双功能试剂与螯合金属元素标记多肽新技术的建立.pdf

，弟 4 4巷 2 0 1 6年 7月 分析 化学 ( F E NXI HUAXUE) 研 究 报告 C h i n e s e J o u rna l o f An a l y t i c a l C h e mi s t r y 第 7期 l 0 2 2 1 02 8 D OI ： 1 0 1 1 8 9 5 j i s s n 0 2 5 3 - 3 8 2 0 1 5 0 6 1 5 双功能试剂与螯合金属元素标记 多肽新技术的建立 田慧芳 徐庆春 丁慧荣 田志华 张 宏 朱 华 王 昕 沈 靖 ( 北京大学肿瘤医院暨北京市肿瘤 防治研究所 中心实验室 ， 恶性肿瘤发病 机制及转 化研 究教育部重点实验室 ， 北京 1 0 0 1 4 2 ) ( 北京中海康医药科技发展有限公司， 北京 1 0 0 0 8 2 ) ( 北京 大学 肿瘤 医院暨北京市肿瘤防治研究所核医学科 ，北京 1 0 0 1 4 2 ) ( 中国人 民解放军 防化学 院生化 防护 系 ， 北京 1 0 2 2 0 5 ) 摘要建立 了双功能试剂 2 一 ( 4 一 异硫氰基苯基)甲基 一 1 ， 4 ， 7 ， 1 0 一 四氮杂环十二烷一 1 ， 4 ， 7 ， 1 0 四乙酸 ( p - S C N B n D O T A) 与标准肽段反应的新方法， 测定了反应产物与镧系金属 E u 的螯合效率， 探索了其作为靶 向探针和蛋白定量标记试剂性能。考察了不同缓冲体系的浓度及 p H值、 P S C N B n D O T A量与肽段相对量、 反应体系中有机相与水相比例， 反应温度与反应时间对偶联效率的影响。实验结果显示： p - S C N B n D O T A量 为肽段的 3 2倍， 缓冲体系为 0 2 mo t L T E A B( p H 8 5 ) ， 6 0 C反应 6 0 mi n ， 有机相与水相之比为4 4 ： l ( ) 时标记效率高 ； 在 H C 1 N a A e 缓 冲体 系( p H 4 0 ) 中 6 0 反应 6 0 mi n ， 金属离子鳌合反应效率 高达 9 4 。本研 究建立了一种新的基于双功能试剂p - S C N B n D O T A的标记方法 ， 并成功用于 R G D肽等的标记。 关键词双功能试剂；标记； 多肽 ； 蛋白定量； 质谱 1 引 言 双功能试剂连接多肽并螯合金属元素， 可以作为靶 向探针结合分子影像技术用于肿瘤的靶向治疗 研究 ， 还可以通过标记多种金属元素制备蛋 白质组学多重定 量试剂 ， 用于肿瘤标志物的筛选 、 鉴 定 、 分类等研究。因此双功能试剂在肿瘤研究方面具有 良好的应用前景。 R G D肽是一类含有精氨酸一 甘氨酸一 天冬氨酸 ( A r g G l y A s p ) 序列的短肽 ， 基 于靶向多肽 R G D进行 放射性核素标记 可用于 ， ( +) 肿瘤 的无 创性 检查 以及 判断 患者 是否适 用 于抗肿 瘤血 管形 成治 疗 J 。此外 ， 标记的小分子多肽具有生物相容性好 、 穿透性强 、 免疫原性低 、 作用快 、 易于实时监测 的 特点 ， 可在基于靶 向探针的蛋白的分析检测方面发挥独特优势- o 。 在肿 瘤蛋 白质组 定 量分 析研 究 方 面，目前 已开发 的方法 有 基 于稳 定 同位 素标 记 的方 法 ， 如 I CATl 8 、 O酶切标记_ 9 j 、 S I L A C 1 0 、 i T R A Q 等 ， 但这些方法普遍存在同位素价格昂贵 、 标记难度较大 、 对质谱分析仪器具有 选择性 、 同位素 峰在质谱分析时会发生相互 干扰等缺点 ， 会给定量结果 带来误 差 。因此探索非同位素标记的方法 ， 开发具有我国 自主知识产权的蛋 白定量试剂具有重要意义。文 献 1 31 5 报道了针对肽段半胱氨酸标记设计 的金属编码亲和标签。徐 明等 刮利用外源 Hg 标签标 记硒蛋 白 多肽 ， 实现 S e H g双元素标记选择性识别和检测硒蛋 白 多肽 。但是在实际的蛋 白质组学样 本分析中， 需要使用适用于所有肽段的标记方法。L i u等 开发了基于双功能试剂二乙酸胺五 乙酸的 标记方法 ， 实现了肽段 的无歧视标记 ， 但所选择的双功能试剂标记效率不高。针对此问题 ， Wa n g等 用羟基琥珀酰亚胺一 四氮杂环十二烷 四乙酸( D O T A N H S e s t e r )作为螯合试剂进行 了初步研究 ， 在此基 础上 ， 文献 1 2 ， l 9 对标记方法进行了优化 ， 提高了金属标记效率。 虽然非同位素标记的方法 已取得 了进展 ， 但是仍有 以下几方面需要改进。首先 ， D O T A N H S e s t e r 容易水解 ， 在反应体系中， 活化酯与 一N H 的标记反应和水解反应互相竞争 ， 不利于反应体系 中水相 和有机相组成的确立 。其次 ， 肽段中 一N H，与 D O T A- N H S e s t e r 是亲核取代反应 ， 反应体系应在中性 2 0 1 5 1 0 - 0 3收稿 ； 2 0 1 6 -03 1 1 接受 本 文系北京市 自然科学基金 ( N o s 7 1 4 3 1 7 2 ， 7 1 4 3 1 7 3 ) 资助 E m a i l ：s h e n j i n g 6 9 s i n a c o rn 第 7期 田慧芳等 ： 双功能试剂与螯合金属元素标记多肽新技术的建立 1 0 2 3 或偏碱性条件进行 ； 而 D O T A N H S e s t e r 在碱性条件下极易水解 ， 水解产生酸 ， 在一定程度上改变反应体 系的 p H值 。因此， D O T A N H S e s t e r 的水解敏感性高不利于确立标记反应条件 ， 对实 际样本分析条 件的限制很大 ， 因此优化双功能试剂的意义重大。 2 ( 4 一 异硫氰基苯基 ) 甲基 一 1 ， 4， 7 ， 1 0 一 四氮杂环十二烷一 1 ， 4， 7 ， 1 0 一 四乙酸 ( P - S C N B n D O T A) 是一 种被广泛应用 的双功能螯合 试剂 ， 如 与牛血清 白蛋 白( B S A) 和鸡蛋清 溶菌酶标 记可用 于肿瘤 的检 测 2 1 1 ， 与利妥昔单抗 或核糖核酸 反应标记可以用于抗肿瘤药 的生物分布和显影 的研究 ， 还可 以与 聚乙二醇 标记得到胶束用于制剂研发等。它的化学结构较 D O T A N HS e s t e r 稳定 ， 不易发生水解反 应 ， 这对于标记反应条件 的确立十分有利 ， 并可 以通过螯合金属离子标记氨基多肽 。基于 p - S C N B n D O T A的标记方法的建立不仅有望开发一种新型 的金属标记试剂 ， 用于肿瘤蛋 白质组学的多重定量分 析 ， 而且可将该试剂用于 R G D肽 的标记 ， 从而有利于肿瘤受体显像剂 的开发。本研究建立 了基 于双功 能试剂 p - S C N B n D O T A的螯合金属元素标记多肽新技术 ， 并成功标记 R G D等标准肽段。 2 实验部分 2 1 仪器与试剂 U lt r a fl e x I I 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪( M A L D I - T O F M S ， 德国布鲁克公司) ； D i s c o v e r y D V 2 1 5 C D分析天平( 美国 O H A U S公司) ； H Q一 6 0涡旋混匀器 ( 北方同正生物技术发展有限公 司) ； P MC 一 0 6 0掌上离心机 ( 日本 T O MY公司) 。 一 氰基4 羟基 肉桂酸( 德国布鲁克公 司) ； 标准合成肽段 L G E Y G F Q N A L I V R 由吉尔生化 ( 上海) 有 限公 司合成 ； R G D肽 由北京 中海 康 医药 科技 发展有 限公 司合成 ； 三 乙二胺碳 酸盐 ( T E A B) 、 氯 化铕 ( E u C 1 ) ( 美 国 S i g m a A l d r i c h公司) ； p S C N B n D O T A( 美国 Ma c r o c y c l i c s公司) ； 其它试剂均为国产分析 纯 ； 实验用水为 Mi l l i Q( 美 国 Mi l l i p o r e公司) 超纯水 。 2 2实验方 法 2 2 1 P S C N B n - DOT A 与标准肽段的偶联反应 1 0 0 L 0 5 I L m o L p - S C N B n D O T A溶于二 甲基 甲 酰胺 ( D MF ) ， 5 0 L 0 6 8 p mo L肽段 L G E Y G F Q N A uV R溶于 T E A B。将两种溶液 以不 同比例混合进行 偶联反应 ， 考察 T E A B的浓度和 p H值 、 D O T A与肽段的摩尔 比、 反应温度 、 反应时间等条件对偶联效率 的影 响。其中肽段的终浓度始终为 0 0 5 n m o l L 。称取 R G D肽 1 m g ，加 D MF 1 2 4 ， 供 P S C N B n D O T A与 R G D肽的偶联反应 。 2 2 2 偶联产物与金属离子的螯合反应向 2 2 1中的反应体系加入 5 t z L 0 1 m o l L E u C 1 溶液 ( 盐 酸 乙酸钠缓冲液或乙酸 乙酸铵缓冲液) ， 再分别加入相应的不同 p H值的缓冲液 5 0 ， 考察 p H值 、 反 应温度 、 反应时间对螯合效率的影响。 2 2 3 MAL D I T O F - MS分析 ( 1 ) 干点法点样取 1 l x L分析样品点于 G r o u n d s t e e l 靶板上 ， 自然干 燥后 ， 再点 5 m g mL C HC A基质溶 液 ( 0 1 T F A - 5 0 乙腈溶 液 ) 1 t x L ， 自然 干燥后 进行 质谱分 析。 ( 2 ) 薄层法点样先在靶板上点0 5 C H C A基质的乙醇过饱和溶液， 自 然干燥后， 再点 1 C H C A 基质溶液( 5 mg m L， 0 1 T F A- 5 0 乙腈溶液 ) 和样 品的混 合溶液 。采 用 P e p t i d e C a l i b s t a n d a r d m o n o 作为标准品校正 ， 相对标准偏差 5 p p m。质谱数据采集采用反射模式。仪器控 制软件 为 F l e x C o n t r o l s o f t w a r e v e r i o n 3 0 ， 数据处理软件为 F l e x A n a l y s i s s o ft w a r e v e r i o n 3 0 。 3结果与讨论 3 1 双功能试剂的选择 目前针对巯基的金属元素标记方 法较 多， 标记氨基 的金属元素标记 方法研究较 少 ， 已有 的标记 。 端氨基的方法有转氨法等 ， 如先将蛋 白的游离 N 一 端氨基转化为活性 的羰基 ， 然后与连有肼 的荧光基 团反应得到标记分子 。氨基的金属标记 ， 理论上可以标记所有的肽段 ， 对所有的肽段和蛋 白质 ( 含巯 基和不含巯基的) 都能进行定量研究 2 0 I 2 。p - S C N B n D O T A是一种双功能螯合试剂 ， 可与肽段的氨 基共价结合 ， 并通过络合反应螯合金属离子 ， 与 Wa n g等 采用的 D O T A N H S e s t e r 相 比， 其结构稳定 ， 分 析 化 学 第 4 4卷 不易水解 ， 既能够明确反应体系中水相和有机相 的比例 ， 又有利于确定反应体系的 p H值 ， 这些均利于 标记反应条件的确立。 3 2金属元素和标准肽段的选择 p - S C N B n D O T A可与多种稀土金属离子形成螯合物， 其 中与镧系金属离子形成的螯合物稳定性最 佳 ， 故选镧系金属离子 E u作为螯合标签。 标准肽段 的选择应具有典型性 ， 由于实际的生物样本 大多是通过胰酶酶解成肽段 ， 肽段 C端是精 氨酸( R) 或者赖氨酸( K) ， 故选用常用的标准蛋 白牛血清 白蛋白的胰酶酶解肽段 L G E Y G F Q N A L I V R作 为标准肽段之一 ； R G D肽 由于在肿瘤诊断和治疗中的重要意义而被选作为标准肽段 。 3 3 肽段的金属元素标记反应原理 肽段的金属元素标记反应的原理如 图 1所示 ， 首先是肽段的氨基与 P S C N B n D O T A发生共价反 应 ， 反应产物再与镧系金属元素形成稳定螯合物。 焱 一 N N 。 髫 。 p s ooTA H H N H H N s 图 1 肽段 氨基的金属兀素标记的化学反应过程 F i g 1 C h e mi c a l r e a c t i o n p r o c e s s o f me t a l e l e me n t l a b e l i n g p e p t i d e a mi n o g r o u p M： E u ； P ： p e p t i d e p - S C N B n D O T A： 2 - ( 4 - 异硫氰基苯基) 甲基 - 1 ， 4 ， 7 ， 1 0 - 四氮杂环十二烷一 1 ， 4 ， 7 ， l 0 一 四乙 酸 ( 2 - ( 4 一 i s o t h i o c y a n a t o b e n z y 1 ) 一 1 ， 4 ， 7， 1 0 一 t e t r a a z a c y c l o d o d e c a n e 一 1 ， 4， 7， 1 0 一 t e t r a a c e t i c a c i d ) 。 以产物和反应物的M A L D I T O F M S质谱峰峰面积计算标记反应的效率， 标记效率( ) =产物峰面 积 ( 产物峰面积+ 原肽峰面积 ) 1 0 0 。 3 4 P S C N B n DOT A与标准肽段偶联反应的优化 3 4 1 缓冲体系对 P - S C N- B n - D OT A标记反应的影响考察 了 3种缓冲体系 N a H C O 3 一 N a 2 C O 3 体系、 D MF 一 三乙胺体 系以及三乙二胺 T E A B体系。对于 0 5 mo l L N a HC O 一 N a ： C O ， 缓冲液( p H 8 8 ) ， 由于反 应产物盐浓度过高， 需要稀释 5 0倍 以上才能被 MA L D I T O F检测到 ， 而且钠盐是不可挥发性盐， N a 对质 谱可能产生的干扰不易去除。S c h e i n b e r g 等 将 p - S C N B n D O T A与肽段 G G G F C在无水 的 D MF一 三 乙 胺体系中反应 ， 但是实际的生物样 品酶解产物是含水的体系 ， 因此纯有机溶剂的 D MF 一 三 乙胺体系不适 用于生物样品酶解产物分析 。而 T E A B是可挥发性碳酸盐 ， p - S C N B n D O T A与肽段 L G E Y G F Q N A L I V R ( m z 1 4 7 9 ) 可以在 T E A B缓冲体系中反应生成标记产物( m z 2 0 3 1 ) ， 而且结晶状态好 ， 适合质谱检测 ， 因此 ， 选择 T E A B体系进行后续实验条件优化。 3 4 2 P S C N B n D OT A的量与肽段量的比例、 反应温度、 反应时间对标记反应 的影响 由于标记反 应 中影响标记效率的因素众多 。 ， 本研究考察了p - S C N B n D O T A量与肽段量的 比例 、 反应温度 、 反应 时间等因素 ， 结果 如表 1所示 。由表 1可见 ， p - S C N B n D O T A和肽段 的摩尔 比为 3 2倍 ， 在 6 0 C反应 6 0 m i n时， 标记效率最高 ， 因此选 择上述条件为最 佳反应条件 。与文献 2 0 报道 的 D O T A N H S e s t e r 5 O倍过量于肽段、 肽段的终浓度为 0 1 2 5 n m o l l L相比， 本方法反应试剂 的用量少 ， 而且适用 的肽段 的 浓度更低 ， 显示出更高的标记灵敏度 。肽段和标记产物的质谱图如图 2所示。 3 4 3 反应体系中有机相与水相比例的考察实验条件优化过程 中， 为保证肽段 的终浓度一致 ， 需要 改变有机相和水相的比例来实现其它参数的调整。实验过程中发现， 在一定范围内， 反应体系中水的比 第 7期 田慧芳等： 双功能试剂与螯合金属元素标记多肽新技术的建立 表 1 p - S C N B n D O T A和肽段 的 比例 、 反应 温度 、 反应 时间对标 记效 率的影响 Ta b l e 1 Ef f e c t o f mo l a r r a t i o o f P S CN Bn DOTA a n d p e pt i d e，r e a c t i o n t e mp e r a t ur e，r e a c t i o n t i me o n t he l a be l i ng e f f i c i en c y p - S C N B n D O T A和肽段 的 比例 Mo l a r r a t i o o f p S C N- B n - D O T A a n d p e p t i d e ； p - S C N B n - D O T A标记的肽段 p - S C N B n DO T A l a b e l e d p e p t i d e 例越高 ， 标记效率越低 ， 最佳有机相与水相之比为 4 ： 1 5 ： 1 ( v v ) 。 3 4 4 缓冲体 系浓度及 p H值对反应的影响 缓冲体系浓度及 p H值是影响螯合剂配位能力的主要因 素。本研究考察了 0 1 ， 0 2和 0 5 m o l L T E A B缓冲溶液在 p H值分别为 6 5 ， 7 5 ， 8 5 ， 9 5时 D O T A 与肽段的偶联效率 ， 用三乙胺和冰醋酸调节 p H值 。结果表 明， 缓 冲体系为 0 2 mo l L T E A B， p H 8 5的 条件下偶联效率较高 ， 且重现性好。 3 5 P - S CN- B n - DOT A与 R GD肽的偶联反应 按照 2 2 1 节实验方法制备 R G D肽 ， 在优化的条件下 ， 即缓冲体系为 0 2 mo l L T E A B( p H 8 5 ) ， 与 p - S C N - B n D O T A在 6 0 进行偶联反应 6 0 mi n， 实验结果如图 3所示 ， 标记效率为9 0 6 。 1 4 9 8 9 8 P ：L G E YG F QN A L I V R _ - a 1- 。 2 0 31 07 7 f D O T A -P l 。 1 4 7 9 8 5 8 I h I I I I 图 2 标 准合 成 肽段 L G E Y G F Q N A L I V R( a )和与 p - S C N B n D O T A 偶联产物( b ) 的基质辅助激光解吸离 子化 飞行时间质谱( MA L D I T O F MS ) 图 Fi g 2 Ma t r i x a s s i s t ed l a s e r d e s o r pt i o n i o n i z a t i o n t i me o f fl i g h t m a s s s p e c t r o m e t r y ( MA L D I T O F MS ) s p e c t r a of s y n t h e t i c p e p t i d e L G E Y G F Q N A L I V R( a )a n d P - S C N B n D O T A l a b e l e d p e p t i d e( D O T A - P )( b ) 图 3 R G D肽与 p - S C N B n D O T A偶联产物的 MA L D I T O F MS图 Fi g 3 MALDI - TOF MS s pe c t r u m of t he pr o d u c t of RGD p e p t i d e l abe l e d w i t h S C N B n - D O T A ( D O T A - R G D) 3 6 反应温度、 反应时间及 p H值对螯合反应的影响 对于 E u C 1 与 D O T A偶联产 物的标记反应 ， 分别考察 了乙酸铵一 乙酸 ( H A c N H A c ) ， 盐 酸- 乙酸钠 ( H C 1 一 N a AC ) 反应体系 ； 反应温度为 3 0 ， 6 0 和 1 0 0 o C； 反应时间为 1 5和6 0 mi n ； p H值为 4 0和 5 5时 的标记效率。结果如表 3及图 4所示 ， 其 中在 p H 4 0的 HC 1 N a A C缓冲液中， 6 0 C反应 6 0 mi n 标记效 率最高 ， 而且酸性条件下 ( p H 4 0 ) ， 可以减少金属离子和肽段的非特异性结合 。 3 7 MAL DI 检测方法的考察 对用于 MA L D I 检测的样 品点样方法进行 了考察 ， 比较 了干点法和薄层法两种方法。如图 5所示 ， l 0 2 6 分 析 化 学 第 4 4卷 结果显示干点法相对较好 ， 结 晶状态均匀 ， 样 品检测灵敏度高。 表 3 缓 冲体系 以及 p H、 反应温度 、 反 应时间以对标记肽段与金属离子螯合效率 的影响 T a b l e 3 E f f e c t o f b u f f e r s y s t e m ，r e a c t i o n t e mp e r a t u r e ，r e a c t i o n t i me o n t h e c h e l a t i n g e ffi c i e n c y o f me t a l i o n s wi t h l a b e l e d p e p t i d e 2 0 0 0 1 5 0 0 0 一 Eu D0TA P： 21 8 0 8 7 4 一 誓 lL j J 、_ L l - J 2 0 0 0 2 0 5 0 2l 0 0 2 1 5 0 2 2 0 0 2 2 5 0 2 3 0 0 2 3 5 0 2 4 0 0 m z 图 4 p - S C N B n D O T A标 记肽段 与 E u C 1 螯合产物 的 质谱图 Fi g 4 MS s p e c t r um o f c h e l a t i ng pr o d u c t o f P SCN Bn D O T A l a b e l e d p e p t i d e w i t h E u C 1 3 ( E u D O T A P ) 4 结 论 一 誉 皇 A _k JI t, - 一 B 一 2 O 0 9 7 6 一 1 1 8 5 0 1 9 0 0 1 9 5 0 2 0 0 0 2 0 5 0 21 0 0 21 5 0 r a z 图 5 不 同点 样方 法对 检 测 p - S C N B n D O T A与肽 段 L G E Y G F Q N A L I V R偶 联 产 物 的 影 响 ：( A) 薄 层 法 ； ( B ) 干点法 Fi g 5 Ef f e c t o f di f f e r e nt s a mp l e p r e pa r a h o n me t ho d s o n e f fi c i e n c y o f p e p t i d e L G E Y G F Q N A L I V R l a b e l e d b y P S C N B n DO T A A T h i n l a y e r me t h o d： B D r y d r o p me t h o d 本研究 通 过双 功能 试剂 p - S C N B n D O T A与 R G D等 标 准 肽 段 反 应 ， 考 察 与 镧 系 金 属 元 素 E u 螯合效率 ， 对螯合稀 土金属标记肽段的反应条件进行 了优 化。p - S C N B n D O T A与标准肽段反应 的条件为 ： D O T A为肽段的 3 2倍 ， 缓 冲体系为 0 2 m o l L T E A B， p H 8 5 ， 反应温度 6 O ， 反应时间为 6 0 ra i n ； 偶联产物与金属离子反应 的条件为 ： p H 4 0的 H C 1 N a A C缓 冲体系 中反应 6 0 m i n 。MA L D I T O F检测时样品点样方法使用干点法较好 。本研究结果表明， p - S C N B n D O T A在标记 R G D等多肽上 有 良好的应用 ， 有望成为一种新的高灵敏度金属标记试剂和肿瘤受体显像剂。 Re f e r e n c e s 1 L e e S ，X i e J ， C h e n X C h e m R e v ， 2 0 1 0， 1 1 0 ( 5 ) ： 3 0 8 7 - 3 1 1 1 2 K e r r T J ， M c L e a n J AC h e m C o m mu n ， 2 0 1 0 ， 4 6 ( 3 0 ) ： 5 4 7 9 - 5 4 8 1 3 A n g C Y， T a n S Y， Z h a o Y O r g B i o mo 1 C h e m ， 2 0 1 4 ，1 2 ( 2 7 ) ： 4 7 7 6 - 4 8 0 6 4 Vo n Wa l l b run n A，Hs l t k e C，Z t i h l s d o r f M，He i n d e l W ，S c h f e r s M，B r e me r C Eu r J Nu c 1 Me d Mo 1 I ma g i n g 2 0 o 7， 3 4( 5)： 7 4 5 7 5 4 5 DI“一 J u a n，Z HANG Xu C b u，Z HANG C h u n L i ，WA NG R o n g F u 6 e d l mmu n o a s s a y s a n d C l i n i c a l Me d i c i n e ，2 0 0 7 1 4( 1 )：5 8 6 1 邸丽娟 ，张旭初 ， 张春丽 ， 王荣福标记免 疫分析 与I临床 ， 2 0 0 7 ， 1 4 ( 1 ) ： 5 8 6 l 第7期 田慧芳等：双功能试剂与螯合金属元素标记多肽新技术的建立 1 0 2 7 6 HU A N G Y a n Y a n ， Z H A O R u i J o u r n a l o fI n s t r u m e n t a l A n a l y s is ， 2 0 1 2 ， 3 2 ( 9 ) ： 1 1 8 4 1 1 9 0 黄嫣嫣 ， 赵 睿分析测试 学报 ， 2 0 1 2 ， 3 2 ( 9 ) ： 1 1 8 4 1 1 9 0 7 S h i b a KC h e m S o c R e v ， 2 0 1 0 ， 3 9 ( 1 ) ： 1 1 7 1 2 6 8 G y g i S P， R i s t B， G e r b e r S A， T u r e c e k F ，G e l b M H，A e b e r s o l d R N a t B i o t e c h n o 1 ， 1 9 9 9 ，1 7 ( 1 0 ) ： 9 9 4 9 9 9 9 Y a o X，F r e a s A，R a mi r e z J ，D e m i r e v P A，F e n s e l a u C A n a 1 C h e m ， 2 0 0 1 ， 7 3 ( 1 3 ) ： 2 8 3 6 - 2 8 4 2 1 0 O n g S E，B l a g o e v B， K r a t c h ma r o v a I ， K r i s t e n s e n D B ， S t e e n H， P a n d e y A， Ma n n M Mo 1 C e l 1 P r o t e o m ， 2 0 0 2 ， 1 ( 5 ) ： 3 7638 6 1 1 Ro s s P L，Hu a n g Y N，Ma r c h e s e J N，Wi l l i a ms o n B，P a r k e r K，Ha t t a n S，Kh a i n o v s k i N，P i l l a i S，De y S ，Da n i e l s S， P u r k a y a s t h a S，J u h a s z P，Ma r t i n S，B a r t l e t J o n e s M，He F，J a c o b s o n A，P a p p i n D J Mo 1 C e l 1 Pr o t e o m，2 0 0 4， 3 ( 1 2 ) ： 1 1 5 4 1 1 6 9 1 2 L I J i a B i n ， Z H O U L i a n Q i ， Y A N H u i ，L I N a n N a n ，H A O F e i R a n ，T I A N F a n g ， Z H A N G Y a n g J u n C h i n e s e J o u r n a l of C h r o m a t o g r a p h y ， 2 0 1 4 ， 3 2 ( 4 ) ： 3 6 1 3 6 8 李佳斌，周廉淇， 颜 辉，李楠楠， 郝斐然 ，田 芳 ， 张养军色谱 ， 2 0 1 4 ， 3 2 ( 4 ) ： 3 6 1 3 6 8 1 3 Wh e t s t o n e P A， B u t l i n N G， C o me i l l i e T M， Me a r e s C F B i o c o n j u g C h e m ， 2 0 0 4 ，1 5 ( 1 ) ： 3 - 6 1 4 Ah r e nd s R，Pi e pe r S，Ki i h n A ，We i s s h o ff H ，Ha me s t e r M ，L i n d e ma n n T，S c h e l e r C，Le h ma n n K，Ta ub ne r K，Li ns c h e i d MWMo 1 C e l 1 P r o t e o m ， 2 0 0 7 ， 6 ( 1 1 ) ： 1 9 0 7 1 9 1 6 1 5 He Y ，Es t e ba n Fe mdn d e z D，L i n s ch e i d M W T al an t a，2 01 5，1 3 4：468 47 5 1 6 X U Mi n g ，Y A N G L i M i n ， WA N G Q i u Q u a n C h i n e s e A na1 C h e m ， 2 0 1 5 ， 4 3 ( 9 ) ：1 2 6 5 - 1 2 7 1 徐 明， 杨利民， 王秋泉分析化学， 2 0 1 5 ， 4 3 ( 9 ) ： 1 2 6 5 1 2 7 1 1 7 L i u H， Z h a n g Y， Wa n g J ， Z h o u C ，C a i Y， Q i a n X A n a 1 C h e m ， 2 0 0 6 ， 7 8 ( 1 8 ) ， 6 6 1 4 - 6 6 2 1 1 8 Wa n g X， Z h a n g Y J ， Wa n g X Y，L i n H J ， Q i n W J ， Q i a n X H A n a 1 Me t h o d s ， 2 0 1 2，( 4 ) ：1 6 2 9 1 6 3 2 1 9 Wa n g X Y， Wa n g X， Q i n w J ，L i n H J ， We i J Y， Z h a n g Y J ，Q i a n x H A nal y s t ， 2 0 1 3 ，1 3 8 ： 5 3 0 9 5 3 1 7 2 0 Wa n g X i n ，D e v e l o p m e n t a n d A p p l i c a t i o n of a N o v e l Me t h o d f o r Mu l t ip l e x P r o t e o m i c Q u a n t i t a t i o n B a s e d o n Me t a l E l e me n t L a b e l i n g C o u p l e d w i t h Ma s s S p e c t r o me t r y ，A c a d e my o f M i l i t a r y Me d i c a l S c i e n c e ， B e i j i n g 2 0 1 2 王 昕金属 元素标记结合质谱技术的蛋 白质组 多重定量新方法研 究及应用 ， 北京 ： 军事 医学科学 院 ， 2 0 1 2 2 1 J a k u b o ws k i N，Wa e n t i g L，Ha y e n H，Ve n k a t a c h a l a m A，B o h l e n A V，R o o s b P H，An d r e a s M A na 1 A t S p e c t r o m， 2 O O 8，2 3：1 4 9 7- 1 5 0 7 2 2 C o o p e r M S ， Ma M T， S u n a s s e e K， S h a w K P ， Wi l l i a m s J D， P a u l R L ， D o n n e l l y P S ，B l o w e r P J B i o c o n j u g C h e m ， 2 01 2，23：1 0 2 9-1 03 9 2 3 S c h l e s i n g e r J ，Ko e z l e I ，Be r g ma n n R，T a mb u r i n i S，B o l z a t i C，Ti s a t o F，N o l l B，Kl u s s ma n n S，Vo n h o ff S，Wu e s t F， P i e t z s c h H J ， S t e i n b a c h J B i o c o n j u g C h e m ， 2 0 0 8， 1 9 ( 4 ) ： 9 2 8 9 3 9 2 4 F o n g e H，H u a n g H，S c o l l a r d D， R e i l l y R M， A l l e n C C o n t r o l R e l e a s e ， 2 0 1 2 ，1 5 7 ( 3 ) ： 3 6 6 3 7 4 2 5 D o n g S Y， Z h a o Z W，Ma H M P r o t e o me R e s ， 2 0 0 6 ， 5 ( 1 ) ： 2 6 - 3 1 2 6 Wh e t s t o n e P A， B u t l i n N G， C o r n e i l l i e T M， Me a r e s C F B i o c o n j u g C h e m ， 2 0 0 4 ，1 5 ( 1 ) ： 3 - 6 2 7 Ah r e n d s R，P i e p e r S，Kt i h n A ，W e i s s h o ff H ，Ha me s t e r M ，L i n d e ma n n T，S c h e l e r C，L e h ma n n K，T a u b n e r K，L i n s c h e i d M WMo 1 C e l 1 Pr o t e o m， 2 0 0 7， 6( 1 1) ：1 9 0 7 1 91 6 2 8 I z a t t R M， P a w l a k K， B r a d s h a w J S ，B r u e n i n g R L C h e mR e v ， 1 9 9 1 ， 9 1 ( 8 ) ： 1 7 2 1 - 2 0 8 5 2 9 A n t c z a k C， J a g g i J S ，L e F a v e C V，C u r c i o M J ，Mc D e v i t t M R，S c h e i n b e r g D A B i o c o n j u g C h e m ， 2 0 0 6 ，1 7( 6 ) ： 1 5 51 1 5 60 3 O MI We i ，WA N G J i n g ， Y I N G Wa n T a o ， C A I Y u n ，Q I A N X i a o H o n g C h i nes e-， A na1 C h e m ， 2 0 1 0 ， 3 8 ( 1 0 ) ：1 3 9 3 1 3 99 米 薇，王 晶， 应万涛 ， 蔡 耘， 钱小红分析化学， 2 0 1 0， 3 8 ( 1 0 ) ：1 3 9 3 1 3 9 9 3 1 Z H A N G A i H o n g ，L I N H o n g J u n ，H U A N G S h u n X i a n g ，Z H O U X u e Z h i J o u n rul of C h i nes e Ma s s S p e c t o m e t r y S o c i e t y ， 2 0 1 4 ， 3 5 ( 5 ) ： 4 2 7 4 3 7 张爱红 ， 林 虹君 ， 黄顺祥 ， 周学志质谱学报 ， 2 0 1 4 ， 3 5 ( 5 ) ： 4 2 7 4 3 7 1 0 2 8 分 析 化 学 第 4 4卷 Ne w Pe p t i d e La be l i n g a nd Ra r e Te c hn i q ue Ba s e d o n Bi f u nc t i o n a l Re a g e nt Ea r t h M e t a l Che l a t i n g Ta g s T I A N H u i F a n g ， X U Q i n g C h u n ，D I N G H u i R o n g ， T I A N Z h i H u a ， Z H A N G H o n g ， Z HU Hu a ，WAN G Xi n ，S HE N J i n g ( K e y L a b o r a t o r y o f C a r c i n o g e n e s i s a n d T r a n s l a t i o n a l R e s e a r c h of Mi n is t r y of E d u c a t i o n B e ij i n g， C e n t r a l L a b o r a t o r y ， P e k i n g U n i v e r s i t y C a n c e r H o s p i t a l &I nst i t u t e ， B e ifi n g 1 0 0 1 4 2 ，C h i n a ) ( B e ij i n g Z h o n g h a i k a n g H e a l t h T e c h n o l o g y D e v e l o p m e n t C o ， L i d ， B e ifi n g 1 0 0 0 8 2 ， C h i n a ) ( D e p a r t me n t ofNu c l e a r Me d i c i n e ， P e k i n g U n i v e r s i t y C a n c e r H o s p i t a l &I nst i t u t e ， B e ifi n g 1 1 4 2 ， C h i n a ) ( D e p a rt me n t ofB i o c h e mi c a l P r o t e c t i o n ， I n s t i t u t e of C h