分光光度法简介.ppt

第九章 分光光度法简述,主讲：陈友,琼州学院生物科学与技术学院,2009/11/02,第一节 基础知识,一、光的性质 光是一种电磁波。根据波长不同，光学光谱可分为：紫光（10nm-400nm）、可见光区（400nm-760nm）、红外区（760nm-300m）。 白光为复合光，可分为红、橙、黄、绿、青、蓝、紫七种颜色的光。 若两种适当颜色的单色光按一定强度比例混合后成为一种白光，则这两种单色光称为互补色光。,二、溶液对光的选择性吸收及溶液的呈色,当一束白光通过某溶液时，由于溶液选择性地吸收了可见光域中某波段的光，而使溶液呈不同颜色，与吸收光颜色互补。 例： 硫酸铜水溶液呈蓝色是因为吸收白光中的黄色呈其补色。 高锰酸钾水溶液呈紫色是因为吸收白光中的绿色呈其补色。,溶液的颜色和吸收光颜色的关系,吸收曲线的讨论：,（1）一种吸光物质对不同波长的光吸收程度不同。吸光度最大处对应的波长称为最大吸收波长max 。 吸收曲线是定量分析中选择入射光波长的重要依据。 （2）同一种物质浓度不同，其吸收曲线形状相似max不变。 在max处，吸光度A正比于浓度C。测定最灵敏 （3）吸收曲线可以提供物质的结构信息，并作为物质定性分析的依据之一。 （4）从吸收曲线形状可以解释物质的颜色。物质的颜色与吸收光颜色互为互补色。,光的互补：蓝 黄,第二节 光度分析法的基本原理,一、光度分析法： 在光谱分析中，依据物质分子对光的选择性吸收的特性而建立起来的分析方法称为光度分析法 主要有 红外吸收光谱：分子振动光谱，吸收光波长范围800nm50m 。 主要用于有机化合物结构鉴定。 紫外吸收光谱：电子跃迁光谱，吸收光波长范围200400 nm（近紫外区）。 可用于结构鉴定和定量分析。 可见吸收光谱：电子跃迁光谱，吸收光波长范 围400800nm ，主要用于有色物质的定量分析。,吸光光度法的特点：,（1）灵敏度高； （2）准确度高； （3）操作简便、快速； （4）应用广泛。,二、朗伯比耳定律 朗伯-比尔定律是紫外-可见分光光度法的理论基础。,朗伯-比尔定律：当一束平行单色光通过含有吸光物质的稀溶液时，溶液的吸光度与吸光物质浓度、液层厚度乘积成正比，即 A=lg =bc 式中：A 为吸光度； 摩尔吸光系数，单位L/mol.cm，与吸光物质的本性，入射光波长及温度等因素有关；c为吸光物质浓度，单位mol/L；b为透光液层厚度，单位cm；I0为入射光强度，I为透射光强度。,I0,I,朗伯比耳定律公式的物理意义： 当一束平行单色光通过均匀的有色溶液时，溶液的吸光度与溶液的浓度和液层厚度的乘积成正比。 是各种有色物质在一定波下的特征常数，它可衡量显色反应的灵敏度。其值越大，表示该有色物质对此波长光的吸收能力愈强，显色反应愈灵敏。,例1 有一5.00gL-1Fe2+溶液，用1,10-二氮菲显色，溶液为深红色，用比色法测定，吸收池厚度为2cm，于波长650nm处测量，得A=0.190，试计算该显色反应的。,例2 一粉红色Co(H2O)62+溶液，在1.0cm吸收池中，于波长530nm时测得A=0.20，已知该显色反应的=10Lmol-1cm-1，问此配合物的浓度是多少？,三、偏离Beer定律的因素,依据Beer定律，A与C关系应为经过原点的直线,偏离朗伯-比耳定律的因素,（1）入射光为非单色光,（3）光程的不一致性。 光源不是点光源，比色皿光径长度不一致，光学元件的缺陷引起的多次反射等，均造成光径不一致，从而与定律偏离。,（2）溶液的不均性。 实际样品的混浊，加入的保护胶体，蒸馏水中的微生物，存在散射以及共振发射等，均可吸光质点的吸光特性变化大。,所以，只有在一定的浓度范围内吸收光度才能与被测组分的浓度成正比关系,四、吸收定律的应用,1、目视比色法 用眼睛观察来比较溶液颜色深浅以确定物质含量的方法称为目视比色法。,2、光电比色法和光电比色计,光电比色法用光电比色计测量一系列物质的吸光度，从而绘制标准曲线，再根据被测溶液的吸光度，从标准曲线上求得其浓度和含量。,3、分光光度法和分光光度计,其作用原理和测量方法与光电比色法基本相同，不同的仅仅是获得单色光的方法不同。光电比色法是通过滤光片获得某一段波长范围的光，而分光光度法是借助棱镜或光棚等分光器，并用狭缝分出波长范围很窄的一束近似的单色光。,一、主要部件的性能与作用 基本结构: 光源单色器吸收池检测器信号显示系统, 样品,紫外-可见分光光度计,在紫外可见分光光度计中，常用的光源有两类：热辐射光源和气体放电光源,1 光源,热辐射光源用于可见光区，如钨灯和卤钨灯；气体放电光源用于紫外光区，如氢灯和氘灯。,单色器的主要组成：入射狭缝、出射狭缝、色散元件和准直镜等部分。,2 单色器,单色器质量的优劣，主要决定于色散元件的质量。色散元件常用棱镜和光栅。,吸收池又称比色皿或比色杯，按材料可分为玻璃吸收池和石英吸收池，前者不能用于紫外区。,3 吸收池,吸收池的种类很多，其光径可在0.110cm之间，其中以1cm光径吸收池最为常用。,4 检测器 检测器的作用是检测光信号，并将光信号转变为电信号。现今使用的分光光度计大多采用光电管或光电倍增管作为检测器。,5 信号显示系统 常用的信号显示装置有直读检流计，电位调节指零装置，以及自动记录和数字显示装置等。,紫外-可见吸收光谱除主要可用于物质的定量分析外，还可以用于物质的定性分析、纯度鉴定、结构分析。 1.定性分析 每一种化合物都有自己的特征光谱。测出未知物的吸收光谱，原则上可以对该未知物作出定性鉴定，但对复杂化合物的定性分析有一定的困难。,紫外-可见吸收光谱的应用,2.纯度的鉴定 用紫外吸收光谱确定试样的纯度是比较方便的。 如蛋白质与核酸的纯度分析中，可用A280/A260的比值，鉴定其纯度。,3.结构分析 紫外-可见吸收光谱一般不用于化合物的结构分析，但利用紫外吸收光谱鉴定化合物中的共轭结构和芳环结构还是有一定价值。 例如，某化合物在近紫外区内无吸收，说明该物质无共轭结构和芳香结构。,1朗伯-比耳定律的物理意义是什么？写出其数学表达式。,思考题,答：当一束平行的单色光通过液层厚度为b的有色溶液时，溶液的吸光度A与液层的厚度b和溶液的浓度c成正比。即A= lg(I0 / I) = bc,摩尔吸光系数的物理意义是什么？其大小与哪些因素有关？在分析化学中有何意义？,答：摩尔吸光系数在数值上等于1molL-1吸光物质在1cm光程中的吸光度。它是吸光物质在特定波长下的一个特征常数。其单位为L mol-1 cm-1。由于值与入射光波长有关，故表示时，应注明所用入射光波长。在分析化学中，值的大小反应了：（1）吸光物质对某一特定波长光吸光能力大小的量度。值越大，该吸光物质的吸光能力越强。（2）衡量光度分析方法灵敏度的重要指标，值越大，方法的灵敏度越高。,什么是吸收曲线？什么是标准曲线？它们有何实际意义？,答：以入射光波长作横坐标，用分光光度计测量每一波长下物质对光的吸光度作纵坐标所绘制的曲线，称为吸收曲线。其作用是：选择入射光波长，在此波长下测量吸光度，则分析的灵敏度最高。因此，吸收曲线是吸光光度法中选择