（临床兽医学专业论文）猪体细胞克隆中条件优化及程序简化研究.pdf

两南大学硕士学位论文中文摘要 猪体细胞克隆中条件优化及程序简化研究 1 名床兽医学专业硕士研究生杨春艳 指导教师李跃民教授 摘要 本试验的目的是优化猪核移植技术条件探索猪核移植技术原理，简化猪核移植方法 发糕序，提高核移植效率。以便在本实验室建立高效的动物核移植技术研究平台，为进一步 生产克隆动物创造条件。本研究分别以极体排出比率、孤雌激活卵裂比率、核移植重构胚胎 卵裂比率和8 氇日胞以上胚胎生成比例为试验效果的检测统计指标，对猪卵母细胞体外成熟 最佳条件和成熟时间，对去核、移核方法和激活方式三个主要环节进行了研究，优化了试验 条件，获得了简化的核移植技术程序。 试验表明，以t c m l 9 9 为基础培养基进行猪卵母细胞体外成熟培养时，添加a a 或e g f 组的成熟率均极显著高于添加a a + e g f 组和对照组( p o 0 5 ) 。对各组成熟的卵母细胞孤雌激活后发现：a a 与e g f 组的卵裂率无显 著差异( 7 4 8 v s 7 4 2 ，p o 0 5 ) ，但都极显著高于a a + e g f 组和对照组( 6 1 5 、6 3 4 ， p 0 0 1 ) ；a a 、e g f 、a a + e g f 和对照组的8 细胞以上胚胎比例分别为3 2 6 、3 55 、 2 6 9 、2 8 1 ，其中a a 与e g f 组均极显著高于a a + e g f 和对照组( p o 0 1 ) ，e g f 组显 著高于a a 组( p 0 0 5 ) 。上述结果表明在猪卵母 细胞培养时添加一定量a a 或e g f 能提高其成熟率和卵母细胞质量。 猪卵母细胞体外培养3 9 , - 4 8 h 内，随培养时间的延长卵母细胞成熟率逐渐升高，而去核 率却逐次降低，在3 9 - - 4 1 h 、4 2 4 4 h 、4 5 4 8 h 三个时间段猪卵母细胞的成熟率分别为7 08 、 8 0 。1 、8 1 2 ，去核率分别为8 2 4 、8 2 2 、7 9 6 。随后的核移植重组胚培养结果表明： 3 9 , 4 1 h 组的卵裂翠极显著低于4 2 4 4 h 组( 3 7 2 v s 4 1 8 ) 和4 5 , - - - 4 8 h 组( 3 7 2 v s 4 30 ， p 0 0 1 ) ，8 - 细胞以上的胚胎比例也显著低于4 4 h 组( 1 5 0 v s l 7 5 ，p o0 5 ) 。而 胞质内注射完整体细胞步骤更简单，说明这种移核方法是简便可行的。 注核液中含c b 与否对随后核移植重组胚的卵裂率和发育到8 一细胞以上的胚胎比例都 没有显著影响( 4 4 - 3 v s 4 3 9 ，199 v s 2 1 2 ，p 00 5 ) 。因此去核后，可不换操作针而在去 核液中直接完成移核。 核移植重组胚经电激活+ 6 _ d m a p 处理或电激活+ 6 d m a p + c b 处理后的卵裂率和8 一 细胞以上的胚胎比例差异均不显著( 4 4 2 v s 4 4 6 ，2 2 3 v s 2 1 ，9 ，p o 0 5 ) ，但两处理组重 组胚的卵裂率和8 细胞以上胚胎比例都极显著高于单独使用电激活处理组( 3 8 1 ，1 9 3 ， p 0 ，0 5 ) ，w h i l et h e yw e r ea l ls i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nt h o s ei na a + e g f g r o u pa n dc o n t r o l ( 6 1 5 ，6 3 4 ，p 0 0 1 ) ；t h er a t e so f d e v e l o p m e n tt o8 - c e l ls t a g eo nc u l t u r e d o o c y t e si nt h ea a e g f , a a + e g fg r o u p sa n dc o n t r o lw e r e3 2 6 ，3 5 5 ，2 6 9 ，2 8 1 ， r e s p e c t i v e l y ；a m o n gt h e m ，t h er a t e so fa aa n de g fg r o u p sw e r eb o t he x t r e m e l ys i g n i f i c a n t l y h i 曲e rt h a nt h a to f a a + e g fg r o u pa n dc o n t r o l ( p o 0 1 ) ，t h er a t eo f e g fg r o u pw a ss i g n i f i c a n t l y h i g h e rt h a nt h a to f a ag r o u p ( p 0 0 5 ) t h e r e f o r e ，s u p p l e m e n to f t c m l 9 9 w i t hc e r t a i na ao re g fc a ni m p r o v et h ei v mr a t e a n dq u a l i t yo f p o r c i n eo o e y t e s ， w h e nt h ep o r c i n eo o c y t e sw e r em a t u r a t e df o r3 9 - - - 4 8 hi nv i l r o ，a st h eo o c y t ea g ei n c r e a s e d ， t h ei v mr a t ew a se n h a n c e d ，w h i l et h ee n u c l e a t i o nr a t ed e c l i n e d ；d u r i n gt h e3 9 - - - 4 1 h ，4 2 - , - 4 4 ha n d 4 5 - - 4 8 h 。t h ep o r c i n eo o c y t ei v mr a t e sw e r e7 0 8 ，8 0 ，1 ，8 1 2 ，r e s p e c t i v e l y ；t h ee n u c l e a t i o n r a t e sw e r e8 2 4 ，8 2 2 ，7 9 ，6 ，r e s p e c t i v e l y a f t e rt h ef o l l o w i n gc u l t u r eo f t h e s er e c o n s t r u c t e d o o c y t e s ，t h ec l e a v a g er a t ei n3 9 - 4 1 hg r o u pw a ss i g n i f i c a n t l yl o w e rt h a nt h a ti n4 2 - - 4 4 hg r o u p ( 3 7 2 v s 4 1 8 ) a n d4 5 4 8 hg r o u p ( 3 7 2 v s 4 3 o ) ( p 0 0 1 ) ，t h er a t eo f d e v e l o p m e n tt o8 - c e l l s t a g eo f fc u l t u r e do o c y t e si n3 9 n 4 1 hg r o u pw a ss i g n i f i c a n t l yl o w e rt h a nt h a ti n4 2 - - - 4 4 hg r o u p ( 1 5 0 v s l 7 5 ，p 0 0 5 ) s ot h ei n j e c t i o np r o c e s sc a nb ep e r f o r m e di nt h ee n u c l e a t i o nm e d i u m a f t e re n u c l e a t i o n t h er e c o n s t r u c t e dn to o c y t e sa c t i v a t e db ye l e c t r i c a lp u l s e + 6 - d m a po re l e c t r i c a lp u l s e + 6 - d m a p + c bh a ds i m i l a rc l e a v a g er a t ea n dp r o p o r t i o no f e m b r y o sw i t hm o r et h a n8 - c e l l ( 4 4 2 v s 4 4 6 ，2 2 3 v s 2 1 9 ，p 0 0 5 ) ，w h i l e t h e y w e r eb o t hs i g n i f i c a n t l yh i g h e r t h a n t h a ta c t i v a t e d b y as i n g l ee l e c t r i c a lp u l s e ( 3 8 。l ，1 9 3 ，p 0 0 5 ) f u r t h e r m o r e ，t h ep r o c e d u r e o f w i m i ss i m p l e ，s ow i mi sh a n d ya n df e a s i b l ei nn t k e y w o r d s ：p o r c i n e ，c u m u l u sc e l l ，n u c l e a rt r a n s f e r , e n u c l e a t i o n ，a c t i v a t i o n ， w h o l e c e l li n t r a c y t o p l a s m i cm i c r o i n j i e c t i o n 独创性声明 y9 3 7 毫9 学位论文题目：猹佳垫胞立隆史盘佳位焦丞猩庄笪丝煎壅 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 为获得西南大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我 一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的 说明并表示谢意。 学位论文作者：物前幸包签字日期：j - o c 6 年5 月- 2 - 0 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院可以将学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：面不保密， 口保密期限至年月止) 。 1 。， 学位论文作者签名：物番艳导师签名象炽声b 签字日期：2 d “年多月土。日签字日期：年月 日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 电话： 邮编： 第一章体细胞核移植研究进展 体细胞核移植( s o m a t i cc e l ln u c l e a rt r a n s f e r , s c n t ) 是指通过一定的显微操作方法，将动 物的体细胞核移入已经去除核遗传物质的卵母细胞内，组成重构胚并使之发育成新动物个 体，生产与体细胞供核体遗传上同质后代的过程。 1 细胞核移植的研究历史概况 甲在1 9 3 8 年，德国学者s p e m a n n 就提出将不同发育阶段胚胎细胞核甚至高度分化的细 胞核移植到去核的卵母细胞中，试图研究细胞分化和核质关系”j 。在1 9 5 2 年美国胚胎学 家r o b e r tb r i g g s 和t o m a sk i n g 将已分化的囊胚期多能性内细胞团移植到去核的蛙卵母细胞 中，得到了胚泡重新发育的结果，获得了正常的个体。这就证明了胚胎细胞核在特定的条件 下可以恢复其发育的全能性口j 。g u r d o n 在1 9 6 2 年将已经分化的蝌蚪肠上皮细胞核移植到去 核的蛙卵母细胞中，得到了可繁殖的爪蟾，证明蝌蚪上皮细胞核具有发育全能性p j 。 哺乳动物核移植的研究始于二十世纪七十年代，b r o m h a l l 在1 9 7 5 年将兔胚胎的细胞核 移植到来受精的兔卵母细胞中，获得了桑椹胚。随着显微操作技术的出现哺乳动物核移植 研究也取得了重大突破。1 9 8 1 年，h i m e n s e e 和h o p p e 利用核移植技术将小鼠的胚胎内细胞 团( i c m ) 细胞核直接注入去核受精卵中，得到了3 只正常的小鼠，但其结果没有被其它实验 室重复出来1 4 】。赢到1 9 8 3 年，m c g m t h 和s o l t e r 首次利用显微操作和细胞融合技术，以单细 胞期的小鼠胚胎作为供核体进行核移植，得到了核移植后代，并建立了重复性很高的核移植 技术程序，提高了核移植效率f 5 】。1 9 8 6 年，w i l l a d s e n 采用绵羊胚胎细胞进行核移植，成功 克隆出了1 只绵羊。发现卵母细胞较受精卵更适合作核受体，羊桑椹胚细胞核具有发育的全 能性，进而为哺乳动物的细胞核移植奠定了基础1 6 i 。随后胚胎细胞克隆技术也相继在牛 ( 1 9 8 7 ) 7 i ，猪( 1 9 8 9 ) 1 8 】和兔( 1 9 8 9 ) p 1 等动物上取得了成功。1 9 9 6 年，c a m p b e l l 等将分离的绵羊 拟干细胞进行了传代培养，并用血清饥饿法处理，而后移植到去核的成熟卵母细胞中，获得 了4 只克隆羊，这也是首次使用非早期胚胎细胞进行核移植而获得后代的报道【i “。 直到1 9 9 7 年，英国的w i l m u t 等人用来自胎儿成纤维细胞和成年绵羊的乳腺上皮细胞进 行核移植，得到了来自胎儿成纤维细胞的三只核移植绵羊和一只来自成年体细胞的核移植绵 羊一“d o l l y ”；并首次证明了成年动物分化的细胞具有发育的全能性。可以维持核移植胚胎 发育到个体。w i l m u t 等建立的一整套绵羊体细胞核移植程序也成为全世界公认的哺乳动物 体细胞核移植程序u 。从此，在体细胞核移植领域里，相继得到了小鼠( 1 9 9 8 ) i ”1 ， ( 1 9 9 8 ) ， 山羊( 1 9 9 9 ) i ”i ，猪( 2 0 0 0 ) t 1 “，猫( 2 0 0 2 ) l ”i ，兔( 2 0 0 2 ) ，骡子( 2 0 0 3 ) ，马( 2 0 0 3 ) 川，大鼠( 2 0 0 3 ) 等动物。 同时人们也尝试了黄牛。水牛( 2 0 0 0 ) 【”1 ，小鼠猪( 2 0 0 1 ) e 3 “，小鼠牛( 2 0 叭) 川，以及猪牛 ( 2 0 0 1 ) 1 3 2 峰动物种间体细胞核移植的研究，都分别得到了体外发育的胚胎。到目前为止得到 r 一些异种克隆动物，如欧洲盘羊( 2 0 0 1 ) l “i ，爪哇野牛，非洲野猫( 2 0 0 4 ) 1 2 s 等。 西南大学硕士学位论文文献综述 2 体细胞核移植的理论基础 核移植所依赖的理论基础：同一个胚胎或个体的每一个细胞核都具有相同的遗传物质， 所以来自同一胚胎或个体的重组胚产生的后代都具有相同的遗传基础。在个体发育过程中， 随着胚胎的发育和细胞的分化，核的某些基因组发生了变化，导致了这些基因组不能再恢复 到以前的状态，从而使核的全能性( t o t i p o t e n c e ) 丧失；而核移植程序可以使附植前胚胎甚至 经一定处理的体细胞核发生发育程序的重排( 去分化) 和发育程序重新活化( 再分化) ，使初步 分化的胚细胞核和已分化的体细胞恢复到受精时的状态以重新指导胚胎发育到个体。 3 核移植的基本操作程序和影响因素 3 1 核移植受体卵母细胞的选取 在哺乳动物的核移植研究中，作为细胞核移植受体胞质主要有三种：去核受精卵( 原核 胚胎) 、2 - 细胞胚胎及去核m i i 期成熟卵母细胞，其中卵母细胞的应用最为广泛。也有研究 片j 两个去核卵母细胞融合后产生的胞质作为受体胞质进行继代核移植，以增加核移植胚胎的 细胞数和提高继代核移植效率 1 1 7 , 1 1 5 i 。虽然用受精卵作为受体已经获得了克隆动物，但有部 分试验证明用其作为核受体时，受体细胞质所需要的胚胎核供体不能超过2 细胞阶段，否 则其重构胚无法正常发育0 3 埘1 。由于受供体核状况的限制，该方法尚不具备实用性。直到 w i l l a d s e n 采用去核的成熟卵母细胞( mi i 期) 作为核受体，以8 细胞期胚胎分裂球作核供体成 功克隆出绵羊屙，哺乳动物克隆技术才向实用性靠拢p l 。随后的核移植基本上都采用成熟的 卵母细胞作为核受体，起初的核移植研究多用体内成熟的卵母细胞，但是其来源有限，而且 不易控制卵母细胞的成熟阶段。随着体外成熟技术的发展，利用体外成熟的卵母细胞作为核 受体己成为解决卵母细胞不足的主要途径。另外，也有研究表明冷冻保存的卵母细胞解冻后 作为核受体可以支持核移植后的胚胎发育到个体p ”。 另外供核体与受体胞质的比例以及受体胞质的量对发育有重要影响，融合后细胞质的量 恢复到去核前的水平对核移植胚胎的发育有利。w e s t h u s i n 等发现卵母细胞去核量为5 时， 重组胚的囊胚发育就明显低于对照组，去核量达5 0 时，核移植囊胚的细胞数明显低于取 出5 细胞质的重组胚，但囊胚发育率相同，去核量的多少只影响核移植囊胚的质量而不影 响发育至囊胚的数量。 3 2 卵母细胞去核方法的影响 受体卵母细胞的完全去核是保证核移植胚胎发育的基本条件如果去核不完全，可导 致重组胚染色体的非整倍性，造成多倍体，卵裂异常，发育受阻和胚胎早期死亡。最初的去 核方法是“半卵法”，即将卵母细胞分为两半，去掉含有第一极体的一半，这种方法虽保证 了完全去核，但因胞质大幅减少，加速重组胚的异常分化影响胚胎发育。现今通常选用处 于mi i 期的卵母细胞去核，去核方法主要有： 2 西南大学顾寸学位论文文献综述 ( 1 ) 盲吸法，即用去核管吸出第一极体( p b l ) 及其附近部分的细胞质而完成去核此方法 操作简单实用，但卵母细胞在清洗和去卵丘细胞的过程中，部分的第一极体会移位，影响卵 母细胞的去核效率，故一般的去核成功率不高。另外动物种类不同去核效果也有所不同，兔 达到9 2 t 3 “牛和绵羊卵母细胞的去核率在6 2 ；e 右f 7 1 猪卵母细胞的去核率只有7 4 【8 i 。 此法的去核效率最主要是受卵母细胞卵龄影响，随卵母细胞体外成熟时间的延长去核率下 降。采用盲吸法去核时，应尽量选取刚排出p b i 的卵母细胞，对猪来讲，这个时问通常是 4 4 h 左右。 ( 2 ) 活性荧光染料染色去核法，用h o e c h s t 3 3 3 4 2 ( 2 s p g c m l ) 将卵母细胞染色l o 1 5 分钟。 i 面后在荧光显微镜下确定核的位置并将核吸出，去核后再观察吸去的细胞质或去核后的卵母 细胞，以保证去核的成功率。w e s t h u s i n ( 1 9 9 2 ) 实验表明h o e c h s t 3 3 3 4 2 染色核u v 短时间照射 不会影响卵母细胞维持供体核发育到出生的能力，因此在以而核移植研究中多采用此法f 3 s l 。 但也有实验证明，每次紫外线照射时间不应超过1 5 秒钟。 ( 3 ) 半卵法，将卵母细胞分为两半，用荧光染色挑选山不含极体的一半，然后用两个不 含极体的半卵与供体细胞进行融合，构建核移植重建胚胎p 。在2 0 0 1 年，b o o t h 等将两个 不含第一极体的半卵与供体细胞一起融合，取得了9 0 的融台率和3 7 的囊胚发育率。 ( 4 ) 功能性去核法，将卵母细胞浸泡在h o e e h s t 3 3 3 4 2d n a 染色液中，再用紫外线照射 卵母细胞的核区，使核在不取出的情况下丧失实际功能从而达到去核的目的。但此法对细胞 有较大损伤【4 “，目前无人报道用此法进行核移植研究。 ( 5 ) 离心去核法因为细胞核的密度大于细胞质，用离心的方法可使没有透明带的卵母 细胞的细胞核被甩向一侧而最后脱离卵母细胞 4 0 , 4 1 1 。但该法必须去掉透明带，不利于今后的 胚胎发育。如果同样能应用于透明带完整的卵母细胞，那么这种方法会成为一种有效的去核 方法。 ( 6 ) 化学试剂去核法，用e t o p o s k l e 和放线菌酮处理减数分裂中期的卵母细胞，处理后 的染色体不再分开，形成染色复合体，在卵母细胞排出极体时染色体复合体便随极体一起 排山2 , 4 3 1 。该方法可以同一时间大量去核，避免了操作的不稳定性和低重复性，有望成为一 种有效的去核方法。 ( 7 ) 末期去核法，b o r d i g n o n 等选用成熟3 0 h 的牛卵母细胞，先用7 的酒精激活处理 5 m i n ，再培养3 h 使其排出第二极体，然后吸出第二极体附近少量的细胞质，这样卵母细胞 的核就可以随胞质被去掉，其去核率为9 8 i “。也有通过钙离子载体a 2 3 1 8 7 和放线菌酮 ( c h x ) 联合激活体外成熟的卵母细胞，发现激活后的卵母细胞染色体全部紧靠p b 2 去 除p b 2 和附近的细胞质可以提高去核率。 r 8 1 极性显微镜去核法，l i u 等在2 0 0 0 年报道：利用mi i 期卵母细胞的细胞质和纺锤体 对光的折射率不同，研制出一种纺锤体图像观察系统( s p i n d l e - v i e w ) - - 偏振光学系统，利j j 该 系统可观察到染色体所处的位置，而后进行去核【”i 。其去核率可达到1 0 0 ，而且仅有很小 西南大学硕+ 学位论文 文献综述 一部分的胞质和线粒体( 5 5 ) 被去除剩下的胞质容量能支持重构胚进一步正常发育。 ( 9 ) 挤压法，在多数卵母细胞第一极体即将排出的时候，在极体附近挑破透明带，然后 挤压使极体捧出由于此时极体尚未完全与中期板分开，从而可以带着相邻的核一起排出， 此方法已经在牛和猪上进行了尝试，并取得了成功1 4 ”。 在以j 二方法中，盲吸法和荧光染色去核法应用得最为普遍。受体卵母细胞的质量是决定 克隆胚胎发育的关键因素，许多研究表明体内成熟的卵母细胞要比体外成熟的好；性成熟后 动物的卵母细胞优于初情期以前动物的卵母细胞，尤其是在支持后期发育方面。因为重组胚 的发育是由受体卵母细胞质支持的，因此在去核时应尽量少吸细胞质，一般去除的细胞质应 该在总细胞质的i ，3 以下。另外卵母细胞的卵龄也会影响去核率，成熟时间较长的老龄卵， 极体与卵细胞核中期扳相对位置相距变化大而且细胞核容易崩解，去核时往往不彻底：成 熟时间短的年轻卵，虽然第一极体与卵母细胞核位置接近，容易去除，但是卵母细胞质成熟 不理想。所以，在不同动物，卵受体成熟终止时间都有一个比较好的“窗口期”，对于牛是 体外成熟后的1 7 ，2 4 h ，对于猪则是4 2 - 4 4 h 。 3 3 核供体细胞的准备及其对核移植效果的影响 一方面，供核细胞的来源和种类会影响到核移植的效果。至今获得成活后代的有成年 乳腺上皮细胞、胎儿成纤维细胞、卵尉颗粒细胞、输卵管子宫上皮细胞、成体耳部成纤维 细胞、肌肉组织细胞、小鼠尾尖细胞、睾丸支持细胞，初乳的乳腺上皮细胞，未成熟塞托利 细胞，神经元细胞，淋巴细胞，肝脏细胞，白细胞，星形胶质细胞1 5 9 】等。这些细胞有来 自胎儿的，来自成年动物的，也有来自死亡动物的体细胞唧l ，甚至还有人利用肿瘤细胞作 供核体得到了克隆后代【6 1 i 。 而在其中使用较多的两种是皮肤成纤维细胞和卵丘颗粒细胞。成纤维细胞又是其中使 用最广泛的，因为这些细胞容易从雌性或雄性个体获得，通过标准的组织细胞培养程序形成 细胞系。而目前普遍认为卵丘，颗粒细胞的核移植效果最好，可能原因如下：( 1 ) 卵丘细胞是 自然静止于g 汨i 期的细胞；( 2 ) 卵丘细胞是包围在卵母细胞周围的细胞，在卵母细胞生长发 育过程中，卵丘细胞与卵母细胞一直存在着信息交流，核移植后二者更容易互融；( 3 ) 卵丘 细胞中端粒酶活性较高，不会由于染色体端粒变短而使细胞老化。k a t o 等在1 9 9 8 年采取屠 宰场牛卵巢卵母细胞周围的卵丘细胞，经培养传代和血清饥饿处理，核移植后共获得4 7 枚 融合胚，其中1 8 枚( 4 9 ) 发育到囊胚，将6 枚胚胎移植到3 头受体牛，出生了5 头牛犊( 8 3 ) ，这是迄今为止体细胞核移植成功率最高的一次。但是卵丘细胞的来源有限，这在一定 程度上也影响了其住核移植中的应用。 另一方面，供体细胞所处的细胞周期阶段对核移植效率也有明显的影响，这是因为供 体细胞核与受体胞质融合后，核质相互作用等过程是否协调是克隆胚胎发育至分娩的关键因 素。目前，在核移植研究中，一般选用处于g o g l 期，或处于交界点如g 2 ，m 体细胞，井已 形成了血清饥饿法，接触抑制法r o s c o v i t i n e t “i 等化学制剂处理同步化6 0 ( 3 1 期的方法：抖 4 西南_ _ = 学硕士学位论文文献综述 落法( s h a k e - o f f ) ，化学制剂处理同期到g i 期的方法：以及n o c o d a z o l e ，c o l c h i c i n e i 叫处理同 期到g 2 n v i 期的方法。此外也可直接选用处于g o 期或g d g i 期的细胞作为供核体，研究笈现： 牛、猫的成纤维细胞，卵丘细胞本身g g 1 期时间就很长。 另外供核细胞体外培养的传代次数和供核细胞移植前的处理也可影响其克隆胚的发 育。传代细胞一般囊胚发育率高，这与传6 1 2 代的细胞更易进入g d g ，期的理论吻合，但 传代次数过多，易导致染色体突变累积而降低重构胚此后的发育能力。也有学者将在7 0 c 冷藏后的体细胞用于核移植，并有报道称此法得到的重构胚卵裂率高达9 7 ，显著高丁非 冷冻体细胞核移植的卵裂率( 8 5 ) 。 3 4 核移植胚胎的构建 3 4 1 注核的方法 目前常片i 的供核细胞移植方式主要有两种：带下注射和胞质内注射。 带下注射采用特定大小的注射针吸取单个的供体细胞，并沿去按时的透明带缺口插入， 反吸一点细胞质，随后将细胞连同胞质一起注射到卵周隙内，保证供体细胞与胞质紧密的粘 在一起，便于随后的融合。在吸取供体细胞时，其细胞膜必须完整，才能融合成功。 胞质内注射一般用内径小于供体细胞的注射针反复抽吸细胞，使其质膜破损，随后吸 取处理后的体细胞，沿去核时的透明带缺口插入，直接注入到去核的卵母细胞质中。也可以 直接注入完整的体细胞，j a n g - w o nl e e 等在2 0 0 3 年用完整体细胞进行了胞质内真接注射弗 且获得了克隆猪p 1 i 。 随精子注射技术研究的进展，胞质内注核技术也不断完善，并且得到了体细胞核移植 小鼠、猪、山羊等。g o t o 等( 1 9 9 7 ) 用5 一l o p m 的注核管将直径小于2 0 b m 的供核细胞直接 注入到去核卵母细胞胞质中，其分裂率高于6 5 生下正常牛犊；但采用融合法的卵裂低 于3 0 后者分裂的主要原因是融合率低于5 0 。由此表明，当用体积较小的供体细胞 ( 2 0 r t m ) 进行核移植时，细胞直接注入法显然优于细胞融合法。研究发现，由于体细胞与 卵母细胞的体积相差很大，相容性也差，电融合构建胚胎比较困难，远低于胞质内注核法构 建的效率，所以胞质内注核在体细胞核移植研究中有被广泛应用的趋势。 3 4 2 细胞融合 细胞融合法是将细胞核移入去核的卵母细胞卵周隙后，通过胞膜融合形成卵核复合体。 细胞融合包括：化学、仙苔病毒和电融合法。用化学方法进行细胞融合对细胞有毒，且需去 掉透明带；使用仙苔病毒处理繁琐，融合率不稳定，对胚胎发育有影响，易发生污染且对 牛等动物无效。因此现在普遍使用的是电激活，因其不仅可使供体细胞与受体卵母细胞的质 膜有效的融合还可同时引起卵母细胞的孤雌激活而且电融台物理参数可精确固定，重复 性好。细胞在融合液中停留时间短，有利于胚胎的存活。电融台原理是依靠直流脉冲使细胞 西南大学硕十学位论立 文献综述 膜产生可逆性微孔，相邻细胞所接触的细胞膜形成细胞间桥进而融合。 3 5 重组胚的激活 核移胚的正常发育有赖于卵母细胞质的充分激活，低的核移胚发育率可能与卵母细胞来 充分激活有关。激活卵母细胞的原理就是降低成熟促进因子f m a t u r a t i o no rm p h a s e p r o m o t i n gf a c t o r , m p f ) 活性从而使卵母细胞脱离mi i 期。而卵母细胞内c d + 浓度的升高 可以降低细胞静止因子( c y t o s t a t i cf a c t o r , c s f ) 的活性，若c s f 的活性降低，c y c l i n b 的合成 速度就会下降而分解速度将上升引起m p f 的活性消失，导致卵母细胞分裂。所以，激活 卵母细胞过程就是卵母细胞内c d + 浓度的升高过程；要达到这个目的，可以将外源c a 2 + 导 入卵母细胞内也可刺激卵母细胞质内贮存钙的释放。激活方法可归纳为物理激活、化学激活 以及物理和化学联合激活；下面介绍几种常用的激活方法： ( 1 ) 电激活，高压电直流电场脉冲短时间作用于卵母细胞可以使卵母细胞膜上产生暂时 性的孔洞，细胞外的c d + 就可以借助这些孔洞进入细胞内，从而引起卵母细胞内c a 2 + 浓度 的升高。一次电刺激只能引起卵子中一次c e + 浓度的升高，因而核移植重组胚的激活率不 高。现今很多研究表明，为了提高卵母细胞的激活率，在电融合后再用化学试剂激活处理， 可以取得很好的激活效果，也有利于核移植胚胎的发育。 ( 2 ) 蛋白质合成抑制剂，其抑制卵母细胞中蛋白类细胞因子的合成，进而降低细胞中 m p f 和，或c s f 的活性，使卵子从mi i 期休止状态中脱离出来，恢复第二次成熟分裂。目 前常用的蛋白合成抑制剂有c h x ，嘌呤霉素，肌霉素。 ( 3 ) 6 d m a p ，是蛋白质磷酸化的抑制剂，它通过抑制p ”蛋白第1 6 1 位酪氨酸的磷酸化 而抑制m p f 的活性，同时还抑制纺锤体形成时微管蛋白的磷酸化进而抑制了极体的排趴 但6 - d m a p 对d n a 的合成没有抑制作用。6 - d m a p 单独使用对卵母细胞的激活作用较弱， 一般要与可以引起c 一+ 波动的其他激活园子( 如e h ，a 2 3 1 8 7 ，i o n 或电刺激等) 协同佧用才可 以达到充分激活【”i 。 h ) 钙离子载体 a 2 3 1 8 7 是一种钙离子载体，它主要是增加c a 2 十的跨膜转运，使细胞内c a 2 + 浓度升高而 ；l 起卵母细胞的激活。由于单一使用a 2 3 1 8 7 进行激活处理会导致卵母细胞绝大部分阻滞在 中期。同时有两个极体，所以它通常配合6 - d m a p ，c h x 或c h x + c b 来激活卵母细胞， 并能取得理想的效果8 ”。 i o n 也是一种高效的钙离子载体，它可以动员细胞的c a 2 + 释放，并触发后期的c d + 内流， 引起细胞内的c d + 升高和卵母细胞的激活。当单独使_ ji o