第二节 石蜡切片制作ppt课件.ppt

石蜡切片的制作,1,简介：,石蜡切片是教学与研究工作中广泛运用的一种实验技术，特别对于细胞学、组织学、胚胎学、病理学，更是一种必备的研究方法。对于不同的显微镜具体的制作切片的技术也是不同的！现在以苏木精、伊红染色的常规制片为例作具体讲解！,2,整个石蜡切片的完成过程,3,各种药品的配制及器材准备,染色液的配制固定液的配制梯度酒精的配制采样器材的准备,4,染色液的配制,Ehrlich氏苏木精苏木精：2g;无水乙醇：100ml；冰醋酸：10ml；铝化钾或硫酸铝钾：10g；蒸馏水：100ml；甘油：100ml。,5,配制方法：1.将铝化钾或硫酸铝钾溶于蒸馏水中（加热至4045）；2.将苏木精溶于无水乙醇中，再加入冰乙酸、温热的铝化钾或硫酸铝钾溶液，最后加入甘油；3.配置完成后，置于温热和阳光充足处，成熟3个月，即可使用。,6,伊红溶液的配制,1.伊红酒精溶液的配制：伊红Y（0.5-1.0g）+95%无水乙醇（100ml），过滤。混合即可使用。2.伊红水溶液的配制：伊红Y（0.5-1.0g）+100ml蒸馏水，溶解至溶液中无伊红沉淀，过滤即可使用。,7,0.5%1%盐酸酒精溶液的配制,浓盐酸（0.51ml）+70%90%酒精溶液100ml，混合均匀即可。注意事项：因为浓盐酸对皮肤具有强烈的腐蚀作用及对呼吸道具有刺激作用，因此在配置的过程中一定要注意自身的安全。,8,固定液的配置,10%福尔马林（甲醛）溶液：100ml甲醛溶液+900ml蒸馏水。10%缓冲中性福尔马林（甲醛）溶液：100ml甲醛溶液+900ml蒸馏水+4g磷酸二氢钠+6.5g磷酸氢二钠。10%中性福尔马林（甲醛）溶液：100ml甲醛+900ml水+碳酸钙加至饱和充分振荡混合后，放置24小时取上清液使用。4%多聚甲醛-磷酸盐缓冲液：4g多聚甲醛+100ml磷酸盐缓冲液（适用于免疫组化学技术）。,9,不同浓度梯度酒精配制,梯度酒精的作用：将组织中的水分经过梯度酒精的作用，置换出来，以达到组织脱水的目的。配制：例如70%的酒精配制，70ml（100%纯酒精）+30ml蒸馏水混匀即可。,10,石蜡切片所需的实验器材,仪器：石蜡切片机、恒温蜡箱、载玻片、盖玻片、镊子、手术刀。材料：小鼠的组织（小鼠肝脏）。试剂：乙醚、无水乙醇、甲醛、冰醋酸、苦味酸、锇酸、正丁醇、二甲苯、石蜡、甘油、中性树胶。,11,第一步：取材,一般根据观察目的选取动物或人体组织，取材要迅速，组织块不宜太大，一般为组织学观察，取黄豆大小为宜。取材要用锋利的刀剪，不可用钝刀，更不可用力压、揉、挤等，以免损坏组织。,12,第二步：固定,无论何种器官、组织，要制成切片，首先需要固定。目的在于保存组织原有的形态，同时使之易于染色。固定要求：1：能迅速使蛋白质变性，使细胞维持原来的形态，既不收缩又不变形。2：固定剂必须也是保存剂，使组织在其中不易腐烂。3：固定剂应有较强的通透能力，以保证组织块的内部也能被及时的固定。4：固定后的组织应软硬适宜，便于切片。5:固定后的组织应容易被染料着色。！注意:不同固定剂固定时间不一样。具体问题具体分析。,13,第三步：冲洗、脱水、透明。,冲洗的目的在于弃去组织中过剩的固定剂，以免固定剂沉淀于组织之中影响切片的质量。脱水的过程就是用梯度酒精逐步取代水的过程，组织脱水一般由70%80%90%95%100%梯度酒精完成。在95%的时间可以稍长（注意：70%以上的酒精要回收利用）。脱水之后，将组织块放入100%的酒精+二甲苯溶液（1：1）再放入二甲苯溶液直到组织块透明为止，透明需要半小时到一小时左右。,14,第四步：浸蜡包埋,由二甲苯透明的组织块经过二甲苯+石蜡后，即可进入纯蜡中，一般浸蜡在温箱中进行，温度稍高于石蜡的温度，蜡质由于冬夏的温度不同而进行选择。注意：熔蜡及浸蜡温度保持在65左右。经过浸蜡之后的组织，必须包埋好才能切片。,15,第六步：切片,切片之前必须修整好蜡块，并且固定在木块之上，再将四周多余的残蜡用刀片削去，否则不易于切片和展片。切片使用旋转切片机时，应固定好木块；调整好切片刀与蜡块的距离与角度，一般刀的倾斜度为4-6度；根据切片的厚度不同调节厚度标志器，在操作的过程中还应注意自身的安全。,16,石蜡块的固着与整修,在包埋以后，就可进行切片。包埋好的石蜡块装上切片机进行切片前还须进行固着和整修。固着：一般旋转式切片机上都附有可固着石蜡块的金属小盘，这也可用同样大小的台木替代。用加热的蜡铲将包埋块粘贴于固着物上，并使组织块朝外，便于以后迅速切出所需的片子。整修：用加热的蜡铲或刀片将固着的包埋块四周修平，使上下两面修成平行面，常保留组织周围附着宽23mm的石蜡，而修好的蜡块呈长方形。还可削去一角以便于在蜡带上识别切片。,17,实验室切片机结构,18,切片机和切片刀,切片机是用来作各种组织切片的一种专门设计的精密机械，常用的是旋转式切片机，它的夹物部分是上下移动前后推进的，而夹刀部分则固定不动。主要部件是安装切片刀的刀台、安装包埋块的标本台和控制切片厚度的微动装置。切片时切片刀固定不动，转动转轮，标本台上下运动并按调好的切片厚度向前推进一定的距离，组织块上下运动一次，便在刀片上得到一张合乎厚度要求的切片。,19,切片方法,切片前，选择刀口平整无缺刻的部分来进行切削。将所要切的包埋块固定在标本台上，使包埋块外切面与标本夹截面平行，并让包埋块稍露出一截。将刀台推至外缘后松开刀片夹的螺旋，上好刀片，使切片刀平面与组织切面间呈15左右的夹角，包埋块上下边与刀口平行。在微动装置上调节切片要求的厚度，调节时应注意指针不可在两个刻度之间，否则容易损伤切片机，将刀台移至近标本台处，让刀口与组织切面稍稍接触，这时就可以开始切片了。方法是：右手转动转轮，左手持毛笔在刀口稍下端接隹切好的片子，并托住切下的蜡带，待蜡带形成一定长度后，右手停止转动，持另一枝毛笔轻轻将蜡带挑起，平放于衬有黑纸的纸盒内，注意切片速度不宜太快，摇动转轮用力应均匀，防止切片机震动厉害引起切片厚薄不均匀，还应注意转动的方向，以防标本台后移而切不到片子。切片完毕，应及时用氯仿将切片机的有关部分擦净。,20,石蜡切片展片,一般使用恒温水浴锅，温度控制在37-40左右，有利于石蜡切片的展开。待石蜡切片切片完全展开之后，即可用载玻片进行捞片。捞片手势切忌粗暴。一定要亲柔。防止两张切片粘黏在一起。,21,石蜡切片的烘烤,目的：使石蜡切片与载玻片粘黏更加紧密，防止在进行染色的过程中，组织片与载玻片分离开来，造成掉片。烘烤的温度及时间：使用恒温烤箱进行烤片，温度一般控制在38左右，时间一般控制在12h或者在恒温箱中过夜处理即可。,22,第七步：染色,在染色的操作中：最常用的为HE染色法。染色前必须准备好洁净的染色缸。并分别放入二甲苯、各种浓度的酒精及染料中进行染色。不同组织的染色时间不同。,23,切片、展片及烤片,二甲苯（1）脱蜡,二甲苯（2）,100%的酒精,95%的酒精,80%的酒精,70%的酒精,蒸馏水,苏木精染色,自来水洗（在显微镜下检查细胞核的颜色是否合适，若太浅，可经蒸馏水洗后放回重染，若过深则进行适当分化。）,24,0.5%的盐酸水分色数秒钟在显微镜下检查退之前红色,自来水冲洗（蓝化）,蒸馏水冲洗,0.5%伊红（95%酒精溶液）数秒钟,90%酒精,100%酒精（1）,100%酒精（2）,二甲苯+100%酒精（1：1）,二甲苯（1）,树胶封片,二甲苯（2）,70%酒精,80%酒精,25,第八步：透明,染色后的切片须再次经过脱水、透明。标本经二甲苯透明后，折射率改变，透明度提高，使得染上色的部位更清晰地显示出来。,26,第九步：封藏,封藏的目的：是使制成的切片能够永久保存，封藏剂必须能与透明剂互溶，对染色无影响，折射率近似玻璃和具有粘性的物质，常用的封藏剂有加拿大树胶和中性树胶。封片的方法是：将载玻片从二甲苯中吸出后，吸去多余的二甲苯，在标本上的二甲苯尚未干透之前加一滴树胶，仔细覆盖上盖玻片，避免产生气泡，也不得拖动盖玻片，以免将标本破坏。树胶量视盖玻片大小而定，勿使过多过少。贴上标签，注明材料、染色法，待封藏剂凝固后便成为一张成功的石蜡切片。,27,封片的注意事项,带有组织的载玻片，由二甲苯中取出，使用纱布或者滤纸迅速擦净多余的二甲苯，然后在组织切片上滴上一滴中性树胶轻轻的使用镊子夹取盖玻片盖在组织上面，轻轻压一下盖玻片（目的防止气泡的产生）。,28,第十步：显微镜下观察HE染色的结果,在显微镜下观察到细胞核呈蓝紫色，细胞质、胶原纤维、肌纤维呈粉红色。注意：根据不同的染色要求，苏木精染液可以稀释，加长染色时间，效果较好。伊红染液也可以相应的稀释，防止粉红色过深，影响细胞核与细胞质颜色的对比，尤其不利于黑白片显微系统的拍照。,29,切片中存在的问题及补救方法,石蜡切片是很不容易掌握的，有时很容易成功，有时则由于某种因素而造成切片的质量低劣，甚至完全失败。现将切片时经常遇到的一些缺点、可能的原因以及补救办法。,30,问题一：石蜡带弯曲不直,原因：1石蜡块上下两边不平行；2石蜡块的上下两边不和刀口平行；3刀口锋利不一，局部产生差异；4蜡块的一边较另一边为软，或两边的硬度不一致；5材料未居蜡块正中央；6材料大而形不正。,31,解决办法：1取下台木，将两边修干；2调节标本台，使两者平行；3移动刀片，改用新的刀口；4待蜡块冷却后再切，或重新包埋；5用刀片切去部分石蜡，使材料居中；6在大的一边切去少许石蜡。,32,问题二：切片分离、不能连成带状,原因：1室温过低；2石蜡过硬；3材料边缘留蜡太少；4刀的角度不适合。,33,解决办法：1在切片机上方开一电灯或提高室温；2在蜡块面加一层；45的软蜡或用手指蜡摩擦块面；3重新包埋；4矫正刀的角度。,34,问题三：切片卷起呈圆筒状,原因：1室温过低；2石蜡过硬；3刀口太钝；4刀的倾角太大。,35,解决办法：1提高室温；2加软蜡；3.用毛笔将蜡片摊开压住，切23片即成带；4减小倾角。,36,问题四：切片粘附于切片刀，皱摺在一起,原因：1室温过高；2石蜡过软；3刀口上留有一层石蜡；4刀口钝。,37,解决办法：1降低室温；2将蜡块投入凉水中稍浸增加硬度；3切片厚度，改用硬蜡包埋，用二甲苯拭去刀口的石蜡；4磨刀或移动刀口。,38,问题五：切片纵裂,原因：1刀有缺口；2石蜡块中含有颗粒、杂质；3刀口留有碎屑或细丝；4组织太硬。,39,解决办法：1可移动刀口；2将颗粒拽去；3清洁刀口；4让包埋块在水中浸泡。,40,问题六：切片有横纹,原因：1刀和台木的固定螺丝太松；2刀口倾斜度太大；3刀口有石蜡屑。,41,解决办法：1旋紧螺旋；2可放平12后再切；3用氯仿拭去。,42,问题七：切片厚薄不匀,原因：1切片机有毛病；2夹刀不当；3未旋紧标本台螺旋;4石蜡块过硬;,43,解决办法：1矫正切片机装置；2对症治疗；3旋紧螺旋；4将石蜡块在水中浸泡。,44,问题八：每张切片厚薄不匀,原因：1刀口震动，是由于材料过硬；2刀的倾角太大。,45,解决办法：1在蜡块表面涂一层火棉胶；2减小倾角。,46,问题九：材料发生裂隙破碎或脱落,原因：1脱水不干净；2有透明剂残留；3石蜡透入时，温度过高或时间过长；4由于脱水剂和透明剂的影响，使组织变硬发脆；5材料太硬或太粗。,47,解决办法：1无