微生物的生长繁殖及其控制.ppt

第五章 微生物的生长繁殖 及其控制,5.1 微生物的生长繁殖,5.1.1 微生物生长繁殖的概念 生长 微生物细胞吸收营养物质，进行新陈代谢，当同化作用异化作用时，生命个体的重量和体积不断增大的过程。 繁殖生命个体生长到一定阶段，通过特定方式产生新的生命个体，即引起生命个体数量增加的生物学过程。 发育从生长到繁殖，是生物的构造和机能从简单到复杂、从量变到质变的发展变化过程，这一过程称为发育。 个体生长微生物细胞个体吸收营养物质，进行新陈代谢，原生质与细胞组分的增加为个体生长。 群体生长群体中个体数目的增加。可以用重量、体积、密度或浓度来衡量。,1. 单细胞微生物的生长繁殖 生长：同化作用大于异化作用，细胞不断增长。 繁殖：单细胞个体生长到一定程度时，一个亲代细胞分裂为两个大小、性状与亲代细胞相似的子代细胞，使得个体数目增加。 世代时间：细菌的两次细胞分裂之间的时间。 2. 多细胞微生物的生长繁殖 生长：细胞数目增加，个体数目不增加。 繁殖：细胞数目增加，个体数目也增加。,5.1.2 研究微生物生长的方法 (一) 分批培养(batch culture) 1. 概念：分批培养是将一定量的微生物接种在一个封闭的、盛有一定量液体培养基的容器内，保持一定的温度、pH和DO，微生物在其中生长繁殖。培养基一次性加入，不更换。 2. 细菌生长曲线 以培养时间为横坐标，以计数获得的细菌数目的对数为纵坐标，可得到一条定量描述液体培养基中微生物生长规律的实验曲线，该曲线则称为生长曲线。（ growth curve )。,生长曲线的制作,将少量单细胞的纯培养，接种到一恒定容积的新鲜液体 培养基中，在适宜条件下培养，每隔一定时间取样， 测细菌细胞数目。以培养时间为横坐标，以细菌增长数目 的对数为纵坐标，绘制所得的曲线。,其它名称：迟滞期、调整期、适应期 1.现象：活菌数几乎没增加，曲线平行于横轴。 2.特点： 初始阶段：细菌要适应新的环境，细菌总数有所减少 末期：生长繁殖速度加快，细菌总数有所增加 细胞内RNA特别是rRNA含量增高，原生质嗜碱性增强 合成代谢活跃(核糖体、酶类、ATP合成加快),开始细胞分裂 对外界不良条件敏感,(如氯化钠浓度、温度、抗生素等化学药物) 3.原因：适应新的环境条件，合成新的酶，积累必要的中间产物,.停滞期（lag phase）,接种群体菌龄： 用对数生长期的菌种接种时，其停滞期较短，甚至检查不到停滞期 接种量：一般来说， 接种量增大可缩短甚至消除停滞期 培养基成分： 在营养成分丰富的天然培养基上生长的延滞期比在合成培养基上生长时短；接种后培养基成分有较大变化时，会使延滞期加长，所以发酵工业上尽量使发酵培养基的成分与种子培养基接近。 世代时间：世代时间短，即繁殖速度较快的菌种的停滞期一般较短,影响停滞期长短的因素,应用,在发酵工业上需设法尽量缩短延迟期； 采取的缩短lag phase 的措施有： 增加接种量； （群体优势-适应性增强） 采用对数生长期的健壮菌种； 调整培养基的成分，在种子培养基中加入发酵培养基的某些成分。 选用繁殖快的菌种 在食品工业上，尽量在此期进行消毒或灭菌,.对数期（log phase）,其他名称：指数期 现象：细胞数目以几何级数增加，其对数与时间呈直线关系。 特点： 生长速率常数最大,世代时间最短,细胞数目以几何级数增加 菌体大小形态、生理特征等比较一致 代谢最旺盛 对不良环境因素的抵抗力强 影响因素： 菌种、营养成分、营养物浓度 培养温度、DO、抑制剂 世代时间G=( t2- t1)/3.3(lg X2-lg X1),应用意义： 由于此时期的菌种比较健壮，生产上用作接种的最佳菌龄； 发酵工业上尽量延长该期，以达到较高的菌体密度 食品工业上尽量使有害微生物不能进入此期 是生理代谢及遗传研究或进行染色、形态观察等的良好材料。,. 静止期（stationary phase）,又称：稳定期、恒定期或最高生长期 特点：新增殖的细胞数与老细胞的死亡数几乎相等，微生物的生长速率处于动态平衡，培养基中的细胞数目达到最高值。 细胞分裂速度下降，开始积累内含物，芽孢杆菌开始产芽孢。 对于发酵生产来说，一般在稳定期的后期产物积累达到高峰，是最佳的收获时期。 原因： 对数期消耗了营养物质，使其浓度降低； 有害代谢废物的大量积累(酸、醇、毒素等)； 营养物的比例失调，如碳氮比不合适； 理化条件(pH、DO、氧化还原势等)有所改变。,. 衰亡期（decline phase）,特点：细菌利用贮存物进行内源呼吸(自身溶解) 。 细胞死亡数增加，死亡数大大超过新增殖的细胞数，群体中的活菌数目急剧下降，出现“负生长” 。 细胞内颗粒更明显，细胞出现多形态、畸形或衰退形。 衰亡期比其他各时期时间长，它的长短也与菌种和环境条件有关。 产生原因：生长条件的进一步恶化，使细胞内的分解代谢大大超过合成代谢，继而导致菌体的死亡,分批培养的应用： 序批式间歇曝气器（SBR）,(二) 连续培养(continous culture) 1. 概念：在细菌进入对数生长期时，以一定的速率不断地补充新鲜营养物质，同时以同样的速率排除培养物(含菌体及代谢产物)，让培养的微生物长时间地处于对数生长期，以利于微生物的增殖速率和代谢活性处于某种稳定状态。,2. 连续培养方法的分类 (1) 恒浊连续培养 是通过连续培养装置中的光电系统控制培养液中菌体浓度恒定，使细菌生长连续进行的一种培养方式。 应用：发酵工艺采用该法以获得大量菌体和有经济价值的代谢产物。,(2) 恒化连续培养 以恒定流速进水，以相同流速流出代谢产物，以维持进水中的营养成分恒定，使细菌处于最高生长速率状态的培养方法。 应用：污水生物处理(除SBR法)。,3. 连续培养运行参数 稀释率D D流动速率/容积 过低：新鲜营养补充不及时，导致大量细菌饥饿而死亡； 过高：生长速率低于排出速率,5.1.3 生长曲线在污水生物处理中的应用,1. 活性污泥的生长曲线, 迟缓期 对数生长期 减速生长期 内源呼吸期,2. 活性污泥生长曲线对废水生物处理的指导意义,常规活性污泥不利用对数生长期的微生物而利用静止期的微生物的原因： 处于对数期的微生物代谢活力强，能去除大量有机物，但对进水有机物浓度需求高，使出水不易达到排放标准； 处于对数期的微生物生长繁殖旺盛，沉淀性能差，致使出水水质差； 处于静止期的微生物活力相对较差，但仍有相当的活力，去除有机物的效果仍较好； 处于静止期的微生物体内积累了大量贮存物，强化了微生物的生物吸附能力，自我絮凝、凝合能力强，在二沉池中泥水分离效果好，出水水质好。,5.1.4 微生物生长量的测定方法,一、 细胞数目的测定 二、 微生物生物量的测定,一、 细胞数目的测定 1. 测定微生物的总数(直接计数法) 计数器直接计数 染色涂片计数 比例计数法 比浊法 2. 测定活菌数(间接计数法),1. 测定微生物的总数(直接计数法) 计数器(血球计数板）测定法,适用范围：测定个体较大的细菌或原生动物 测定细胞个体形态较小的则采用细菌计数板。,1. 测定微生物的总数(直接计数法) 涂片染色法,1视野菌液(ml)(0.01ml 1cm2)视野面积(cm2),1. 测定微生物的总数(直接计数法) 比例计数法,比例样品菌液与等体积的血液混合，观测二者比例,提问：如果平均每个视野中细菌数量/红血球的数量比例为5.5：1，则细菌数量=？ 5.5400万个/m l =2.2107个/mL样品,红血球数已知(男性400500万个ml，女性350450万个ml)，平均400万个/ml,1. 测定微生物的总数(直接计数法) 比浊计数法,浊细菌悬浮液的浊度,细菌不完全透光，一定范围内细菌溶液的混浊度与细菌数量成正比,常用仪器：浊度计、分光光度计,一、 细胞数目的测定 2. 测定活菌数(间接计数法) 载玻片薄琼脂层培养计数 平板菌落计数 液体稀释培养计数 薄膜过滤计数,无菌水,2. 活菌计数法(间接计数法) 平板菌落计数法,第一步：菌样巧妙稀释,得到不同稀释度 （10-x）菌液,菌样被无菌水不同稀释倍率后平板培养图,各取1ml，均匀涂布于冷固体培养基平板上或与温热液态固体培养基混合冷却。,第三步：培养,稀释度过低，菌落密集无法计数,可以计数，但数量过多，费时费力,数量合适，统计计算，作为结果,数量太少，误差因素太大，不做计数,第二步：接种平板,每一个细菌会生成一个菌落,一般计数平板的细菌生长菌落数以30300个为宜。,第四步： 计数,细菌数量=？ 细菌数量=数出的菌落数/稀释度 例如：10-5稀释度时菌落数为125个 细菌数量=125/10-5=1.25107个/mL 平板计数法是采用最广的一种活菌计数法,平均,二、 微生物生物量的测定 测细胞干重法 含N量测定法 DNA测定法 生理指标法,5.2 微生物的生长因子,5.2.1 温度 1. 温度对微生物的影响具体表现在： 影响酶活性。温度变化影响酶促反应速率，最终影响细胞合成。 影响细胞膜的流动性。温度高，流动性大，有利于物质的运输；温度低，流动性降低，不利于物质运输，因此，温度变化影响营养物质的吸收与代谢产物的分泌。 影响物质的溶解度。对生长有影响。,2.微生物按温度需求分类 3.各类微生物生长的适宜温度,4.嗜冷微生物在低温下生长的机理 它们体内的酶能在低温下有效地催化，在高温下酶活性丧失 主动运输物质的功能良好，能有效地集中必需营养物 细胞膜中的不饱和脂肪酸含量高，低温下也能保持半流动状态，可以进行物质的传递,5.低温对微生物的影响 当环境温度低于微生物的最适生长温度时，微生物的代谢极其微弱，基本处于休眠状态，当微生物的原生质结构并未破坏时，不会很快造成死亡并能在较长时间内保持活力，当温度提高时，可以恢复正常的生命活动。 应用：低温保藏菌种 当温度过低，造成微生物细胞冻结时，有的微生物会死亡，有些则并不死亡。 6. 高温对微生物的影响 高温下蛋白质发生不可逆变性，膜受热出现小孔，破坏细胞结构,小结： 微生物的培养应该在最佳温度范围进行； 超过最高温度会对细菌造成伤害甚至导致死亡； 低温有抑制细菌作用，可以让微生物休眠，但不会导致死亡。温度升高时，活性即可恢复。,5.2.2 pH,1.环境pH对微生物的影响 影响膜表面电荷的性质及膜的通透性，进而影响对物质的吸收能力。 改变酶活性、酶促反应的速率及代谢途径：如：酵母菌在pH4.55产乙醇，在pH6.5以上产甘油、酸。 环境pH值还影响培养基中营养物质的离子化程度，从而影响营养物质吸收，或有毒物质的毒性。,2.微生物适宜的pH范围 大多数细菌、藻类和原生动物的最适生长pH6.57.5，它们能适应pH410之间的环境。,3.污水生物处理时pH宜维持在6.58.5 大多数细菌、藻类、放线菌和原生动物在此范围内均能生长繁殖，有利于细菌形成菌胶团互相凝聚形成良好的絮凝体，可取得良好的净化效果； pH6.5的酸性环境有利于霉菌和酵母菌的生长，若霉菌在活性污泥中大量繁殖，因其不能分泌粘性物质于细胞表面，而降低了活性污泥的吸附能力，其絮凝性较差，结构松散不易沉降，处理效果下降，甚至导致活性污泥丝状膨胀。,4.培养基pH的变化 原因 a 分解葡萄糖、乳糖有机酸，pH b 分解蛋白质、蛋白胨及氨基酸NH3和胺类，pH c 细胞选择性地吸收阴阳离子，pH 解决方法 在配制培养基时应加入缓冲物质，如KH2PO4和K2HPO4 。, 在废水和污泥厌氧消化过程中，要控制好产酸阶段和产甲烷阶段的产量，pH很关键，通常应控制pH6.67.6之间， pH6.87.2为最佳。 城市生活污水、污泥若不含蛋白质、氨等物质，处理之前就要投加缓冲物质；若连续运行则在运行期间也应投加，以碳酸氢钠为佳。 pH低的工业废水可采用霉菌和酵母菌处理，无需调节pH，其所引起的丝状膨胀可通过改革工艺来解决，如采用生物膜法、接触氧化法等。,小结： 污水生物处理的构筑物内pH控制在6.58.5之间； 微生物培养基中应该加入缓冲物质。,5.2.3 氧化还原电位(Eh),1. 微生物与Eh Eh0，氧化环境，上限为820mV Eh0，还原环境，下限为400mV 各类微生物适宜的Eh 对于好氧生物处理系统，Eh处于+200+600mV视为正常,2. 影响Eh的因素 氧分压:氧分压高，Eh高；氧分压低， Eh低。 pH:pH高，Eh高；pH低， Eh 低。 3. 控制Eh的还原剂 抗坏血酸、硫二乙醇钠、硫化氢和铁等,5.2.4 溶解氧DO,根据微生物与分子氧的关系可将微生物分为,5.2.4.1 好氧微生物与氧的关系 1.氧对好氧微生物的作用 作为微生物好氧呼吸的最终电子受体 参与甾醇类和不饱和脂肪酸的生物合成 2. 溶解氧的供给 好氧微生物需要的氧是溶于水的氧，即溶解氧。 夏季水温高，常造成供氧不足，促使丝状细菌的优势生长，从而造成活性污泥的丝状膨胀。因此，在活性污泥生物处理中需设置充氧设备充氧，如通过叶轮机械搅拌、鼓风曝气等方式充氧。溶解氧的质量浓度维持在34mg/L为宜。,5.2.4.2 兼性厌氧微生物与氧的关系 1.不同氧条件的生理状态 好氧条件：氧化酶活性强，细胞色素及电子传递体系的其它组分正常存在； 无氧条件：氧化酶无活性，细胞色素和电子传递体系的其它组分减少或全部丧失。 巴斯德效应：指将氧通入正在发酵的酵母菌悬液中，使得发酵速度下降，葡萄糖的消耗速度也显著下降的现象。,2.不同氧条件下废水生物处理中的微生物 供氧正常：好氧微生物和兼性厌氧微生物共同起积极作用； 供氧不足：好氧微生物不起作用，兼性厌氧微生物起积极作用，但有机物分解不彻底； 污水、污泥厌氧消化：兼性厌氧微生物起水解、发酵作用，将大分子的蛋白质、脂肪等水解为小分子的有机酸和醇等。,3.反硝化细菌 有O2时：进行好氧呼吸 缺O2时：进行反硝化作用,NO3,NO2,N2,5.2.4.3 厌氧微生物与氧的关系 1. 厌氧微生物的氧毒害机制 专性厌氧微生物不具有过氧化氢酶，会被代谢过程中产生的H2O2杀死； 专性厌氧微生物不具有超氧化物歧化酶(SOD)，而被超氧阴离子杀死； 2. 厌氧微生物的培养方法 可与兼性厌氧微生物混合培养，以去除O2，保证厌氧环境。,He、H2、N2,加入甲基蓝或 刃天青指示Eh (显色表明有O2),封瓶口,无氧培养 罐内培养,5.2.5 太阳辐射,1000nm的红外辐射，可被不产氧的光合细菌用作光源； 380760nm的可见光是蓝细菌、藻类进行光合作用的能源。 其余的辐射对微生物均有害。,5.2.6 水的活度与渗透压,5.2.6.1 水的活度w 水的活度w 表示在一定温度下，某溶液或物质在与一定空间空气相平衡时的含水量与空气饱和水量的比值，用小数表示。 多数微生物在w 0.950.99时生长最好。大多数微生物在w 0.600.65时停止活动。,5.2.6.2 渗透压 渗透压 当两液面高差产生的压力足够阻止水再流动时，此时两液面高差间的压力即为渗透压。,半透膜,清水,蔗 糖 溶 液,h,溶液的浓度决定渗透压 溶质的分子或离子数越多，渗透压越大 同质量浓度溶液，溶质分子越小，其渗透压越大 离子溶液的渗透压比分子溶液的渗透压大 细菌的渗透压 G (2.02.5)MPa G (0.50.6)MPa,微生物在不同渗透压溶液的反应 等渗溶液：形态大小不变，生长良好。 应用：在实验室用(NaCl)8.5g/L的生理盐水稀释菌液。 低渗溶液：水分子大量渗入细胞内，使细胞膨胀，严重者破裂。 高渗溶液：细胞内大量失水，使细胞发生质壁分离。 应用：用高渗溶液保存食物可防止腐败。,5.2.7 表面张力, 是作用在物体表面单位长度上的收缩力 (H2O)7.3104 N/m (培养基)4.51046.5104N/m 胆汁可降低，可用于实验鉴别肺炎球菌和链球菌 可用胆酸盐分离大肠菌群,5.3 其它不利环境因子对微生物的影响,5.3.1 紫外辐射和电离辐射对微生物的影响 一、 紫外辐射的影响 1. 紫外辐射对微生物有致死作用 260nm左右的紫外辐射杀菌力最强 致死原因： 微生物细胞中的核酸、蛋白质等对紫外辐射有特别强的吸收能力，可引起DNA链上的两个邻近的胸腺嘧啶分子形成胸腺嘧啶二聚体(T=T)，使DNA不能复制，导致死亡。,2. 复活现象 光复活 经UV照射的微生物，随即暴露于蓝色可见光下，使T=T恢复正常状态，使一部分受损的细胞恢复活力。 暗复活 DNA链在黑暗条件下进行修复。 3. 微生物对紫外辐射的抵抗力 GG 芽孢营养细胞 4. 应用 杀菌消毒 诱变育种,二、 电离辐射的影响 X射线(0.10.01nm) 、射线(0.010.001nm) 对微生物生命活动的影响表现 低剂量照射，促进微生物生长或引起微生物发生变异； 高剂量照射，对微生物有致死作用。,5.3.2 超声波 超声波 频率大于20000Hz的声波，能破坏几乎所有的细菌体。 超声波的杀菌效果与其频率、处理时间、细菌大小、形状和细菌数有关。 杀菌机制: 细胞内含物受到强烈振荡，胶体发生絮状沉淀，凝胶液化或乳化，从而失去生物活性； 溶液受到超声波作用产生空腔，引起巨大的压力变化，使细菌死亡； 溶于溶液中的气体变成无数极微小的气泡迅速猛烈地冲击细菌，使之破裂。,应用 利用超声波破坏菌体，制成细菌裂解液，用于研究细菌的结构、化学组成、酶活性等； 可利用超声波从组织中提取病毒； 利用频率为8001000kHz的超声波治疗疾病,5.3.3 重金属对微生物的影响 Hg、Ag、Cu、Pb及其化合物可有效地杀菌和防腐，是蛋白质的沉淀剂。 杀菌机理： 其与酶的SH结合，使酶失活； 与菌体蛋白结合，使之变性或沉淀。 质量浓度为205mg/L的二氯化汞对大多数细菌有致死作用。 硫酸铜对真菌和藻类的杀伤力较强。 波多尔液(硫酸铜石灰)在农业上可用于防止某些植物病毒。 1L水样中加10mL质量浓度为1g/L的硫酸铜溶液可抑制微生物的呼吸。 质量浓度为15g/L的铅盐溶液对微生物有致死作用。,5.3.4 极端温度对微生物的影响 1. 超高温致死作用 机理：蛋白质和酶蛋白在高温下发生不可逆的凝固作用；细胞质膜中的脂肪受热溶解使膜产生小孔，引起细胞内含物泄漏而致死。 2. 超高温杀菌效果的影响 与微生物的种类、数量、生理状态、芽孢有无及pH都有关。 无芽孢杆菌比芽孢杆菌不耐热； 营养细胞比芽孢不耐热； 湿细菌比干细菌不抗热； 酸性条件下细菌易被杀死； 幼龄菌比老龄菌易被杀死。,3. 灭菌和消毒 (1) 灭菌(sterilization) 通过超高温或其它物理、化学因素将所有微生物的营养细胞和所有的芽孢或孢子全部杀死。 干热灭菌(dry heat sterilization) 优点：可保持物品的干燥 缺点：对于传热性差或体积较大的物品效果较差 应用：玻璃器皿、金属用具等耐热物品的灭菌 湿热灭菌(moist heat sterilization) 特点：温度低、时间短、灭菌效果高 相同温度下，湿热灭菌的效力比干热灭菌高，原因 湿热情况下，菌体蛋白容易受热凝固变性； 湿热的穿透力和热传导都比干热强； 湿热的蒸汽冷凝会放出潜热。,高压蒸汽灭菌,(2) 消毒(disinfection) 用物理、化学因素杀死致病菌(有芽孢和无芽孢的细菌)，或是杀死所有微生物的营养细胞或一部分芽孢。 煮沸消毒 将待消毒的物品置于水中煮沸15min以上，杀死细菌的所以营养细胞和部分芽孢。 巴斯德消毒(Pasteurization) 常用6070的温度将食品处理1530min，以除去食品中的微生物，同时保持食品的营养和风味不变。,5.3.5 极端pH对微生物的影响 1. pH过低，引起机体表面由带负电变为带正电，从而影响对营养物的吸收； 2. pH过高或过低，影响培养基中有机化合物的离子化作用，从而间接影响微生物； 3. 极端pH影响酶的活性，进而影响细胞内的生化过程，甚至直接破坏细胞； 4. 极端pH降低微生物对高温的抵抗能力。,5.3.6 干燥对微生物的影响 干燥能使菌体内蛋白质变性，引起代谢活动的停止。干燥细胞的代谢处于停滞状态，若不提供条件，则一直呈休眠状态长期存活。 可用灭菌的沙土管保存菌种、孢子，也可用真空冷冻干燥保存菌种。