坛紫菜藻胆蛋白粉的研制.pdf

- 1 - 坛紫菜藻胆蛋白粉的研制坛紫菜藻胆蛋白粉的研制1 桑卫国，章宗铭，虞超群 宁波大学生命科学与生物工程学院，浙江宁波（315211） E-mail： 摘摘 要：要：选用坛紫菜为原料，采用净化、破碎、提取、分离、浓缩、干燥等工艺，研制了坛 紫菜色素蛋白粉；通过对溶胀法、超声波破碎、酶解法等细胞破碎的方法的比较，并运同多 级梯度硫酸铵盐析，膜过滤等工艺，探讨了适合大规模制备藻胆蛋白的途径。 关键词：关键词：坛紫菜；藻胆蛋白；分离；纯化 紫菜内含有特殊的色素蛋白藻胆蛋白(phycobiliproteins,PBP)，这是一类存在于红 藻、蓝绿藻和隐藻中的重要光合色素蛋白复合物，它能把捕获的光能高效传递给叶绿素，从 而使海藻的光合作用得以发生。藻胆蛋白在藻类中的含量可达细胞干重的25%-28%,它包括 藻红蛋白(phycoerythrin, PE)、 藻蓝蛋白(phycocyanin, PC)、 别藻蓝蛋白 （allo-phycocyanin, APC) 和藻红蓝蛋白（phycoery-throcyanin）1,2。藻胆蛋白是一种非常重要的光动力药物的原料， 特有的光敏效应可辅助激光治癌，在病灶部位富集，吸收光后高效产生自由基和活泼态氧， 从而实现对肿瘤细胞的杀伤。有光毒性而没有暗毒性，在人体内代谢快,藻胆蛋白还具有抗 氧化清除自由基和提高免疫力的功效。 其制作的免疫荧光标记抗体， 检测灵敏度远远高于传 统的荧光标记物，可用于特殊分子定位和重要分子检测，包括SARS病毒的免疫分子检测， 能准确地诊断肿瘤、 确定病变部位和病情轻重程度等。 藻胆蛋白可作为功能因子用于保健食 品和功能食品及特殊饲料， 同时还是理想的天然色素， 可大量用于食品工业和化妆品工业等， 无毒副作用，是安全的添加剂3。此外，最新研究发现它在光学信息存储与处理、快速光电 探测、人工神经网络等方面也具有潜在的应用前景4。但由于藻胆蛋白分离纯化的困难，现 有的藻胆蛋白商品价格昂贵， 使它的应用受到了一定的限制。 尽管有不少人试图将藻胆蛋白 基因转入微生物中以实现藻胆蛋白的大规模生产， 但用转基因方法生产藻胆蛋白还有很长的 一段路要走，目前从海藻中提取分离藻胆蛋白仍是获得藻胆蛋白的主要途径。 我国对藻类开发利用的力度和深度还很小， 大部分仅限于简单的食用， 出口产品也只限 于初制品， 还未应用高科技进行深层次的加工和利用。 而藻类的一些高科技深加工产品则主 要依靠进口， 作为药物使用价格十分昂贵。 目前藻红蛋白的生产基本由美国Sigma公司垄断， 国内有以红毛菜、紫球藻和螺旋藻作为原料提取藻红蛋白的报导，目前仍处于研究阶段，未 有成品进入市场销售。我国海域宽广，藻类资源十分丰富，是世界上最大的紫菜生产大国， 我国紫菜养殖和加工又主要集中在苏、浙、闽沿海， 其产量占全国的95%以上。江苏省如 东县条斑紫菜生产量占全国总量的50%.紫菜的市场价格是红毛菜的1/10， 小球藻和螺旋藻的 1/3。选用紫菜提取藻胆蛋白，具有成本低，得率高的优点。紫菜中的藻胆蛋白其大部分主 要是藻红蛋白(PE) 。由于已报道的藻胆蛋白分离纯化方法复杂，导致生产成本太高无法大 量制备以满足潜在的市场需求， 本研究的目的就是探讨一种简单有效的适合大量制备的分离 纯化藻胆蛋白的方法。 1本课题得到农业部水产种质资源与养殖生态重点开放实验室(KFT2006-2)得资助。 - 2 - 1 材料与方法材料与方法 1.1 原料原料 坛紫菜产自浙江省象山港海区。 1.2 试剂试剂 磷酸二氢钾 分析纯 上海试剂厂 氢氧化钠 分析纯 上海试剂厂 硫酸铵 分析纯 上海试剂厂（均为 AR 级） 1.3 仪器仪器 UV-2102 C 型紫外分光光度计 上海精密科学仪器有限公司制造 DHG9070AS 新型电热恒温鼓风干燥箱 宁波江南仪器厂 AnkeTGL-16C 离心机 上海安亭科学仪器厂 旋转蒸发器 RE-52 上海正荣生化仪器厂 高速冷冻离心机 湖南湘仪 JY92-超声细胞粉碎机 宁波新芝生物科技有限公司 冷冻干燥器 Ilshin Lab co.,Ltd of Korea 微膜过滤装置 天津奥特赛恩斯仪器有限公司 其他仪器： 量筒、离心管、烧杯、移液管、三角锥形瓶、刻度试管、试剂瓶、容量瓶、玻璃棒 1.4 坛紫菜细胞破碎工艺坛紫菜细胞破碎工艺 图 1 紫菜细胞破碎工艺 Fig1 Flow sheet procedures of cell broken from laver 1.5 藻胆蛋白粗提物的制备藻胆蛋白粗提物的制备 1.5.1 溶胀法溶胀法 直接用蒸馏水或低盐溶液浸泡藻体细胞，使其溶胀、破裂、释放出藻胆蛋白。但此法提 取周期长，蒸馏水浸泡要1 0 d ，低盐溶液浸泡也要34 d5 。 称取5.99g紫菜粉，用蒸馏水浸泡，充分溶胀。经过12天后，用74微米的滤布过滤，并 粉碎 紫菜 水酶浸泡 水浸泡 超声波破碎 超声波破碎 水浸泡溶胀 - 3 - 将滤液在4下5500g 离心20min，去除藻体残渣，取紫红色上清液即为藻胆蛋白粗提物。 1.5.2 超声波破碎超声波破碎 运用超声波破碎细胞壁，使藻胆蛋白溶出。该法常作为藻胆蛋白提取中的辅助方法，还 须与其它方法合用以最大限度破碎细胞5。 称取4.372g紫菜粉，用蒸馏水浸泡4小时，充分溶胀。在冰浴中进行超声波破碎，防止 温度过高使蛋白变性，工作时间为5s，间歇时间为10s， 20次为一个循环，散热1min ，进 行5个循环。放在冰箱中过夜，再用74微米的滤布过滤，并将滤液在4下5500g 离心20min， 去除藻体残渣，紫红色上清液即为藻胆蛋白粗提物。 1.5.3 酶解法酶解法 利用琼胶酶酶解紫菜的特性， 使藻胆蛋白释放出来。 此法效果较好， 但由于加入了酶液， 使后期纯化工作难度增加6,10。 称取10.457g紫菜粉，用含有琼胶酶的蒸馏水酶解5小时，再将其在冰浴中进行超声波破 碎，防止温度过高使蛋白变性，工作时间为5s，间歇时间为10s， 20次为一个循环，出散热 1min ， 进行5个循环。 放在冰箱中过夜， 再用74微米的滤布过滤， 并将滤液在4下5500g 离 心20min，去除藻体残渣，取紫红色上清液即为藻胆蛋白粗提物。 1.6 藻胆蛋白的纯化藻胆蛋白的纯化 1.6.1 硫酸铵盐析硫酸铵盐析 将藻胆蛋白的粗提液加入到1545梯度饱和硫酸氨溶液进行盐析实验， 其饱和硫酸 氨溶液梯度设置如下15、 20、 25、 30、 35、 40、 45。 4过夜， 并在4下20000g 冷冻离心15min ，取沉淀，并将沉淀溶于低浓度的磷酸盐缓冲液（pH 6.8）中，测其吸光值， 以备进行下一步纯化工作4。 1.6.2 膜过滤膜过滤 运用超滤膜过滤藻胆蛋白粗溶液，制得藻胆蛋白。国外有人用NaNO3 高渗- 超滤法分 离提纯藻胆蛋白，超滤时选用聚砜膜，在超滤过程中，无机盐和小分子蛋白质，包括小分子 的藻毒素透过滤膜而去掉，特别适用于易产生水华的微囊藻脱毒，提高产品的安全性。用此 法提取的藻胆蛋白是安全无毒的，且易于脱水,产品易于干燥。 将上述样品通过 0.22 微米的聚砜膜，从而使藻胆蛋白得到纯化，并测吸光值。 1.7 藻胆蛋白溶液的浓缩干燥藻胆蛋白溶液的浓缩干燥 1.7.1 旋转蒸发浓缩旋转蒸发浓缩 在一定真空度条件下，恒温加热，使旋转瓶恒速旋转，物料在瓶壁形成大面积薄膜，高 效蒸发。溶媒蒸气经高效玻璃冷凝器冷却，回收于收集瓶中，大大提高蒸发效率。特别适用 于对高温容易分解变性的生物制品的浓缩提纯。 将上述纯化后的藻胆蛋白用旋转真空蒸发仪蒸至物料呈紫红色胶状(控温在40以内) 7。 1.7.2 冷冻干燥冷冻干燥 冷冻干燥是利用升华的原理进行干燥的一种技术，将上述经浓缩后的藻胆蛋白溶液在 低温下快速冻结,然后在适当的真空环境下放置 12 小时，使冻结的水分子直接升华成为水 - 4 - 蒸气逸出的过程，得到紫红色的藻胆蛋白固体7。 1.8 藻胆蛋白得率的计算藻胆蛋白得率的计算 蛋白质得率计算按以下公式计算： M 藻胆蛋白得率100 Mo 式中： Mo - 紫菜干重 M - 冷冻干燥样重 2 结果与分析结果与分析 2.1 破碎紫菜细胞壁三种方法的比较破碎紫菜细胞壁三种方法的比较 由于紫菜中藻胆蛋白是胞内蛋白，要提取分离藻胆蛋白，首先要破碎细胞壁、细胞膜， 使藻胆蛋白溶解释放出来， 并保持其生物活性。 细胞破碎程度越高， 藻胆蛋白的得率也越高。 不同材料、不同条件、不同目的的细胞破碎的方法也有所不同。目前用于藻胆蛋白提取分离 过程中的细胞破碎方法主要有反复冻融法、化学试剂处理法、溶胀法、超声波法和组织捣碎 法，实际操作过程中，上述几种方法经常混合使用，以最大限度地破碎藻体细胞，使藻胆蛋 白溶出。本文主要是对溶胀法、超声波法和酶解法进行比较，以得到最佳的破壁方法。 用溶胀法、 超声波破碎、 酶解法这 3 种细胞破碎的方法所得紫菜藻胆蛋白的粗提液的结 果见表 1。 表1 3种细胞破碎所得藻胆蛋白粗提液的的吸光值* Table1 The absorbance values of crude phycobiliprotein after three kinds of cell broken methods 方法 A280 A500 A568 A618 A568/A280A618/A280A568/A500 A 0.838 0.684 1.050 0.515 1.253 0.615 1.535 B 2.935 0.927 1.497 0.613 0.510 0.209 1.615 C 1.279 0.113 0.131 0.075 0.102 0.059 1.159 * A280、A500、A568、A618对应藻胆蛋白在280nm、500nm、568nm、618nm处的吸光值；藻红蛋白 的纯度用比值A568/A280表示；藻蓝蛋白的纯度用比值A618/A280表示 。 * A280,A500,A568,A618 correspond with the absorption of phycobiliprotein at 280nm, 500nm, 568nm, 618nm. Purity of PE was estimated by the ratio of A568/A280; Purity of PC was estimated by the ratio of A618/A280. 藻胆蛋白的纯度可以用以下三个指标来衡量： A568/A280、 A568/A500、 A618/A280 11。 A568/A280 的比值表明在提取液中含有杂质蛋白的多少，用它可以衡量藻红蛋白的纯度； A568/A500 的比值表明纯化的色素蛋白的特性。RPE 具有强大的二次吸收峰在 495nm， 而 B-PE 的波峰并不是很大。 当 A568/A5001.5， 则表明在紫菜的色素蛋 白中含有 B-PE。 结合文献分析， 得出溶胀法 （A） 处理得到的藻胆蛋白纯度最好， A568/A280 达到 1.253 ，A618/A280 达到 0.615，后期的纯化工作也较为方便，但其周期较长，用蒸馏 水需浸泡 10 天左右，低盐溶液浸泡也要 34 d 。用超声波破碎（B）得到的藻胆蛋白的纯 度较溶胀差，其中藻红蛋白和藻篮蛋白的纯度分别为 0.510 和 0.209 。该法常作为藻胆蛋白 提取中的辅助方法， 还须与其它方法合用以最大限度破碎细胞。 酶解法得到的藻胆蛋白纯度 最不理想，主要原因可能是：一是就在加入的酶液中含有较多的杂质蛋白，二是可能酶解的 时间不够，藻胆蛋白还没有完全释放出来。 - 5 - 2.2 不同饱和度硫酸铵纯化藻胆蛋白的结果不同饱和度硫酸铵纯化藻胆蛋白的结果 粗提液经过硫酸铵盐析、 冷冻离心后的结果见表2 。 1520饱和度硫酸铵浓度组的 沉淀中未有藻胆蛋白沉淀，自从25饱和硫酸铵浓度组以上，开始有藻胆蛋白沉淀。结合文 献分析4，35的硫酸铵溶液能将藻红蛋白沉淀析出，25的硫酸铵溶液能将藻蓝蛋白沉淀 析出， 但40和45的两组硫酸铵溶液的上清夜基本是无色的， 说明已经将藻胆蛋白完全沉 淀。粗提液经过多次的硫酸铵盐析后，纯度明显都提高了，藻红蛋白和藻蓝蛋白的纯度比达 到3.196和0.925 ，这对藻红蛋白而言，是个比较理想的结果。 表 2 藻胆蛋白经盐析后的吸光值 Table2 The absorbance values of phycobiliprotein after ammonium sulfate precipitation 硫酸铵浓度 A280 A568 A618 A568/A280A618/A280 25 0.601 0.370 0.556 0.616 0.925 30 0.838 1.050 0.515 1.253 0.615 35 0.163 0.521 0.128 3.196 0.785 40 1.139 1.370 0.562 1.203 0.493 45 1.205 1.369 0.564 1.136 0.468 2.3 膜过滤藻胆蛋白的结果膜过滤藻胆蛋白的结果 藻红蛋白和藻蓝蛋白的溶液分别经过孔径为 0.22 微米的聚砜膜，使得其纯度比分别达 到 3.324 和 1.274 。其吸收光谱图如图 2、图 3。从图 2 中可以看出藻红蛋白在 568nm 处具 有最大的吸收峰，从图 3 中可以看出藻蓝蛋白在 618nm 处具有最大的吸收峰。与杨方美3 等， 报道的条斑紫菜的藻红蛋白的特征吸收峰 564nm 和藻蓝蛋白的特征吸收峰 620nm 接近。 图 2、3 为藻胆蛋白组分的吸收光谱，分别在 558nm 和 616nm 处有很明显吸收，为藻红蛋白 和藻蓝蛋白。 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 200300400500600700800 Wavelength(nm) Abs 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 200300400500600700800 Wavelength(nm) Abs 图 2 经 0.22 微米的膜过滤后藻蓝蛋白的吸收光谱图。 图 3 经 0.22 微米的膜过滤后藻红蛋白的吸收光谱图。 Fig2 The absorption spectrum of PC after membrane filtration. Fig3 The absorption spectrum of PE after membrane filtration. 2.4 藻胆蛋白的得率藻胆蛋白的得率 5.99g 紫菜经过细胞破碎、分离纯化后，再所得的藻胆蛋白溶液经过旋转蒸发浓缩，冷 - 6 - 冻干燥后分别得到藻红蛋白的质量为 0.643g，藻篮蛋白的质量为 0.452g。 藻红蛋白的得率 0.549 藻红蛋白的得率1009.16。 5.99 藻篮蛋白的得率 0.418 藻篮蛋白的得率1006.97 5.99 3 结论结论 3.1 实验材料的选择实验材料的选择 结合文献分析，以脱脂干藻粉为原料提取藻胆蛋白的得率只有7%左右。本实验是从新 鲜的紫菜中提取藻胆蛋白， 得率为 9.16 。 我认为以新鲜的紫菜为原料提取藻胆蛋白较好， 主要是因为，一是以鲜藻为原料提取藻胆蛋白的得率可能要高于以干藻粉为原料的得率:二 是以鲜藻为原料提取藻胆蛋白时， 其生物活性要高于以干藻粉为原料的活性， 原因可能是鲜 藻经干燥时部分蛋白质会因温度升高而发生变性。 3.2 紫菜细胞破碎方法的选择及藻胆蛋白的提取紫菜细胞破碎方法的选择及藻胆蛋白的提取 溶胀法能有效破碎紫菜细胞， 释放出水溶性的藻胆蛋白， 并且能使藻红蛋白和藻蓝蛋白 的纯度达到 1.253 和 0.615 。同时有由于溶胀法中加入的是蒸馏水，这就给后期的纯化工作 带来了很多的方便， 不像酶解法那样， 加入的酶液在后期的纯化过程中就很难再将其分离出 来。在大规模制备时，为了最大限度的使细胞破碎，可以将溶胀法与超声波破碎处理结合起 来使用，这样的效果会更好。 3.3 藻胆蛋白溶液藻胆蛋白溶液(NH4)2SO4 盐析盐析 藻胆蛋白的盐析过程中， 文献报道采用25的硫酸铵溶液沉淀出藻红蛋白， 30硫酸铵 溶液沉淀出藻蓝蛋白。 本实验结果表明25硫酸铵溶液能将藻蓝蛋白沉淀出来， 35硫酸铵 溶液能将藻红蛋白沉淀出来， 并使其纯度大大的提高了， 藻红蛋白和藻蓝蛋白的纯度比达到 3.196和0.925 。为了提高藻胆蛋白的纯度和得率，可采用多级梯度盐析法9，即先用25饱 和度硫酸铵溶液沉淀，除去杂质，45的硫酸铵溶液沉淀藻胆蛋白，沉淀溶解以后第2次和 第3次盐析时逐渐收窄沉淀范围，这样既达到了较高的纯度比（3倍以上），又保证了较高的 得率。 本实验探索的经多级梯度硫酸铵盐析这种相对简单的方法可使纯化步骤简化， 适合大 规模生产要求，有实用价值。 3.4 藻胆蛋白溶液膜过滤藻胆蛋白溶液膜过滤 将藻红蛋白和藻蓝蛋白的粗提液分别经过 0.22 微米的聚砜膜，从而使藻胆蛋白进一步 得到纯化，藻红蛋白和藻蓝蛋白的纯度比达到 3.324 和 1.274 。此外，由于膜技术的发展， 可用膜技术分离代替其他纯化方法，将使整个分离过程更加简捷高效。 3.5 藻胆蛋白溶液的浓缩干燥藻胆蛋白溶液的浓缩干燥 用旋转蒸发浓缩和冷冻干燥可以节省时间， 有利于提取的效率， 特别适用于对高温容易 分解变性的生物制品的浓缩提纯。 - 7 - 综上所述，本实验得到的适用于大规模生产藻红蛋白和藻蓝蛋白的工艺流程如下所示。 紫菜 破碎细胞悬液 水溶性蛋白混合液 藻胆蛋白溶液 藻胆蛋白粉 （成品） 参考文献参考文献 1 郝俊, 王建中, 呼晓姝. 超声波辅助提取螺旋藻藻胆蛋白的工艺探讨J. 食品工业科技 , 2007,(02):170-172. 2 Wang Xingping, Xie Bijun, Pan Siyi ,Chen Dewen. 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