核因子b在中耳胆脂瘤发病机制中的作用研究课件

胆脂瘤组织中胆脂瘤组织中NF-BNF-B 活化与活化与IL-6IL-6基因异常表达基因异常表达 武汉大学人民医院 耳鼻咽喉头颈外科 许 昱 陶泽璋 中耳胆脂瘤的发生、发展是一个复杂 的病理生理过程，其确切机理至今仍不 清楚。但基本达成共识的是胆脂瘤的形 成与机体为防御慢性炎症而产生的一系 列异常免疫应答有关。免疫反应的异常 是造成胆脂瘤持续发展和骨质破坏的内 在重要因素，而多种细胞因子又在介导 在这一异常的免疫反应中起重要作用 前前 言言 目前已发现多种细胞因子在胆脂瘤中存 在异常表达，但这些细胞因子释放和调控的 机制不清楚 许多与炎症反应密切相关的细胞因子的 基因启动子和增强子部位均存在NF-B的结 合位点，即这些细胞因子的激活和转录均受 到NF-B的调控 胆脂瘤组织中胆脂瘤组织中NF-BNF-B活化与细活化与细 胞因子表达的关系？胞因子表达的关系？ 选择IL6作为细胞因子代表 采用RT-PCR技术及凝胶电泳迁移阻滞法（ EMSA）研究胆脂瘤组织中NF-B活化 与细 胞因子IL-6表达的关系 材料和方法材料和方法 取材： 标本：中耳胆脂瘤组织标本10例 正常外耳道皮肤组织6例 取材方法：取自中耳乳突手术术中，标本取出 后清洗片刻，在显微镜下仔细剔除胆脂瘤鳞 屑及其它坏死组织，立即置80冰箱 临床资料临床资料 uu NFNFBB核蛋白核蛋白DNADNA结合活性检测结合活性检测 采用采用凝胶电泳迁移阻滞法（凝胶电泳迁移阻滞法（EMSAEMSA） uu ILIL6mRNA6mRNA表达的半定量检测表达的半定量检测 采用采用逆转录逆转录PCRPCR法法 检测指标及技术路线检测指标及技术路线 设两组对照以鉴定NF-B探针的特异性 特异性竞争抑制实验: 反应体系中加入 50倍（即 1L）未标记的特异性NF-B探针 非特异性竞争抑制实验：反应体系中加入50倍（ 即1L）未标记的非特异性AP-2探针 凝胶迁移率竞争抑制实验凝胶迁移率竞争抑制实验 u 用法国VL自动凝胶成像及分析系统进 行照相和分析 目的基因相对表达量目的基因相对表达量 目的基因条带密度 GAPDH GAPDH 基因条带密度基因条带密度 uu 应用应用SPSS11.5SPSS11.5软件包进行统计学分析，软件包进行统计学分析， 采用采用t t检验和一元性相关分析进行数据处理检验和一元性相关分析进行数据处理 数据处理及统计学分析数据处理及统计学分析 结结 果果 2 2种组织种组织NFNF BDNABDNA结合活性比较结合活性比较 图21：EMSA显示胆脂瘤组织的滞后条带强度及面积明显高 于正常皮肤组织（1：未加核蛋白的阴性对照，2、3、4 ：正常外耳道皮肤组织；5、6、7、8、9：中耳胆脂瘤组 织） 1 1：阳性对照；阳性对照；2 2：5050倍未标记倍未标记NFNFBB探针探针;3;3：100100 倍未标记倍未标记NFBNFB探针；探针；4 4：5050倍倍AP2AP2探针；探针；5 5：100100倍倍 AP2AP2探针探针 EMSAEMSA特异性和非特异性竞争抑制实验特异性和非特异性竞争抑制实验 图图2 23 3 RTRTPCRPCR结果显示，胆脂瘤组织的结果显示，胆脂瘤组织的ILIL6 6基基 因表达显著高于正常皮肤组织因表达显著高于正常皮肤组织 注：注：1 1、2 2、3 3泳道：正常外耳泳道：正常外耳 道道皮肤皮肤组织组织 4 4、5 5、6 6、7 7、8 8：中耳：中耳胆脂瘤胆脂瘤组织组织 2 2种组织种组织ILIL6mRNA6mRNA表达比较表达比较 *t t=2.166=2.166，P P=0.048=0.048 *t t=3.600=3.600，P P=0.014 =0.014 组织类型 例数 NFB IL6 胆脂瘤 8 16.510.1 0.8360.281 正常皮肤 8 1.381.24* 0.4700.115* 表表2 21 21 2种组织种组织NFNFB B 活性及活性及 ILIL6mRNA6mRNA表达表达 图图2 24 4：NFNFBDNABDNA结合活性的与结合活性的与ILIL6mRNA6mRNA表达水平表达水平 呈显著正相关呈显著正相关 （y=-0.454+0.024xy=-0.454+0.024x，r r=0.752=0.752，p p0.05 0.05 ） 相关性分析相关性分析 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 010203040 NFBDNA结合活性（） IL6RNA表达水平（相对值） 讨讨 论论 IL-6 是重要的具有广泛免疫调节作用的细胞 因子，生物活性多样： 诱导破骨细胞的形成和活化 调节细胞的增殖和分化 促进B细胞增殖分化和分泌抗体 促进T细胞增殖分化和表达IL-2受体 促进巨嗜细胞成熟 u Bujia：免疫组化研究，酶联免疫吸附实验 u Marendat ：免疫组化研究胆脂瘤上皮内IL-6 的表达与听小骨链的破坏的关系 u 本研究：RT-PCR技术 在RNA水平证明IL-6在胆脂瘤组织中存在 异常转录和过度活化，进一步证实IL-6可能 参与了胆脂瘤的发生发展的病理过程 细胞因子细胞因子 IL-1、6、8，FGF、KGF，TNF、EGF、 INF、GM-CSF、PDGF、TGF- 调节免疫细胞或调节免疫细胞或 炎性细胞的活性炎性细胞的活性 刺激破骨细胞刺激破骨细胞 的形成和活化的形成和活化 促进各种酶类促进各种酶类 的产生和释放的产生和释放 调节细胞增殖调节细胞增殖 、凋亡相关基、凋亡相关基 因的转录因的转录 胆脂瘤发生发展！胆脂瘤发生发展！ 尽管细胞因子在胆脂瘤发病中的作用已得到 公认，但究竟是什么机制在调控众多细胞因 子的释放尚不清楚 炎性介质的基因表达是通过转录机制来实现 的，由于在IL-6等细胞因子的转录启动子上 均存在NF-B的结合位点，因此NF-B的活化 在胆脂瘤细胞因子产生中应起着关键调控作 用 u 本实验采用EMSA技术检测NF-B在核内的 DNA结合活性以研究NF-B在胆脂瘤组织中的 活化状态，结果证实胆脂瘤组织存在NF-B 的 过度活化 u 研究亦显示：IL-6mRNA的表达水平与NF- B的活化呈显著正相关 NF-B很可能在胆脂瘤的发生和持续 发展中起重要作用，例如在胆脂瘤细胞因子的 调控中起着扳机点的作用 由于NF-B 可以被炎性细胞因子激活，因 此释放的细胞因子反过来又可进一步活化NF- B，由此形成一个正反馈调节，使NF-B 处于 一个持续的活化状态，导致细胞因子等炎性介 质大量释放，形成炎症的级联反应，并使炎症 不断扩大，导致胆脂瘤的持续发展及广泛的骨 质破坏，而NF-B在其中可能起关键作用 目前，靶向NF-B的治疗已 在很多疾病中取得了重大的进展 。如果我们能抑制NF-B的活化 ，就有可能阻断IL-6 及其它