘤原发灶及转移灶的手术（活检）标本和患者的癌性腹（胸） 水。 肿瘤患者 患者的恶性程度、年龄、转移情况、治疗与否都对移植成功率有一定程 度的影响。通常情况下患者的肿瘤恶性程度越高、年龄越小、转移越广 泛且未经放疗、化疗的移植成功率越高。 免疫缺陷 动物分类 联合免疫缺陷动物 移植性肿瘤模型制备方法 异位移植（Heterotopic Transplantation）是指将肿瘤组织（或细胞 悬液）移植到与肿瘤原发部位无关的移植宿主器官组织内。 肌肉内移植 皮下移植肾包膜下移植 睾丸包膜下移植 脑内移植腹腔移植 异位移植 移植性肿瘤模型制备方法 原位移植 原位移植（Orthotopic Transplantation）亦可称为常位移植或 正位移植，是指将肿瘤组织（或细胞悬液）移植到与肿瘤原发部位 相对应的移植宿主器官组织内。 肿瘤移植 成功率高 肿瘤生物学 特性更接近 晚期出现恶病 质及广泛转移 瘤组织块 移植材料 优点 获得的肿瘤生长均匀，瘤体大小且生长速率基本一致，个体差异 较小，无自发缓解； 移植成功率高，某些人体肿瘤细胞系移植成功率接近100%； 移植肿瘤仍保持原有组织的生物学特征； 肿瘤可连续传代，试验周期通常较短。 缺点 肿瘤生长迅速，与人体肿瘤情况不一致。 移植性肿瘤模型优缺点 条件基本一致的免疫缺陷动物 同时以同一方式接种一定量瘤细胞 可以使一群动物带有同样的肿瘤 移植性肿瘤的影响因素 供体（瘤源）方面 肿瘤组织块或细胞的生长活性、 数量、浓度、瘤源本身的生物学 特性等 受体（动物）方面 动物