流式抗体及荧光染料的选择ppt课件

流式抗体及荧光染料的选择 陈晓东 产品技术专员 抗原抗体反应1 2流式抗体的选择、荧光染料应用 抗原抗体反应 v 抗原抗体反应的原理 v 抗原抗体反应的特点 v 影响抗原抗体反应的因素 抗原抗体反应:指抗原与相应抗体之间所发生的特异 性结合反应。 v 抗原与抗体的特异性结合既会在体内发生，亦可以在体外进行， 体外进行的抗原抗体反应习惯上称作血清学反应 抗原表位与抗体高变区间的互补结合 抗原表位与抗体高变区的沟槽分子表面的结合 抗原抗体之间的结合力 亲水胶体转化为疏水胶体 物 质 基 础 v抗原抗体反应的特点 特异性可逆性比例性阶段性 前带(prezone)：抗体过量 后带(postzone)：抗原过量 等价带(equivalence zone)： 抗原抗体比例合适 抗原抗体反应比例性示意图 比例性：抗原与抗体发生 可见反应需遵循一定的量比 关系 阶段性 第一阶段：特异性结合阶段，反应快，不可见 第二阶段：反应可见阶段，反应慢，出现凝集、 沉淀和细胞 溶解等现象 v 影响抗原抗体反应的因素 一、反应物自身因素 抗原:理化性状、表位种类和数目 抗体:来源、特异性、亲和性、效价 二、环境因素 电解质: 生理盐水或缓冲液 酸碱度: pH6pH9（pH7.2pH7.4） 温 度: 1540（4 ），37最适 流式抗体的选择、荧光染料应用 RUO ASR IVD 类体外诊断试剂 分析物特异性试剂 仅用于研究 v 单克隆抗体 v 混合单克隆抗体 v 多克隆抗体 荧光直标的抗体 未标记的抗体（需要荧光标记的二抗进 行间接标记检测） 单分子荧光素 复合分子荧光素 信噪比（S/N）：特异性荧光信号（signal）与非特异性荧 光信号的比值 PEAPCPE-Cy5PerCP-Cy5.5FITCPerCP S/N越大，表 明阳性与对 照细胞的荧 光峰分离越 好，当S/N大 于3时属于可 接受范围 综合因素： v荧光标记效率：抗体上标记荧光素的数量（E/P比值）也会影 响相对荧光强度。 v抗体检测的抗原密度：高密度的抗原几乎可以用任何荧光素标 记的抗体检测，而较低表达的抗原则需要用较高S/N比值的荧光 素（如PE和APC）标记的抗体检测，从而达到有效区分阳性细胞 群和何阴性细胞群的目的。 v细胞自发荧光：检测自发荧光水平高的细胞时，使用发射光波 长较长的荧光染料（如APC）可以得到较好的S/N比值。 理想荧光素 v 具有高的光子产量，信号强度高 v 对激发光有较强的吸收，降低背景信号 v 激发光谱与发射光谱之间距离较大，减少背景信号的干扰 v 易与被标记的抗原、抗体或其他生物物质结合而不影响被标记 物得特异性 v 稳定性好，不易受光、温度、标本抗凝剂和固定剂的影响 v根据仪器选用荧光素：1.每个通道只能选择1种荧光素 2.各个通道之间的荧光素可以随意搭配 v搭配的荧光素之间发射光谱重叠尽量小 注意： 1.不要为了节省荧光抗体，未经过预实验就按抗体说 明书减半量甚至更多进行标记。 2.不能完全凭感觉进行标记，需进行细胞计数。 3.应用FITC标记抗体时，避免使用酸性缓冲溶液，因 为FITC的荧光特性是pH依赖的。 4.荧光抗体、荧光染色