微生物的生长繁殖.ppt

污染控制微生物学 第七章 微生物的 生长繁殖 生长和繁殖统称为发育，发育是一个复杂的生 命活动。当微生物吸收营养物质后，通过合成 代谢作用，合成新的细胞成分，使菌体的重量增加( 主要是原生质和其他组成成分有规律地增加)，菌体 体积长大，这种现象称为生长。细胞的生长是有限 度的，当细胞增长到一定程度时就开始分裂，这种 菌体数量增多的现象称为繁殖。生长是繁殖的基础 ，繁殖是生长的结果。生长和繁殖虽有区别，但关 系十分密切。微生物群体在生长过程中，个体的细 胞体积和重量变化不易被察觉，所以，常以细胞数 量的增加或以细胞群体重量的增加作为生长繁殖的 指标。 微生物纯培养的生长 微生物学中将在实验室条件下，从一个细胞或微生物学中将在实验室条件下，从一个细胞或 一种细胞群繁殖得到的后代称为纯培养。相对应的称一种细胞群繁殖得到的后代称为纯培养。相对应的称 为不纯培养物。为不纯培养物。 纯培养的分离方法纯培养的分离方法 稀释倒平皿法稀释倒平皿法 将待分离的材料作一系列稀释将待分离的材料作一系列稀释( (如如1:101:10、1:1001:100、 1:1 0001:1 000、1:10 000)1:10 000)，取不同稀释液各少许与已熔化，取不同稀释液各少许与已熔化 并冷却至并冷却至45 45 的琼脂培养基相混合，倾入灭过菌的的琼脂培养基相混合，倾入灭过菌的 培养皿中，待琼脂培养基凝固后，保温培养一定培养皿中，待琼脂培养基凝固后，保温培养一定 微生物纯培养的生长微生物纯培养的生长 时间，即有菌落出时间，即有菌落出 现。如果稀释得当，现。如果稀释得当， 平皿中出现分散的单平皿中出现分散的单 个菌落便可能是由一个菌落便可能是由一 个细菌繁殖所形成。个细菌繁殖所形成。 挑取此单个菌落或再挑取此单个菌落或再 重复以上操作数次，重复以上操作数次， 可得到纯培养。可得到纯培养。 微生物纯培养的生长微生物纯培养的生长 划线法划线法 将熔化的琼脂培养基倾入无菌培养皿中，冷凝后将熔化的琼脂培养基倾入无菌培养皿中，冷凝后 ，用接种环，用接种环NFDCBNFDCB取少许待分离材料，在培养基取少许待分离材料，在培养基 表面连续划线，如，可作平行划线、扇形划线或其他表面连续划线，如，可作平行划线、扇形划线或其他 形式连续划线，随着接种环在培养基上的移动，细菌形式连续划线，随着接种环在培养基上的移动，细菌 得以分散，经保温培养即形成菌落。在划线的开始部得以分散，经保温培养即形成菌落。在划线的开始部 分，细菌分散度小，形成菌落往往连在一起。但由于分，细菌分散度小，形成菌落往往连在一起。但由于 连续划线，细菌逐渐减少，划到最后常可形成单独孤连续划线，细菌逐渐减少，划到最后常可形成单独孤 立的菌落。立的菌落。 微生物纯培养的生长微生物纯培养的生长 这种单独的菌落可能是由单个细胞形成的这种单独的菌落可能是由单个细胞形成的 ，因而获得纯培养。用其他工具如形玻棒代替，因而获得纯培养。用其他工具如形玻棒代替 接种环在琼脂培养基表面涂布，亦可得到同样接种环在琼脂培养基表面涂布，亦可得到同样 结果。结果。 微生物纯培养的生长微生物纯培养的生长 单细胞挑取法单细胞挑取法 单细胞挑取法是从待分离材料中只挑取一单细胞挑取法是从待分离材料中只挑取一 个细胞来培养。可用一台显微挑取器，装置于个细胞来培养。可用一台显微挑取器，装置于 显微镜上，把一滴细菌悬浮液置于载玻片上，显微镜上，把一滴细菌悬浮液置于载玻片上， 用装于显微挑取器上的极细的毛细吸管，在显用装于显微挑取器上的极细的毛细吸管，在显 微镜下对准一个单独的细菌细胞挑取，再接种微镜下对准一个单独的细菌细胞挑取，再接种 于培养基上培养而得纯培养。于培养基上培养而得纯培养。 微生物纯培养的生长微生物纯培养的生长 利用选择培养基分离法利用选择培养基分离法 不同的细菌需要不同的营养物。因此，可以把培不同的细菌需要不同的营养物。因此，可以把培 养基配制成适合于某种细菌生长而限制其他细菌生长养基配制成适合于某种细菌生长而限制其他细菌生长 的环境。这样的选择培养基可用来分离培养纯种。的环境。这样的选择培养基可用来分离培养纯种。 也可以将待分离的样品先进行适当处理，以排除也可以将待分离的样品先进行适当处理，以排除 不需要的微生物。例如，想分离得到芽孢细菌，可在不需要的微生物。例如，想分离得到芽孢细菌，可在 倒平皿前将样品在高温处理一段时间，以破坏所有的倒平皿前将样品在高温处理一段时间，以破坏所有的 或大部分的非芽孢细菌，这样分离得到的菌落将是芽或大部分的非芽孢细菌，这样分离得到的菌落将是芽 孢形成菌。孢形成菌。 微生物纯培养分离方法的比较微生物纯培养分离方法的比较 方方 法法应用范围应用范围 稀释倒平皿法稀释倒平皿法即可定性，又可定量，用途广泛即可定性，又可定量，用途广泛 划线法划线法方法简便，多用于分离细菌方法简便，多用于分离细菌 单细胞挑取法单细胞挑取法局限于高度专业化的研究局限于高度专业化的研究 利用选择培养基分利用选择培养基分 离法离法 适用于分离某些生理类型较特殊的适用于分离某些生理类型较特殊的 微生物微生物 微生物纯培养的生长 微生物生长量的测定微生物生长量的测定 主要有测定微生物的数量、重量和细胞物质成分主要有测定微生物的数量、重量和细胞物质成分 等方法。等方法。 测定微生物的数量测定微生物的数量 1. 1.全数测定全数测定( (直接计数法直接计数法) ) (1) (1)计数器直接计数法计数器直接计数法 (2)(2)涂片染色计数涂片染色计数 (3)(3)比浊法比浊法 微生物纯培养的生长 微生物纯培养的生长 2. 2.活菌计数活菌计数( (间接计数法间接计数法) ) (1) (1)平板计数法平板计数法 (2)(2)薄膜过滤计数法薄膜过滤计数法 微生物纯培养的生长 测定细胞物质的重量测定细胞物质的重量 采用干重法，用离心或过滤的方法将菌体从菌悬液采用干重法，用离心或过滤的方法将菌体从菌悬液 中分离出来，洗净，烘干，称重，求得单位容积菌悬液中分离出来，洗净，烘干，称重，求得单位容积菌悬液 中细胞的干重。这是测定细胞重量较为直接而可靠的方中细胞的干重。这是测定细胞重量较为直接而可靠的方 法，但只适用于菌体浓度较高的样品，而且要求样品中法，但只适用于菌体浓度较高的样品，而且要求样品中 不含菌体以外的其他干物质。不含菌体以外的其他干物质。 在活性污泥法中常采用干重法来测定活性污泥的重在活性污泥法中常采用干重法来测定活性污泥的重 量，以近似代表活性污泥中微生物的量，这一指标称为量，以近似代表活性污泥中微生物的量，这一指标称为 活性污泥浓度活性污泥浓度( (符号为符号为MLSS)MLSS)，它表示每升活性污泥混合它表示每升活性污泥混合 液中活性污泥的毫克数。这种测定结果既包括活菌和死液中活性污泥的毫克数。这种测定结果既包括活菌和死 菌量，又包括有机颗粒和无机盐类的重量，因而，这一菌量，又包括有机颗粒和无机盐类的重量，因而，这一 指标随非生物物质含量的增加，可靠性降低。指标随非生物物质含量的增加，可靠性降低。 微生物纯培养的生长 DNADNA含量测定法含量测定法 由于由于DNADNA在细胞生长中起重要作用，所以，测定在细胞生长中起重要作用，所以，测定 DNADNA的含量也是研究微生物生长的一种重要的化学测定的含量也是研究微生物生长的一种重要的化学测定 方法方法。DNADNA的测定不但可以反映细胞物质的重量，并且的测定不但可以反映细胞物质的重量，并且 由于每个细菌细胞中由于每个细菌细胞中DNADNA含量对于某类群微生物来说较含量对于某类群微生物来说较 恒定恒定( (平均为平均为8.4108.410-5 -5 ) )，所以，通过测定细菌的，所以，通过测定细菌的DNADNA 还可推算出细菌细胞的数量。还可推算出细菌细胞的数量。 此外，还可采用测定此外，还可采用测定ATPATP的方法，但由于细胞内的方法，但由于细胞内 ATPATP含量随发育阶段的不同而变化较大，因而，用于反含量随发育阶段的不同而变化较大，因而，用于反 映微生物量不如映微生物量不如DNADNA佳。佳。 微生物的生长曲线 细菌纯培养的生长曲线细菌纯培养的生长曲线 研究细菌纯培养的生长曲线是采用分批培养，或研究细菌纯培养的生长曲线是采用分批培养，或 称为称为间歇培养间歇培养( (batch culture)batch culture)。分批培养分批培养就是在一定就是在一定 体积的液体培养基中接种少量细菌并保持一定的条件体积的液体培养基中接种少量细菌并保持一定的条件 ( (如温度、如温度、pHpH、溶解氧等溶解氧等) )进行培养，结果出现了细菌进行培养，结果出现了细菌 数量由少到多，并达到高峰，又由多变少的变化规律数量由少到多，并达到高峰，又由多变少的变化规律 。测定生长曲线时，将少量经纯培养的细菌接种到经。测定生长曲线时，将少量经纯培养的细菌接种到经 灭菌的液体培养基中，在适宜条件下培养，定时取样灭菌的液体培养基中，在适宜条件下培养，定时取样 测定细菌数量。以细菌数的对数为纵坐标，生长时间测定细菌数量。以细菌数的对数为纵坐标，生长时间 为横坐标，可得图所示的曲线。为横坐标，可得图所示的曲线。 微生物的生长曲线 迟缓期迟缓期( (lag phase) lag phase) 迟缓期又称滞留适应期。当菌种接种到新鲜培迟缓期又称滞留适应期。当菌种接种到新鲜培 养基后，细菌并不立即生长繁殖，而要经过一段时间养基后，细菌并不立即生长繁殖，而要经过一段时间 的调整和适应，以合成多种酶，并完善体内的酶系统的调整和适应，以合成多种酶，并完善体内的酶系统 和细胞的其他成分。在这个时期，细胞的代谢活力很和细胞的其他成分。在这个时期，细胞的代谢活力很 强，蛋白质和强，蛋白质和RNARNA含量增加，菌体体积显著增大。含量增加，菌体体积显著增大。 在迟缓期末，细菌的长度可达接种时的在迟缓期末，细菌的长度可达接种时的6 6倍。迟缓期倍。迟缓期 末期和对数期前期的细胞，对热、化学物质等不良条末期和对数期前期的细胞，对热、化学物质等不良条 件的抵抗力减弱。件的抵抗力减弱。 细菌的生长曲线可以分为四个时期细菌的生长曲线可以分为四个时期 微生物的生长曲线 迟缓期持续时间的长短随菌种特性、接种量、菌迟缓期持续时间的长短随菌种特性、接种量、菌 龄与移种至新鲜培养基前后所处的环境条件是否相同龄与移种至新鲜培养基前后所处的环境条件是否相同 等因素有关，短的只几分钟，长的可达几小时。如果等因素有关，短的只几分钟，长的可达几小时。如果 用对数期的细菌接种到相同的培养基上，并在同一温用对数期的细菌接种到相同的培养基上，并在同一温 度下培养，细菌则仍以原来的生长速度继续对数生长度下培养，细菌则仍以原来的生长速度继续对数生长 ，而不会出现迟缓期，因而可以缩短培养时间。，而不会出现迟缓期，因而可以缩短培养时间。 微生物的生长曲线 对数期对数期( (log phase) log phase) 迟缓期末，细胞开始出现分裂，培养液中的菌数迟缓期末，细胞开始出现分裂，培养液中的菌数 增加，进入对数期。在此时期，以细菌数的对数与培增加，进入对数期。在此时期，以细菌数的对数与培 养时间做图则成一直线。养时间做图则成一直线。 对数期细菌按几何级数增加，对数期细菌按几何级数增加，12481248 ，即，即2 2 0 0 22 1 1 22 2 2 22 3 3 22 n n 。每分裂一次为一个世代每分裂一次为一个世代 ，每经过一个世代，群体数目增加一倍。可见，细菌，每经过一个世代，群体数目增加一倍。可见，细菌 的群体生长是按指数速率进行的，因而亦称做指数增的群体生长是按指数速率进行的，因而亦称做指数增 长。细菌群体的这种指数增长可用以下方程式表示长。细菌群体的这种指数增长可用以下方程式表示 微生物的生长曲线 细菌群体的这种指数增长可用以下方程式表示：细菌群体的这种指数增长可用以下方程式表示： 2 2= = 1 1 2 2 式中：式中： 1 1 、 2 2 分别为时间分别为时间 1 1 和和 2 2 时刻的细胞数；时刻的细胞数； 世代数。世代数。 世代时间是由遗传性决定的，不同菌种对数期的世代时间是由遗传性决定的，不同菌种对数期的 世代时间不同，同一菌种的世代时间受培养基组成及世代时间不同，同一菌种的世代时间受培养基组成及 物理环境的影响也不同。物理环境的影响也不同。 对数期细菌的生长速度达到高潮，世代时间最短对数期细菌的生长速度达到高潮，世代时间最短 ，细胞的代谢活性比较稳定，酶的活力也高。这个时，细胞的代谢活性比较稳定，酶的活力也高。这个时 期的细胞是作为研究工作的理想材料。期的细胞是作为研究工作的理想材料。 微生物的生长曲线 稳定期稳定期( (stationary phase)stationary phase) 由于在生长过程中，营养物质不断被消耗，同时由于在生长过程中，营养物质不断被消耗，同时 ，某些有毒性的代谢产物不断积累，致使细菌分裂的，某些有毒性的代谢产物不断积累，致使细菌分裂的 速率降低，世代时间延长，细菌细胞活力减退。这时速率降低，世代时间延长，细菌细胞活力减退。这时 ，群体中细菌的繁殖速度与死亡速度近乎相等，活菌，群体中细菌的繁殖速度与死亡速度近乎相等，活菌 数目保持稳定。数目保持稳定。 处于稳定期的细胞开始积累体内贮藏物质，如肝处于稳定期的细胞开始积累体内贮藏物质，如肝 糖粒、淀粉粒、异染颗粒等，研究认为，此时菌胶团糖粒、淀粉粒、异染颗粒等，研究认为，此时菌胶团 细菌大量分泌体外贮藏物质荚膜，所以，更易形成菌细菌大量分泌体外贮藏物质荚膜，所以，更易形成菌 胶团。大多数产芽孢细菌在此时期开始产生芽孢。胶团。大多数产芽孢细菌在此时期开始产生芽孢。 微生物的生长曲线 衰亡期衰亡期( (death phase)death phase) 此期环境变得更不适于微生物生长，细胞的活此期环境变得更不适于微生物生长，细胞的活 力继续衰退，死亡率大于繁殖率，活菌数迅速减少。力继续衰退，死亡率大于繁殖率，活菌数迅速减少。 在衰亡期中细胞形状和大小很不一致，有些产生畸形在衰亡期中细胞形状和大小很不一致，有些产生畸形 细胞，细菌的生命活动主要依赖于内源呼吸，并呈现细胞，细菌的生命活动主要依赖于内源呼吸，并呈现 大量死亡。大量死亡。 微生物的生长曲线反映一种微生物在一定生活环微生物的生长曲线反映一种微生物在一定生活环 境中的生长繁殖和死亡规律。它既可作为营养和环境境中的生长繁殖和死亡规律。它既可作为营养和环境 影响的理论研究指标，亦可作为调控微生物生长发育影响的理论研究指标，亦可作为调控微生物生长发育 的依据，指导微生物生产实践。的依据，指导微生物生产实践。 微生物的生长曲线 微生物的生长曲线 连续培养连续培养 研究细菌纯培养的生长曲线是采用分批培养，或研究细菌纯培养的生长曲线是采用分批培养，或 称为称为间歇培养间歇培养( (batch culture)batch culture)。分批培养分批培养就是在一定就是在一定 体积的液体培养基中接种少量细菌并保持一定的条件体积的液体培养基中接种少量细菌并保持一定的条件 ( (如温度、如温度、pHpH、溶解氧等溶解氧等) )进行培养，结果出现了细菌进行培养，结果出现了细菌 数量由少到多，并达到高峰，又由多变少的变化规律数量由少到多，并达到高峰，又由多变少的变化规律 。测定生长曲线时，将少量经纯培养的细菌接种到经。测定生长曲线时，将少量经纯培养的细菌接种到经 灭菌的液体培养基中，在适宜条件下培养，定时取样灭菌的液体培养基中，在适宜条件下培养，定时取样 测定细菌数量。以细菌数的对数为纵坐标，生长时间测定细菌数量。以细菌数的对数为纵坐标，生长时间 为横坐标，可得图所示的曲线。为横坐标，可得图所示的曲线。 连续培养：连续培养：是一种让新鲜培养基不断流入是一种让新鲜培养基不断流入 ，失效培养基不断流出，以维持培养基组成相应，失效培养基不断流出，以维持培养基组成相应 稳定、避免代谢产物积累，从而使对数生长期能稳定、避免代谢产物积累，从而使对数生长期能 较长时间维持下去的一种培养方法。较长时间维持下去的一种培养方法。 装置：装置：培养基贮存系统、新鲜培养基的流入培养基贮存系统、新鲜培养基的流入 系统、培养物流出系统和控制系统。系统、培养物流出系统和控制系统。 目的：目的：培养物的密度或培养基的化学组成维培养物的密度或培养基的化学组成维 持在一定的水平上持在一定的水平上 微生物的生长曲线 连续培养装置的类型连续培养装置的类型 连续培养装置有两种类型：连续培养装置有两种类型： 恒化器连续培养装置恒化器连续培养装置 恒浊器连续培养装置恒浊器连续培养装置 常用的一种连续培养方法为恒化连续培常用的一种连续培养方法为恒化连续培 养。养。 微生物的生长曲线 微生物的生长曲线 恒化器连续培养装置恒化器连续培养装置 通过控制培养基中某种限制性营养物通过控制培养基中某种限制性营养物 质浓度在一定范围内变化，以控制机体生质浓度在一定范围内变化，以控制机体生 长速率的变化，从而控制新鲜培养基流入长速率的变化，从而控制新鲜培养基流入 的速率。的速率。当某种营养物质浓度低于或高于当某种营养物质浓度低于或高于 原定范围时，就会通过控制系统，调整培原定范围时，就会通过控制系统，调整培 养基流入的速率，以提高或降低这种物质养基流入的速率，以提高或降低这种物质 的浓度，从而使微生物生长速率维持一定的浓度，从而使微生物生长速率维持一定 ，保证连续培养正常进行。，保证连续培养正常进行。 微生物的生长曲线 在这种装置在这种装置 中，微生物的生中，微生物的生 长速度可以通过长速度可以通过 调节限制性底物调节限制性底物 浓度或培养基的浓度或培养基的 流速加以控制。流速加以控制。 通常只需要限制通常只需要限制 某一种底物某一种底物( (如氮如氮 源或能源源或能源) )的浓度的浓度 ，就可以调节生，就可以调节生 长速度。长速度。 活性污泥增长曲线活性污泥增长曲线 在废水生物处理中，为了描述活性污泥中微生在废水生物处理中，为了描述活性污泥中微生 物的生长，常采用间歇培养法获得图所示的曲线。物的生长，常采用间歇培养法获得图所示的曲线。 活性污泥中的微生物种类繁多，不仅包括细菌，而活性污泥中的微生物种类繁多，不仅包括细菌，而 且还含有原生动物和后生动物等微生物，因此，不且还含有原生动物和后生动物等微生物，因此，不 是纯培养的生长曲线，但曲线形式与纯培养的类似是纯培养的生长曲线，但曲线形式与纯培养的类似 。活性污泥增长曲线可以分为三个时期：。活性污泥增长曲线可以分为三个时期：对数生长对数生长 期期、减速生长期和内源呼吸期减速生长期和内源呼吸期。 微生物的生长曲线 vv对数生长期对数生长期 此期，微生物处在营养物质过剩的环境中，微此期，微生物处在营养物质过剩的环境中，微 生物以最大的速率氧化分解废水中的有机物，并合生物以最大的速率氧化分解废水中的有机物，并合 成新的细胞物质，因此，微生物迅速增长。这一时成新的细胞物质，因此，微生物迅速增长。这一时 期相当于纯培养生长曲线中的对数期。在此期间，期相当于纯培养生长曲线中的对数期。在此期间， 活性污泥微生物具有很高的能量水平，因而不能形活性污泥微生物具有很高的能量水平，因而不能形 成良好的活性污泥絮凝体。成良好的活性污泥絮凝体。 微生物的生长曲线 在对数生长期，活性污泥微生物的增长速率一在对数生长期，活性污泥微生物的增长速率一 般可用下式表示：般可用下式表示： 式中：式中：X X时刻挥发性活性污泥浓度时刻挥发性活性污泥浓度( (MLVSSMLVSS ) ) ， ( (也可由活性污泥浓度也可由活性污泥浓度MLVSSMLVSS代替代替) )； K K 1 1 挥发性活性污泥的增长速度常数。挥发性活性污泥的增长速度常数。 微生物的生长曲线 vv减速生长期减速生长期 此期营养物质不再过剩，而且成为微生物进一此期营养物质不再过剩，而且成为微生物进一 步生长的限制因素。科学实验表明，此时有机底物步生长的限制因素。科学实验表明，此时有机底物 的去除率与存在的有机底物浓度成正比。的去除率与存在的有机底物浓度成正比。 式中：式中：