工业微生物接种技术ppt课件

项目二 微生物无菌操作及接种技术,无菌操作技术：指在微生物实验工作中，控制或防止各类微生物污染及其干扰的一系列操作方法和有关措施。,物品：高压湿热灭菌 操作者：无菌工作服、鞋、帽、口罩 环境 操作,一、防污染措施,污染途径,（一）操作者,人的体表、皮肤和粘膜上长期寄居一些微生物，这种正常的微生物有一定的种类和数量，和宿主、体外环境三者之间保持动态平衡，有益于宿主健康，所以这类微生物我们称为正常菌群，他们保持了人体的微生态平衡。,对于我们制药工业来说，在口服药和局部药制备过程中，要求操作人员清洗和消毒双手，穿上专用工作衣帽进行操作，既可减少微生物污染。但在制备无菌要求高的注射剂和眼用、耳用溶液时要求操作人员操作前穿上全套的工作衣帽包括操作衣、裤、靴子、帽、面罩和手套。此外不允许带菌者操作。,空气中的微生物（细菌芽孢和霉菌孢子）主要来自灰尘，或者人的皮肤、衣服，或者由我们谈话、咳嗽、打喷嚏时飞沫中带的微生物，人越多的地方，相对微生物数量就多一些，灰尘多的房间比干净的房间微生物多。,（二）环境,无菌环境,无菌室 超净工作台,无菌环境的要求与保持,（1）无菌室的结构： 密封、避光，设百叶通气窗，侧面底部设进气孔 应有缓冲间(外间)、操作间 安装拉门,1、无菌室,无菌环境的要求与保持,（2）无菌室内的设备 缓冲间、操作间安装日光灯和紫外灯，紫外灯距地高度2.0-2.2m; 缓冲间内放置工作服、鞋、帽、口罩，消毒用药物； 超净工作台，内备接种用常用器具;酒精灯、接种环、打火机或火柴、记号笔、镊子、酒精棉球瓶,（3）无菌室的消毒和防污染 无菌室内空气测试应基本达到无菌。 使用前后紫外线照射均照射30min 每周用甲醛、乳酸、过氧乙酸熏蒸（2小时） 每月用新洁尔灭擦拭地面和墙壁一次的方式进行消毒。,（4）无菌室空气污染情况的检验 使用前或操作后检查，应无杂菌； 若杂菌多为霉菌时，应通风干燥；杂菌多为细菌时，乳酸熏蒸效果较好。,（5）无菌室操作规则 操作前打开缓冲间和操作间的紫外灯30min; 器材和用品一次性全部放入无菌室，避免在操作过程中进出无菌室或传递物品. 进入缓冲间，换好工作服、鞋、帽、口罩，手消毒 无菌操作 操作后收拾台面，紫外灯照射。,2、超净工作台,超净工作台是为实验室工作提供无菌操作环境的设施，以保护实验免受外部环境的影响，同时为外部环境提供某些程度的保护以防污染并保护操作者。,原理：超净工作台的洁净环境是在特定的空间内，洁净空气(进滤空气)按设定的方向流动而形成的。以气流方向来分，现有的超净工作台可分为垂直式，由内向外式以及侧向式。,垂直流超净工作台,水平流超净工作台,垂直流超净工作台,超净台的使用与维护,风速保持在0.32-0.48米/秒 使用前打开紫外灯照射30-60min 开启超净工作台工作电源，关闭紫外灯，并用75%的酒精或0.5%过氧乙酸喷洒擦拭消毒工作台面。 使用中，有机玻璃罩受到污染，严禁用酒精棉球擦拭，请用含水棉布檫拭； 请保持超净台整洁、干燥，不要堆积杂物； 使用完毕，关闭酒精灯； 使用完毕后，用消毒液擦拭工作台面，关闭工作电源，重新开启紫外灯照射15min. 定期做无菌试验，以测定净化台是否符合无菌要求。,（1）在操作中不应有大幅度或快速的动作； （2）使用玻璃器皿应轻取轻放。 （3）在火焰上方操作； （4）接种用具在使用前、后都必须灼烧灭菌； （5）在接种培养物时，协作应轻、准。 （6）不能用嘴直接吸吹吸管。 （7）带有菌液的吸管、玻片等器材应及时置于盛有5%来苏尔溶液的消毒桶内消毒。,（三）无菌操作要求,接种：将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物体内的过程。,二、微生物接种技术,接种的基本程序 常用接种方法 斜面接种 划线接种 液体接种 穿刺接种,（一）接种的基本程序,斜面接种 液体接种 穿刺接种 平板接种,（二）接种的操作方法,1. 斜面接种 从已生长好的菌种斜面上挑取少量菌种移植至另一新鲜斜面培养基上的接种方法。 用于好气性微生物的接种，可进行好氧微生物的形态观察或菌种保藏,1.消毒： 手和台面用75%酒精棉消毒 2.标记： 接种前在距离试管口2-3cm位置注明菌名、接种日期、 接种人姓名 3.整理台面： 左手用的物品放左手边，右手用的物品放右手边，酒 精灯位于中央；无菌物品左手边，用过的放右手边。 4.点燃酒精灯。,5.接种： （1）手持试管 将菌种管和待接斜面管用大姆指和其他四指握在左手中，中指位于两管之间。斜面向上，尽量放平。 （2）旋松管塞 （3）接种环灼烧灭菌：见图4-13，三步。,（4）拔管塞：用右手的无名指、小指和手掌边先后取下菌种管和待接试管的管塞，让试管口缓缓过火灭菌(切勿烧得过烫),（5）取菌: 接种环冷却，轻沾取少量菌体或胞子，然后将接种环移出菌种管，注意不要使接种环碰到管壁，取出后带菌接种环不可通过火焰。,（6）接种: 在火焰旁迅速将沾有菌种的接种环伸入待接斜面管。从斜面培养基底部向上作“Z”形来回密集划线，勿划破培养基。 有时也可用接种针仅在斜面培养基的中央拉一条直线作斜面接种，直线接种可观察不同菌种的生长特点。,(7) 塞管塞：取出接种环，灼烧试管口，并在火焰旁将管塞旋上。不要用试管去迎棉塞，以免试管在移动时纳入不洁空气。 (8) 将接种环灼烧灭菌。放下接种环，再将棉花塞旋紧。,斜面接种示意图,由斜面菌接种到液体培养基（如试管或三角瓶等）中的方法。 操作方法： 与斜面法基本一致，只是在将接种环送入液体培养基时使环在液体与管壁接触的地方轻轻磨擦，使菌体分散，塞上棉塞再轻轻摇匀。 如果菌种是培养在液体培养基中时，一般用移液管或滴管接种,2.液体接种,用接种针从菌种斜面上挑取少量菌体并把它穿刺到固体或半固体的深层培养基中的接种方法。 用于厌气性细菌培养、检查细菌的运动能力、保藏菌种 只适宜于细菌和酵母的接种培养,3.穿刺接种,穿刺接种方法： （1）消毒 （2）标记 （3）整理台面 （4）点燃酒精灯 （5）接种 1）手持试管 2）旋松棉塞 3）接种针灼烧灭菌，把在穿刺中可能伸入试管的其他部位也灼烧灭菌,4）拔出棉塞 5）取菌：用冷却接种针的针尖沾取少量菌种 6）穿刺：水平法和垂直法。 将接种针自培养基中心平稳、快速垂直刺入培养基， 至接近试管底部，然后沿接种线拔出 7）塞上棉塞 8）接种针灼烧灭菌,（1）划线接种,目的：使混合的细菌呈单个分散生长，形成单个菌落，以便获得纯菌。,4.平板接种,分区划线法,第一区划线,灭菌接种环,第二区划线,灭菌接种环,第三区划线,灭菌接种环,适用于含菌量较多的标本,连续划线法,适用于含菌量较少的标本,稀释法：微生物分离、纯化 稀释倒平板法:菌悬液稀释不同梯度的稀释液少许与培养基混合摇匀倒培养皿中 稀释混合平板法（倾注法）：稀释培养皿中加入不同梯度的菌悬液1mL加45左右的培养基摇匀 稀释涂布平板法：倒平板-稀释-接种0.1mL涂布,各种接种方法的用途,1.斜面接种法 用于鉴定和保存菌种。 2.液体培养基接种法 可观察细菌在培养基中的生长现象或用作生化反应实验 3.半固体培养基接种法 穿刺接种法，用于保存菌种或观察细菌动力,4.平板划线接种法 目的：使混合的细菌呈单个分散生长，形成单个菌落，以便获得纯菌。 方法： 分区划线法：适用于含菌量较多的标本。 连续划线法：适用于含菌量较少的标本。,5.涂布接种法：用于分离、测定标本中活菌数和药敏实验细菌接种 6.倾注培养法：用于活细菌计数。,是将需要的某种微生物从混杂的微生 物群体中分离出来，得到只含有一种 微生物的培养物。,是由一个单细胞或一种细胞群繁殖 得到的后代称纯培养。,菌种的分离,微生物的纯培养,三、菌种的分离方法,获得纯培养的方法：,三、菌种的分离方法,稀释平板分离法,3、单细胞挑取法,用显微挑取器，从待分离材 料中挑取一个细胞来培养，从 而获得纯培养的方法。,毛细管法：用毛细管提取微生物个体，适于较大微生物 显微操作仪：用显微针、钩、环等挑取单个细胞或孢子 小液滴法：将经过适当稀释后的样品制成小液滴，在显微镜下选取只含一个细胞的液滴来进行纯培养物的分离。,4、组织分离法,分离步骤 制作培养基并对培养基灭菌。 对组织块进行消毒处理：在无菌条件 下，用无菌刀片切取小块受病组织，放 入0.1%的升汞水中浸泡2-3min，再用无 菌水冲洗数次。,是用感病的生物体组织来分离微生 物得到纯培养物的方法。,接种：把组织块分割成小块，放到平板培 养基表面。每个平皿中放入3-5个小组织块 培养:适温培养到组织块周围长出单菌落 转管纯化：将需要的单菌落转接到斜面试 管培养基上，经培养后得到纯培养物。,此种方法适合于病原微生物的分离。,5.选择培养分离法,使待分离微生物生长特征“突出”； 抑制大多数其它微生物的生长； 使待分离微生物生长更快。,微生物群落中数量占少数的微生物得到分离纯化：,颜色反应：分离特定的菌株,牛奶平板：分离蛋白酶产生菌,使待分离微生物生长特征“突出”,高温下培养：分离嗜热细菌,培养基中不含N：分离固氮菌,培养基加抗生素：分离抗性菌,抑制大多数其它微生物的生长,富集培养: 利用不同微生物间生命活动特点的不同，制定特定的环境条件，仅使待分离微生物旺盛生长，在群落中的数量大大增加，从而更容易地从自然界中分离到所需的特定微生物。,使待分离微生物生长更快。,几种分离方法的应用范围 划线：不需稀释，简便，用于分离 稀释混合平板法：分离、活菌计数 涂布平板法：分离，可得到比较多的单菌落，方便筛选。 单细胞挑取法：高度专业 选择培养：分离生理类型特殊的微生物,工业生产中培养的菌种接入种子罐时，一般先制成 菌悬液。 常用的接种方法有压差法、火焰封口法等。 1.火焰封口法 种子罐的接种口周围设有沟槽，接种时先在沟槽里 注入少量酒精，然后用火焰点燃酒精，使接种口被 包围在一堆火焰之中，接着将菌悬液倒入种子罐中 即可。,五、工业生产中的微生物接种,2 、压差法 先用棉花球蘸消毒剂覆盖在种子罐接种口的橡皮塞上，消毒5 10min ，将连接在盛有菌悬液的容器上的接种针头迅速插入接种口的橡皮小孔中，然后平衡种子罐与盛菌悬液的容器之间的压力，接着降低种子罐的压力，菌悬液就会注入到种子罐里。接种完后，再用消毒剂拭净接种口的小孔。,工业生产中的微生物接种,工业微生物的培养方法, 从少量培养大规模培养 从浅层培养厚层（固体制曲）或深层（液体搅拌）培养 从固体培养液体培养 从静止式液体培养通气搅拌式的液体培养 从单批培养连续培养多级连续培养 从分散的微生物细胞固定化的细胞集团 从微生物细胞动、植物细胞大规模培养； 从野生型菌种突变株、遗传工程菌株； 从单菌发酵多菌发酵； 从低密度培养高密度培养； 从人工控制的发酵罐到多传感器、计算机在线控制的自动化发酵罐等。,微生物培养技术的发展特点：,一、实验室培养法,（一）实验室固体培养法,1. 好氧菌的固体培养,试管斜面:形态观察、菌种保藏,平板:分离、活菌计数,克氏瓶,2. 厌氧菌的固体培养,实验室中 培养厌氧菌,特殊的培养装置或器皿,配制特殊的培养基,六种营养要素,加入还原剂和氧化还原势的指示剂,高层琼脂柱：培养基中加入还原剂，装入试管中灭菌后，只有表层有一些溶解氧，越是深层，其氧化还原电位势越低，有利于厌氧菌的生长。如韦荣氏管（Veillon tube）：长25cm，内径1cm，两端可用橡皮塞封闭的玻璃管。,厌氧培养皿： Brewer皿：利用凹形皿盖制造狭窄空间，加上还原性培养基达到厌氧环境。 Spray或Bray皿：利用焦性没食子酸+NaOH反应造成无氧环境。,厌氧罐： 常规的不很严格的厌氧技术； 对厌氧罐反复抽真空、灌氮气，剩余氧在钯催化剂的催化下，与灌入混合气体中的氢气还原成水而除去，从而形成良好的无氧环境。, Hungate滚管技术： 严格厌氧技术 利用除氧铜柱在350下与氧反应来制备高纯度氮，再用此高纯度氮去驱除培养基配制、分装过程中各种容器和小环境中的空气，使培养基的配制、分装、灭菌和贮存，以及接种、稀释、培养、观察、分离、移种和保藏等操作的全过程始终处于高度无氧的环境。从而保证了严格厌氧菌的存活。,厌氧手套箱：严格厌氧条件 箱内始终充满成分为N2：CO2：H285：5：10（V/V）的气体，并有钯催化剂保证箱内处于高度无氧状态。通过塑料手套进行操作，外界物体进出通过交换室。,（二）实验室液体培养,液体培养法： 好氧菌：确保培养液中含有较高的溶解氧浓度是关键。 试管液体培养； 三角瓶浅层液体培养：仅适用于兼性厌氧菌 摇瓶培养：又称振荡培养； 台式发酵罐：几升至几十升，使用方便 厌氧菌： 放入厌氧罐或厌氧手套箱中； 培养基中加入巯基乙酸、半胱氨酸等有机还原剂。,一般情况下（1.013105 Pa，20），氧在水中的溶解度仅为6.2 mLL（0.28 mmolL），这些氧只能保证氧化8.3 mg（即0.046 mmolL）葡萄糖，仅相当培养基中常用葡萄糖浓度的1。 氧的供应是好氧菌生长、繁殖中的限制因子。,提高溶氧速率的具体措施： 浅层液体静止培养； 利用往复式或旋转式摇床作摇瓶培养； 在发酵罐的底部通入加压空气，并用气体分布器使其产生均匀、密集的微小气泡； 对培养液进行机械搅拌，并在发酵罐的壁上设置阻挡装置等。,用深层培养或同时在液面上封一层石蜡油或凡士林-石蜡油,台式发酵罐,实验室培养法,二、微生物工业培养法,（一）工业固态培养法： 好氧菌：曲法培养。依制曲容器的形状和规模分为：瓶曲、袋曲、盘曲、帘子曲、转鼓曲、