实验26_色素原底物反应测定酶活性课件

全国高等医药院校医学检验专业规划教材 临床生物化学检验实验指导 （第二版） 贵阳医学院医学检验系 黄海 实验 26 色素原底物反应测定酶活性 1 全国高等医药院校医学检验专业规划教材 临床生物化学检验实验指导 （第二版） 实验26 色素原底物反应测定酶活性 实验目的 v掌握：色素原底物反应测应测 定酶活性的原理。 v熟悉：熟悉连续监测连续监测 法测测定实验实验 的操作步骤骤 。 v了解：测测定GGT、ALP和AMS的临临床意义义。 2 全国高等医药院校医学检验专业规划教材 临床生物化学检验实验指导 （第二版） 实验26 色素原底物反应测定酶活性 一、血清-谷氨酰基转移酶（GGT ）测定 二、血清碱性磷酸酶（ALP）测定 三、血清淀粉酶（AMS）测定 3 全国高等医药院校医学检验专业规划教材 临床生物化学检验实验指导 （第二版） 实验26 色素原底物反应测定GGT 实验原理 （黄色化合物，=405nm） 在405410nm处监测吸光度变化。吸光度增高速率（ A/min）与GGT活性呈正比，利用连续监测法酶活性的 计算公式，求出GGT活性。 一、血清-谷氨酰基转移酶（GGT）测定 4 全国高等医药院校医学检验专业规划教材 临床生物化学检验实验指导 （第二版） 实验26 色素原底物反应测定GGT 试剂与器材 1. 底物缓冲液 Tris-HCl缓冲液110mmol/L；双甘肽 110mmol/L；L-谷氨酰-3-羧基-4-硝基苯胺 6.0mmol/L；pH(37) 7.7。 2. 待测标本 病人血清或质控血清。 5 全国高等医药院校医学检验专业规划教材 临床生物化学检验实验指导 （第二版） 实验26 色素原底物反应测定GGT 操作步骤 1. 手工操作 （1）37预预温的底物缓缓冲液。 （2）在光径为为1.0cm石英比色皿中加入血清 100l及预预温的底物缓缓冲液1 000l；在37，波 长长405nm连续监测连续监测 60s吸光度的变变化，求出 A/min。 6 全国高等医药院校医学检验专业规划教材 临床生物化学检验实验指导 （第二版） 实验26 色素原底物反应测定GGT 操作步骤 2. 自动动化生化分析仪仪操作程序的设设置 按手工操作要求设设置参数为为： F值: 1 159； 延滞期时间: 30s； 连续监测时间: 60s； 比色皿光径: 1.0cm； 波长: 405nm； 吸样量: 100l； 温度: 37 7 全国高等医药院校医学检验专业规划教材 临床生物化学检验实验指导 （第二版） 实验26 色素原底物反应测定GGT 计算 式中9 490为为2-硝基-5-氨基苯甲酸在405nm处处 的摩尔消光系数。 8 全国高等医药院校医学检验专业规划教材 临床生物化学检验实验指导 （第二版） 实验26 色素原底物反应测定GGT 参考范围 男性血清GGT: 11 U/L 50U/L （37） 女性血清GGT: 7 U/L 32U/L （37） 9 全国高等医药院校医学检验专业规划教材 临床生物化学检验实验指导 （第二版） 实验26 色素原底物反应测定GGT 临床意义 1. GGT主要用于诊诊断肝胆疾病 原发发性肝癌血清GGT活性显显著升高，急性肝炎、慢性肝炎 活动动期、阻塞性黄疸、胆道感染、胆石症、急性胰腺炎时时都 可以升高。 2. 人体器官中GGT的含量按下列顺顺序排列：肾肾、前列腺、胰 、肝、盲肠肠和脑脑。肾脏肾脏 中GGT含量最高，但肾脏肾脏 疾病时时，血 液中该该酶活性增高不明显显，可能是肾脏肾脏 病变时变时 ，GGT经经尿排 出。 3. 嗜酒或长长期接受某些药药物如安替比林、苯巴比妥、苯妥英 钠钠等，血清GGT活性常升高。 10 全国高等医药院校医学检验专业规划教材 临床生物化学检验实验指导 （第二版） 实验26 色素原底物反应测定GGT 注意事项 1. 测测定波长为长为 405nm，2-硝基-5-氨基苯甲酸的摩尔消光系 数，因仪仪器性能和精度不同存在差别别，建议议各实验实验 室自 行测测定。 2. 甘氨酸对对GGT反应应有抑制作用，所用的双甘肽肽制剂剂中甘 氨酸含量应应0.1%。溶血标标本对测对测 定结结果影响不大，黄 疸和脂血不干扰扰本法测测定结结果。 3. 血清GGT的活力在室温或4可稳稳定7天，在冷冻冻状态态下 可稳稳定2个月。 11 全国高等医药院校医学检验专业规划教材 临床生物化学检验实验指导 （第二版） 实验26 色素原底物反应测定GGT 评价 准确性和精确性都好，操作简简便； 实验实验 条件要求严严格。 返回本实验目录 12 全国高等医药院校医学检验专业规划教材 临床生物化学检验实验指导 （第二版） 实验26 色素原底物反应测定ALP 实验原理 二、血清碱性磷酸酶（ALP）测定 ALP速率法测定的反应式为： 黄色（405nm） 13 全国高等医药院校医学检验专业规划教材 临床生物化学检验实验指导 （第二版） 实验26 色素原底物反应测定ALP 试剂与器材 1. 试剂组成 试剂（R1）： 1.00mmol/L二乙基氨基乙醇（ EAE）缓冲液 、0.5mmol/L MgCl2。 试剂（R2）： 100mmol/L 4-NPP 、0.5mmol/L MgCl2。 若作单试剂法，可将试剂4份与试剂1份临用 前混合成工作液。 14 全国高等医药院校医学检验专业规划教材 临床生物化学检验实验指导 （第二版） 实验26 色素原底物反应测定ALP 试剂与器材 2. 生化分析仪测定条件 温度：370.1； 光径：1.00.01mm； 波长：4051nm； 带宽：2nm。 15 全国高等医药院校医学检验专业规划教材 临床生物化学检验实验指导 （第二版） 实验26 色素原底物反应测定ALP 操作步骤 单试剂单试剂 法 标标本10l+工作液500l 延迟时间迟时间 60s 读读数时间时间 120s 16 全国高等医药院校医学检验专业规划教材 临床生物化学检验实验指导 （第二版） 实验26 色素原底物反应测定ALP 计算 4-硝基酚（PNP）：18 500（405nm） 参考范围 成人血清ALP： 40 U/L 150U/L 17 全国高等医药院校医学检验专业规划教材 临床生物化学检验实验指导 （第二版） 实验26 色素原底物反应测定ALP 临床意义 1. ALP可作为为肝胆和骨骼疾病的辅辅助诊诊断指标标。 肝胆疾病，如阻塞性黄疸、急或慢性黄疸型肝 炎、肝癌等血清酶活力可增高。 发发生骨骼疾病时时，由于骨的损伤损伤 或疾病使成骨 细细 胞所含高浓浓度的ALP释释放入血，引起血中ALP活 力增高。 2. ALP减少比较较少见见，主要见见于呆小病、成骨不 全 症、磷酸酶过过少症、维维生素C缺乏症等。 18 全国高等医药院校医学检验专业规划教材 临床生物化学检验实验指导 （第二版） 实验26 色素原底物反应测定ALP 注意事项 1. 血清置室温（25），ALP活性显显示轻轻度升高。 例如，室温6小时时，酶活性约约增高1%，置14天 酶活性增高3%6%。血清存放冰箱（4），酶 活性也出现缓现缓 慢升高。冰冻冻血清，ALP活性降 低，但当血清复温后，酶活性会慢慢恢复。 2. 本法的线线性范围围：0500U/L（37）。 返回本实验目录 19 全国高等医药院校医学检验专业规划教材 临床生物化学检验实验指导 （第二版） 实验26 色素原底物反应测定AMS 三、血清淀粉酶（AMS）测定 实验原 理 20 全国高等医药院校医学检验专业规划教材 临床生物化学检验实验指导 （第二版） 实验26 色素原底物反应测定AMS 试剂及器材 1. 磷酸缓缓冲液（pH7.10） 2. 34 KU/L - 葡萄糖苷酶溶液 。 3. 57.5mmol/L底物溶液。 21 全国高等医药院校医学检验专业规划教材 临床生物化学检验实验指导 （第二版） 实验26 色素原底物反应测定AMS 操作步骤 1. 吸取-葡萄糖苷酶溶液400l，样品20l ，预温至37，再吸入底物溶液40l，启 动半自动生化分析仪监测。 2. 主要参数 温度 37；延滞时间3min；波长 405nm 间隔时间 30s；监测时间 3min 。 22 全国高等医药院校医学检验专业规划教材 临床生物化学检验实验指导 （第二版） 实验26 色素原底物反应测定AMS 计算 Vt为为反应总应总 体积积（ml）； Vs为样为样 品用量（ml）； L为为比色皿光径（cm）； 3为为由产产生4NP的mol数换换算成被水解底物4NP-G7的mol数 ； E405nm为为4NP的摩尔消光系数（37、30和25时时分别为别为 10 600、9 500和9 000） 23 全国高等医药院校医学检验专业规划教材 临床生物化学检验实验指导 （第二版） 实验26 色素原底物反应测定AMS 参考范围 血清淀粉酶（37）：220U/L 24 全国高等医药院校医学检验专业规划教材 临床生物化学检验实验指导 （第二版） 实验26 色素原底物反应测定AMS 临床意义 1. 急性胰腺炎发发病后812小时时血清AMS开始升高 ，1224小时时达高峰。25天下降至正常，若超 过过500U即有诊诊断意义义，达350U时应怀时应怀 疑该该病 。 2. 尿AMS约约于发发病后1224小时时开始升高，下降 也较较血清AMS慢，所以在急性胰腺炎后期测测定 尿AMS更有价值值。 3. 流行性腮腺炎，特别别是胰腺炎时时，血和尿中的 AMS显显著升高。 4. 正常血清中的AMS主要由肝脏产脏产 生，故肝病时时 血清及尿中AMS可同时时减低。 25 全国高等医药院校医学检验专业规划教材 临床生物化学检验实验指导 （第二版） 实验26 色素原底物反应测定AMS 注意事项 1.Tris缓缓冲液抑制-葡萄糖苷酶，EDTA严严 重干扰测扰测 定，其它抗凝剂剂无明显显影响。 2. 血清淀粉酶十分稳稳定，置室温1周或冰箱2 个月，酶活性没有明显变显变 化。 3.尿液呈酸性时时，淀粉酶稳稳定性较较差，因此 尿液标标本保存前，须须将pH调节调节 至7.0左右 。 26 全国高等医药院校医学检验专业规划教材 临床生物化学检验实验指导 （第二版） 实验26 色素原底物反应测定AMS 评价 本法线线性范围围可达2 000U/L，方法简简 便快速，精密度好，既适合自动动化分析， 也可手工测测定，结结果能以国际单际单 位表示 ，是目前测测定淀粉酶较为较为 理想的方法 。 返回本实验目录 27 全国高