论文-董燕-青藤碱对LPS刺激的小鼠及RAW264.7细胞A2A、P2X7表达的影响

青藤碱对LPS刺激的小鼠及RAW264.7细胞A2A、P2X7表达的影响李景第一作者 李景，在读硕士生，从事中药免疫药理研究，Tel: E-mail: 994274916 通讯作者 *董燕，博士，研究员，博士生导师，从事中药免疫药理研究，Tel: E-mail: ，吴阳阳，周海松，朱瑞丽，易浪，董燕*，王培训（1. 广州中医药大学 临床药理研究所免疫研究室，广州 510405） 摘要 目的 探讨青藤碱(sinomenine，Sin)对LPS刺激的小鼠内毒素血症模型及巨噬细胞RAW264.7细胞炎症模型嘌呤受体A2A、P2X7表达的影响。 方法 BALB/c小鼠设空白对照组、模型组、青藤碱组（40mg/kg、80mg/kg、160mg/kg），青藤碱组给予腹腔注射青藤碱30min后，模型组和青藤碱组给予腹腔注射LPS（15mg/kg）建立内毒素血症小鼠模型，ELISA法检测小鼠血清肿瘤坏死因子-（TNF-）、白细胞介素-6（IL-6）水平；RT-PCR检测肝脏、脾脏嘌呤受体A2A，P2X7的表达。RAW264.7细胞设空白组、LPS组、青藤碱组，青藤碱组给予青藤碱（300mol/L）干预2h之后，LPS组和青藤碱组均给予LPS（100ng/mL），继续培养8h后，ELISA法检测上清TNF-分泌量，RT-PCR检测细胞P2X7、A2A的mRNA表达。 结果 LPS刺激下小鼠血清TNF-和IL-6水平均上升，肝脏、脾脏组织中嘌呤受体A2A、P2X7的表达均升高，青藤碱能下调TNF-和IL-6水平，并抑制A2A、P2X7的表达；体外LPS刺激下，RAW264.7细胞分泌TNF-增加，A2A、P2X7的表达增加，青藤碱抑制TNF-的分泌，并下调P2X7的表达，但对A2A的表达有促进作用。 结论 青藤碱对LPS刺激的小鼠肝脏、脾脏及体外巨噬细胞中嘌呤受体P2X7的表达增加均表现抑制作用，而对不同组织细胞中A2A表达的影响不同，相关机制有待深入。 关键词 青藤碱；嘌呤受体；脂多糖；细胞因子 青藤碱(sinomenine，Sin)是中药青风藤的主要活性成分，有抗炎、抗风湿、免疫抑制、镇痛、镇静等多种药理作用1。临床多用其盐酸盐制剂，用于治疗类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)等免疫性疾病疗效较好，副作用小。也有研究报道青藤碱对LPS诱导的肝炎和急性肺损伤动物模型有干预和保护作用2。 嘌呤受体参与调控机体的免疫应答，其组织分布广泛，其中又以免疫系统表达最为丰富，发挥重要的免疫调节作用，嘌呤受体A2A、P2X7与炎症反应密切相关。青藤碱发挥抗炎作用是否影响嘌呤受体及其内在机制尚不清楚。本实验通过检测LPS刺激的内毒素血症小鼠和巨噬细胞炎症模型的炎性因子及嘌呤受体A2A、P2X7 的mRNA表达变化，观察青藤碱的抗炎作用及对A2A、P2X7表达的影响，为进一步研究青藤碱的抗炎机制打下基础。1 材料与方法1.1 实验动物及细胞株 健康SPF级BALB/c小鼠，雄性，体重202g，购于广东省动物中心，合格证号：SCXK(粤）2014-0035。RAW264.7细胞株小鼠巨噬细胞株，引自武汉大学保藏中心。1.2 主要药物、试剂与仪器 LPS（美国Sigma公司）；青藤碱（分析标准品，HPLC97，美国Aladdin公司）；盐酸青藤碱（Melonepharma大连美仑生物公司）；完全培养液RPMI1640（美国GIBCO）；胎牛血清(FBS)（HYCLOME公司）；青霉素（美国Sigma公司）；链霉素（NEUPROBE公司）；ELISA检测试剂盒（Ebioscience产品）；Trizol（Invitrogen产品）；琼脂糖（Biowest Regular AGAROSE G-10，西班牙）；逆转录试剂盒（Invitrogen产品）；PCR试剂盒（Molecular Biology产品）；A2A、P2X7及内参基因-actin 引物均由生工生物工程公司合成。全自动数码凝胶图像分析系统（Tanon1600，中国上海）；多功能酶标仪（BioTek Synergy HT，美国）；高速冷冻离心机（Eppendorf 5810R，德国）；紫外-可见分光光度计（Beckman Du730，美国）；电泳仪（BIO-RAD，美国）。1.3 动物分组、造模及给药 BALB/c小鼠30只，随机分为3组：空白对照组（10只）、模型组（10只）、青藤碱40mg/kg组（10只）、青藤碱80mg/kg组（5只）、青藤碱160mg/kg组（5只），编110或15号。模型组一次性腹腔注射LPS（15mg/kg），青藤碱组于注射LPS前30min腹腔注射不同剂量青藤碱，空白对照组腹腔注射等量PBS。1.4 动物标本采集及指标检测 小鼠摘眼球采血0.5ml左右，LPS刺激1h时各组15号采血用于检测TNF-，3h时610号采血用于检测IL-6，采血后室温静置1h，离心（4，900rpm，15min）取上清，用于ELISA检测。610号取血后，脱颈椎处死小鼠，摘取肝脏、脾脏置于70冰箱保存，用于RT-PCR检测。1.5 细胞培养及给药 RAW264.7细胞采用含体积分数为10%胎牛血清的RPMI1640培养液培养，调整细胞浓度为1105mL-1，每孔加1mL入24孔板，设空白组、LPS组、青藤碱300mol/L组，每组3个复孔。37、5% CO2细胞培养箱中培养过夜后换新的RPMI1640液1mL，青藤碱组加含青藤碱（300mol/L）的培养液干预2h之后，LPS组及青藤碱组加LPS 至终浓度100ng/mL，空白组加入等体积的PBS。继续培养8h后，分别收集上清用于ELISA检测，再收集细胞RNA裂解液，每孔加入500L Trizol裂解液，吹打细胞裂解后收集至EP管中，-70保存待测。1.6 ELISA检测小鼠血清及细胞上清中TNF-或IL-6 取小鼠血清或细胞上清，适当稀释后，按照ELISA检测试剂盒说明书进行TNF-或IL-6的检测。多功能酶标仪检测吸光度。1.7 RT-PCR检测嘌呤受体A2A、P2X7 mRNA的表达 采用Trizol裂解肝脏、脾脏组织及巨噬细胞，提取总RNA，按照逆转录试剂盒说明书进行逆转录。RT-PCR中所用的引物由生工生物工程公司合成。P2X7：上游5-ATTATGGCACCGTCAAGTGG-3，下游5-TCAGTAGGACACCAGGCAGA -3，产物439bp；A2A：上游5-CCTGCACATCATCAACTGCT-3，下游5-TGCTCCTGGGTAAGAAGCTC -3，产物411bp；-actin：上游5-TATGCCAACACAGTGTTGTCTGG-3，下游5-TACTCCTGCTTGCTGATCCACAT-3，产物206bp。PCR扩增条件：94、3min，然后94、30s，60、30s，72、1min，共40个循环，然后72、5min，最后4无限循环，反应结束。使用1.5%的琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为：恒压110V，50min。使用Tanon1600全自动数码凝胶图像分析系统进行拍照及分析。 1.9 统计学处理 实验数据用SPSS17.0 for windows统计软件包处理分析，统计方法使用One-Way ANOVA及LSD检验，数据用S表示，P0.05表示有统计学意义。2 结果2.1 青藤碱对内毒素血症模型小鼠血清TNF-、IL-6含量的影响 由图1可见，给予LPS刺激1h时，模型组血清TNF-含量高于空白对照组，青藤碱40mg/kg组、80mg/kg组、160mg/kg组均显著低于模型组，均有统计学差异（p0.05）。青藤碱各剂量组之间有统计学差异（p0.05），表明青藤碱对TNF-的抑制有剂量依赖性。由图2可见，给予LPS刺激3h时，模型组血清IL-6含量高于空白对照组，有统计学差异（p0.05），青藤碱组IL-6低于模型组，有统计学差异（p0.05）。 p0.05，与空白组比较；p0.05，与模型组比较图1 不同剂量青藤碱对小鼠血清TNF-的影响()Fig. 1 Effect of different concentrations of sinomenine on TNF- in mice serump0.05，与空白组比较；p0.05，与模型组比较图2 青藤碱对小鼠血清IL-6的影响()Fig. 2 Effect of sinomenine on IL-6 in mice serum 2.2 青藤碱对LPS刺激的RAW264.7细胞分泌TNF-的影响 由图3可见，给予LPS刺激时，LPS组血清TNF-含量高于空白对照组，有统计学差异（p0.05），青藤碱(300mol/L)组TNF-低于LPS组，有统计学差异（p0.05）。p0.05，与空白组比较；p0.05，与模型组比较图3 青藤碱对RAW264.7细胞分泌TNF-的影响()Fig. 3 Effect of sinomenine on serum TNF- secretion in RAW264.7 cells 2.3 青藤碱对小鼠肝脏、脾脏嘌呤受体A2A表达的影响 如图4、5所示，在小鼠肝脏、脾脏扩增到250500bp大小的产物，与预期扩增A2A的411 bp目的条带一致。内参-actin为206 bp。经相对表达量的计算（表1），模型组小鼠肝脏、脾脏A2A受体的表达水平均高于空白组，有统计学差异（p0.05）；青藤碱组小鼠肝脏、脾脏A2A受体的表达水平均低于模型组，有统计学差异（p0.05）。M. marker；1、2空白组；3、4模型组；5、6 Sin组图4 小鼠肝脏A2A mRNA的RT-PCR电泳图()Fig4 Results of RT-PCR for A2A mRNA in mice liverM. marker；1、2空白组；3、4模型组；5、6 Sin组图5 小鼠脾脏A2A mRNA的RT-PCR电泳图()Fig5 Results of RT-PCR for A2A mRNA in mice spleen 表1 各组小鼠肝脏、脾脏A2A的mRNA相对表达量（，n=5）Table1 Comparison of A2A of the liver and spleen in different groups 组 别剂量 /mgkg-1肝脏A2A/-actin脾脏A2A/-actin空白-0.760.003 0.830.002模型-0.960.0020.930.002青藤碱400.880.0020.750.001p0.05，与空白组比较；p0.05，与模型组比较2.4 青藤碱对小鼠肝脏、脾脏嘌呤受体P2X7表达的影响 如图7、8所示，在小鼠肝脏、脾脏扩增到250500bp大小的产物，与预期扩增P2X7的439 bp目的条带一致。内参-actin为206 bp。经相对表达量的计算（表2），模型组小鼠肝脏、脾脏P2X7受体的表达水平均高于空白组，有统计学差异（p0.05）；青藤碱组小鼠肝脏、脾脏P2X7受体的表达水平均低于模型组，有统计学差异（p0.05）。 M. marker；1、2空白组；3、4模型组；5、6 Sin组图6 小鼠肝脏P2X7 mRNA的RT-PCR电泳图()Fig6 Results of RT-PCR for P2X7 mRNA in mice liver liverM. marker；1、2空白组；3、4模型组；5、6 Sin组图7 小鼠脾脏P2X7 mRNA的RT-PCR电泳图()Fig7 Results of RT-PCR for P2X7 mRNA in mice spleen表2 各组小鼠肝脏、脾脏P2X7的mRNA相对表达量（，n=5）Table2 Comparison of P2X7 of the liver and spleen in different groups 组 别剂量 /mgkg-1肝脏P2X7/-actin脾脏P2X7/-actin空白-0.490.010 0.590.003模型-0.690.0150.820.003青藤碱400.510.0150.650.003p0.05，与空白组比较；p0.05，与模型组比较 2.5 青藤碱对RAW264.7细胞嘌呤受体A2A、P2X7表达的影响 如图8所示，在RAW264.7细胞扩增到250500bp大小的产物，与预期扩增A2A的411 bp目的条带一致。内参-actin为206 bp。经相对表达量的计算（表3），LPS组与空白组相比，A2A受体mRNA水平显著升高（P0.01）。青藤碱组与LPS组相比，A2A受体mRNA水平升高（P0.05），说明青藤碱使炎症状态下巨噬细胞A2A受体表达升高。 如图9所示，在RAW264.7细胞扩增到250500bp大小的产物，与预期扩增P2X7的439 bp目的条带一致。内参-actin为206 bp。经相对表达量的计算（表3），在RAW264.7细胞中，LPS组与空白组相比，P2X7受体mRNA水平显著升高（P0.01）；青藤碱组与LPS组相比，P2X7受体mRNA水平显著降低（P0.01），说明青藤碱抑制了LPS对巨噬细胞P2X7受体基因表达的影响。M. marker；1、4空白组；2、5模型组；3、6 Sin组图8 RAW264.7细胞A2A mRNA的RT-PCR电泳图Fig8 A2A RT-PCR of mRNA of electrophoresis in RAW264.7 cellsM. marker；1、4空白组；2、5模型组；3、6 Sin组图9 RAW264.7细胞P2X7 mRNA的RT-PCR电泳图Fig9 P2X7 RT-PCR of mRNA of electrophoresis in RAW264.7 cells表3 小鼠肝脏、脾脏和RAW264.7 细胞A2A的mRNA相对表达量（）Table3 Comparison of A2A、P2X7 of RAW264.7 cells in different groups组 别NA2A/-actinP2X7/-actin空白组30.690.12 0.580.02LPS组30.960.090.990.04青藤碱组31.060.10.690.01p0.05，与空白组比较；p0.05，与模型组比较3. 讨论 机体在感染、创伤的病理过程中会产生大量腺苷，腺苷通过和腺苷受体结合发挥对免疫应答及炎性反应的调控作用3。在不同的病理条件下，A2A受体活化的免疫调节作用方向不同、产生的效应不同4。 8丰富系统根据已有研究认为A2A在不同炎症模型、不同组织细胞中的表达变化情况较为复杂5。A2A在脓毒症早期发挥非特异性的抗菌、抗炎、抗感染作用，活化中性粒细胞的A2A受体可以通过cAMP依赖及非依赖途径抑制炎性因子，激活巨噬细胞及树突状细胞上的A2A受体则可以促使其释放保护性的细胞因子6。在组织损伤与修复的作用过程中，A2A受体发挥保护和创伤促愈作用，其机制主要在于对组织损伤后炎症反应的抑制以及对修复过程中免疫细胞功能的促进而实现7。本研究发现，炎症状态下A2A表达升高，青藤碱对内毒素血症模型小鼠发挥抗炎作用时肝脏、脾脏 A2A的表达下降，但对RAW264.7巨噬细胞A2A表达表现上调作用，提示青藤碱对不同的组织、细胞中A2A表达的影响有不同，相关机制有待深入。 P2X7在细胞的炎症反应过程中扮演着感受器的角色，即监测炎症部位的危险信号ATP释放情况，进一步促使炎症细胞活化并释放炎症因子。有研究表明P2X7受体参与炎症反应中细胞因子的释放。敲除P2X7受体的动物，其炎症反应及疼痛症状明显减弱8。在本研究中，LPS刺激的体内外模型中P2X7受体表达均增加，而青藤碱抑制P2X7受体mRNA的表达，可能与青藤碱有效抑制LPS模型的炎性细胞因子分泌相关。 本研究初步探讨了青藤碱对LPS体内外模型A2A、P2X7受体mRNA表达的影响，结果表明青藤碱降低LPS模型炎症水平，并降低嘌呤受体P2X7的表达，而对A2A表达的调节作用有所不同，本研究为进一步研究青藤碱抗炎机制及其与A2A、P2X7的内在关系打下基础。参考文献：1 马德莲，郭玲等. 中草药的免疫作用J. 中国实验方剂学杂志, 2003, 9(5): 63-65.2 Jun L, Zhao XH, Zeng YJ, Dai SS. Sinomenine protects against lipopolysaccharide-induced acute lung injury in mice via adenosine A2A receptor signalingJ. PLOS One, 2013, 8(3): e59257.3 Altavilla D, Squadrito F, Polito F, et al. Activation