（临床兽医学专业论文）金丝桃素的化学合成.pdf

摘要 会丝桃素是贯叶连翘中最具有生物活性的物质之一。国内外的研究发现金丝 桃素( h y p e r i c i n ) 具有显著的抗抑郁、抑制中枢神经、抗病毒活性，也有抗肿瘤 的作用，在细胞培养中可抑制逆转录病毒的复制。另外金丝桃素还是一种有前途 的内源性光敏剂，可用于肿瘤的光化学诊断与治疗。 由于贯叶连翘中所含的金丝桃素只有万分之几，加之提取分离方法不完善， 提取分离后只能得到极少量的金丝桃素，因此应用化学合成的方法人工合成金丝 桃素有极其重要的意义。为此，本研究综合国内外的文献资料，对其化学合成路 线进行了探索，将一些合成工艺进行了必要的改进，设计出如下合成路线： 1 、2 一羟基一4 一甲基苯甲酸的合成 以丙酮和甲酸乙酯为起始原料，经过缩合反应得到第一步反应产物甲酰丙 酮。甲酰丙酮再与乙酰乙酸乙酯缩合合成目标化合物2 羟基一4 一甲基苯甲酸。 2 、2 一甲氧基一4 一甲基苯甲酸的合成 以硫酸二甲酯( c h 3 ) 2 s 0 4 作为甲基化试剂合成2 一甲氧基4 一甲基苯甲酸。 3 、2 一甲氧基一4 一甲基苯甲酰氯的合成 以甲基作为羟基保护基，用氯化亚砜或三氯化磷与2 一甲氧基一4 一甲基苯甲酸 反应制备4 一甲基水杨酰氯。 4 、】，6 ，8 - 三羟基一3 一甲基蒽醌( 大黄素) 的合成 2 一羟基一4 一甲基苯甲酰氯再与3 ，5 一二甲氧基苯甲酸甲酯通过两步 f r i e d e l c r a f t s 酰化反应得l ，6 ，8 一三羟基一3 一甲基蒽醌，即大黄素。 5 、金丝桃素的合成 1 ，6 ，8 - 三羟基一3 一甲基葸醌与催化剂氢醌、氢氧化钾等共同作用，在光照下 反应两周，得到目标化合物金丝桃素。 通过以上过程合成了两个主要的中间产物，2 羟基一4 一甲基苯甲酸和大黄素， 化合物的结构经过红外光谱( i r ) 、质谱( m s ) 和核磁共振氢谱( 1 h n m r ) 的确证。 表明本实验所设计的化学合成金丝桃素的方案有一定的可行性，为化学合成提供 了有力的依掘。 关键词：2 一羟基一4 一甲基苯甲酸：大黄素：金丝桃素：化学合成 a b s t r a c t h y p e r i c i ni s o n eo ft h em o s ti m p o r t a n ta c t i v e c o m p o n e n t so fh y p e r i c u m p e r f o r a t u ml t h es t u d yf o u n dt h a th y p e r i c i nh a v es i g n i f i c a n te f f e c to fa n t i d e p r e s s i o n ， i n h i b i t i o nc e n t r a ln e r v e a n t i c a n c e r , a n t i t u m o u r , i ta l s oc a ni n h i b i ta n t i r e t r o v i r a l r e p l i c a t i o n h y p e r i c i ni sp r o m i s i n ge n d o g e n o u sp h o t o s e n s i t i z e r ；i tc a nb eu s e d k n u b b l yd i a g n o s i sa n dt h e r a p yo f p h o t o c h e m i s t r y a sal i t t l e h y p e r i c i nc o n t a i ni nh y p e r i c u mp e r f o r a t u ml ，t h em e t h o do f e x t r a c t i o na n di s o l a t i o ni si n c o m p l e t e ，s ol i t t l eh y p e r i c i nh a sb e e ng o ta f t e re x t r a c t i o n a n di s o l a t i o n a tp r e s e n t ，b e c a u s et h em e t h o d so fe x t r a c t i o na n d c h e m o s y n t h e s i sa r ei m p e r f e c t ， t h ec o n t e n ta n dy i e l do fh y p e r i c i ni sv e r yl o wi nt h ee x t r a c t e da n dc h e m o s y n t h e s i s p r o d u c tw h i c hi sb e y o n do fr e q i r m e n tf o re x p l o i t a t i o no ft h et e r m i n a lp r o d u c t t o s o l v et h ep r o b l e m sm e n t i o n e da b o v e ，h y p e r i c i nw a se x t r a c t e da n di s o l a t e df r o m h y p e r i c u mp e r f o r a t u m l a n dh y p e r i c i nw a ss y n t h e s i z e db yt h ec h e m o s y n t h e s i si nt h e e x p e r i m e n ti th a si m p o r t a n tm e a n i n ga n dc l i n i c a lv a l u eo fa p p l i c a t i o nt h a tu s i n gt h e m e t h o do fo r g a n i cc h e m o s y n t h e s i ss y n t h e s i z e sh y p e r i c i n s ot h es t u d yc o l l i g a t e s l i t e r a t u r ed a t ei na n do u to fc o u n t r y c h e m o s y n t h e s i sr o u t ew a se x p l o r e d ；s o m e s y n t h e t i c a l l ye t h n i c sh a sb e e ni m p r o v e d s y n t h e t i c a l l yr o t u eh a sb e e nd e s i g n e da s f o l l o w s ： 1t h es y n t h e s i so f 2 - h y d r o x y - 4 - - m e t h y ib e n z o i ca c i d t h i se x p e r i m e n ta d o p t sa c e t o n ea n de t h y lf o r m a t et os y n t h e s i sf o r m y la c e t o n e 2 - h y d r o x y 一4 一m e t h y ib e n z o i ca c i dh a sb e e ns y n t h e s i z e db yf o r m y la c e t o n ea n d a c e t o a c e t i ce s t e r 2t h es y n t h e s i so f2 一m e t h o x y 一4 一m e t h y lb e n z o i ca c i d u s i n gd i m e t h y ls u l f a t ea sm e t h y lr e a g e n ts y n t h e s i z e2 - m e t h o x y - 4 - m e t h y lb e n z o i c a c i d 3t h es y n t h e s i so f2 一m e t h o x y - 4 m e t h y l b e n z o i cc h l o r i d e m e t h y l a s p r o t e c t i v eg r o u po fh y d r o x y , t h er e a g e n ts u l f o x i d ec h l o r i d e o r p h o s p h o r u s t r i c h l o r i d ea n d 2 - m e t h o x y 一4 一m e t h y l b e n z o i ca c i d s y n t h e s i z e 2 - m e t h o x y 一4 一m e t h y lb e n z o i cc h l o r i d e 4t h es y n t h e s i so fe m o d i nu s i n g2 - m e t h o x y - 4 一m e t h y l b e n z o i cc h l o r i d ea n d3 ， 5 - d i m e t h o x y b e n z o a t ea sr e a g e n tb yt w os t e pf r i e d e l - c r a f t sa c y l a t i o ns y n t h e s i z e e m o d i n 5t h es y n t h e s i so fh y p e r i c i n e m o d i na n dc a t a l y s th y d r o q u i n o n ea n dp o t a s s i u mh y d r o x i d ew i t hi l l u m i n a t i o n r e s p o n s et w ow e e k s ，t h eu l t i m a t ep r o d u c ti sh y p e r i c i n t w om o s t l yi n t e r m e d i a t ep r o d u c t sw e r es y n t h e s i z e d ；2 - h y d r o x y - 4 - m e t h y lb e n z o i c a c i da n de m o d i n ，t h ec o n f i g u r a t i o no fc o m p o u n dw e r ec o n f i r m e db yi n f r a r e d s p e c t r u m ，m a s ss p e c t r u m sa n dn u c l e a rm a g n e t i cr e s o n a n c e i tw a sc o n c l u d e df r o mt h e r e s u l t t h a tt h es c h e m et h a ts y n t h e s i z e dh y p e r i c i nw i t l lc h e m i c a lm e t h o dc a no f f e r g u i d a n c ef o rc h e m o s y n t h e s i so f h y p e r i c i n k e y w o r d s2 - h y d r o x y 一4 一m e t h y lb e n z o i ca c i d ： e m o d i n h y p e r i c i n ；c h e m o s y n t h e s i s 第一部分文献综述 金丝桃素研究进展 金丝桃素( h y p e r i c i n ) 是贯叶连翘( h y p e r i c u mp e r f o r a t u ml ) 中最具有生物 活性的物质，金丝桃素除了存在于贯叶连翘中外，还广泛分布于金丝桃属其它植 物中。金丝桃素茸次由d i e t r i c h 于1 8 9 1 年分离得到，1 9 11 年s c z e r n y 命名为 “h y p e r i c i n ”，为蓝黑色针状结晶体，1 9 5 7 年b r o c k m a n n 从贯叶连翘和h i r s u t u m 中首次分离得到金丝桃素，并完成了全合成工作。分解点3 2 06 c ，易溶于毗啶或 其它有机胺类，呈橙红色并带红色荧光，不溶于多数有机溶剂中”“1 ，可溶于碱 性水溶液，在p h 低于1 1 5 时呈红色溶液，p h 高于1 1 5 时为绿色溶液而带红色 荧光。”。金丝桃素( h y p e r i c i n ) 的化学式为4 ，47 ，5 ，5 ，7 ，77 一六羟基一2 ，2 一二甲基一中位一蒙骈二蒽酮。 近年来国外的研究表明，会丝桃素具有抗抑郁、镇静、抗菌消炎、光动力活 性、抗肿瘤、抗病毒等药理活性。尤其是抗病毒作用突出，能抗d n a ，r n a 病毒。 金丝桃素还是一种有效的光敏剂，在光动力学治疗中表现出强的诱导肿瘤细胞凋 亡的活性o 。在德国，金丝桃素己与蛋白结合，用于治疗艾滋病及甲、乙型肝 炎”。；用作抗抑郁药已有百余年历史。 m e r u e o 等”报道了会丝桃素具有抗逆转录瘸毒( 包括抗人类免疫缺陷病毒 h i v ) 的作用。近年国外已完成金丝桃素抗艾滋病的i i 期临床。1 。治疗恶性神经 胶质瘤的临床研究也在进行中。除贯叶连翘外，金丝桃素广泛分布于金丝桃属 e u h y p e r i c i m 组其他植物和c a m p y l o p o r u s 组植物中( k e l l e r 分类法) “。：也 存在于金丝桃组( s e c t t a e n i o c a r p i u m ) 和糙枝金丝桃组( s e c t h r i t e l l a ) 植 物中。王兆金等首次报道在黄海棠中含有金丝桃素“。z e v a k o v a 用h p l c 研究 表明7 种金丝桃素植物中含有4 1 0 4 6 5 1 0 i 的金丝桃素“。另外在小连翘、 毛金丝桃h h i r s u t u ml i n n 、糙枝会丝桃h s c a b r u ml i n n 等植物也发现含有金 丝桃素。由于会丝桃素的多种药理作用，成为近年来世界最畅销的中草药，也使 其成为当前国际研究u 开发的热点课题之。 目前，我国对金丝桃素的研究应用还不多，为使广大研究者更好地综合开发， 利用金丝桃素，本文将最近几年国内外对金丝桃素的研究进展情况综述如下： l 金丝桃素的化学结构与理化性质 金丝桃素是一种萘骈二蒽酮类化合物“， 1 9 5 1 年确定其化学式为4 ，4 ， 5 ，5 ，7 t7 一六羟基一2 ，2 二甲基一中位萘骈二葸酮，分子式为c ：，o h 0 ， 分子量为5 0 4 4 3 。其化学结构为： h 3 c h a c o h o h o ho h o 金丝桃素为蓝黑色针状结晶体，分解点3 2 0 。c ，易溶于毗啶或其它有机胺类， 呈橙红色并带红色荧光，不溶于多数有机溶剂中，可溶于碱性水溶液，在p h 低 于儿5 时呈红色溶液，p h 高于1 1 5 时为绿色溶液而带红色荧光。 2 金丝桃素的化学合成 目前在国外已经有许多关于会丝桃素合成路线的报道，其中有以大黄素作为 起始原料，氢醌作催化剂，在通氮气并且光照的条件下反应两周，大黄素被直接 转化成金丝桃素，反应的过程如下： o 0 h o h - , h y d m e i n o n e 也有研究报道以大黄素为原料与s n c l 。2 h ：0 作用后，先反应转化成大黄素蒽酮， 然后以大黄素葸酮为反应物与吡啶哌啶、氮氧吡啶、f e s 0 。7 h 。0 、氮气共同反 应，最终转化成金丝桃素。反应过程如下： h o c h ，c o o h c h 3 s n c l 2 2 h 2 0 加热 o h 3 辨 吡啶以畈啶 c h 3 f e s 0 4 - r d 2 氲氧吡啶 c 坞 c 鸭 o ho o h 3 金丝桃素的含量及测定方法 3 1 金丝桃素的含量 金丝桃素的含量随贯叶连翘的生长时期、季节、地域以及贯叶连翘植物体腺 体密度的不同而不同，通过测定多种不同地区不同生长期的贯叶连翘，发现其中 金丝桃素的含量从0 0 3 0 3 8 不等“。”。金丝桃素含量最高时期是发芽期 和开花期，尤其是在种植第二年开花的时期”。金丝桃素一般聚集在贯叶连翘的 花、叶、茎的分泌细胞内。“”1 。所以在贯叶连翘盛花期进行采收，收割包括花、 上部茎、叶和侧枝( 大约是顶部l o 3 0 c m 部位) 。若连主茎及下部叶全部采集， 则主要成分相对含量将明显下降。由于贯叶连翘主要成分光敏性强，能使眼睑和 前额发泡，所以采收时必须十分小心，最好戴手套，避免眼和外露的皮肤与植物接 触。在光的作用下，原金丝桃素和原伪金丝桃素可以转化为金丝桃素，在贯叶连翘 的花瓣中有大约3 0 的金丝桃素以原伪金丝桃素和原金丝桃素形式存在，而芽和 叶中分别有4 8 、1 7 ，将芽在太阳光下照射1 6h ，则有1 6 转化为金丝桃素”“。 氮对金丝桃素的含量也具很大影响。在沙地中低氮条件下，可以增加金丝桃素的 含量，在土壤中低氮条件则降低其含量。通过调查研究还发现，甘露聚糖可以刺激 金丝桃素的生长o 。 3 2 金丝桃素的测定方法 3 2 1 高效液相色谱法 高效液相色谱法( h p l c ) 是测定贯叶连翘中金丝桃素的含量使用最多的方法 。“”。“1 。色谱条件为色谱柱：o d s ( 4 6 x 2 0 0 m m ) ，流动相：甲醇一乙腈一0 1 m o l l - l 磷酸二氢钠缓冲液( 4 0 0 ：1 0 0 ：1 0 0 ) ；流速：i m l m i n ；检测波长：5 8 8 n m r a n g e 0 0 5 a u f s ：进样量：1 0ul ：金丝桃素保留时间1 l m i n 。取不同浓度的金丝桃素对照 品溶液进样，以峰面积对进样量绘制标准曲线，得回归方程为 y - 3 8 7 0 7 x 一8 8 0 4 。= 0 9 9 9 1 1 。此方法灵敏快速、简单准确，重现性好。通过测定发 现，贯叶连翘中花、叶内金丝桃素含量大于根、茎中的含量，尤其花中金丝桃素含 量最高。 3 2 2 紫外可见光谱测试法 采用紫外可见光谱测试，金丝桃素在5 8 9 n m 处有最大吸收为其特征锋，以浓 度为横坐标，吸光度( a ) 为纵坐标，绘制金丝桃素的标准啦线。得回归方程为 y = 2 1 4 1 2 x 一0 0 1 4 3 r = 0 9 9 7 6 。”3 ，表明该方法精密度较好，回收率高，供试品溶液较 为稳定，可作为金丝桃素的检测方法之一。 3 2 3 其他方法 薄层色谱法：薄层色谱法测定贯叶连翘中金丝桃素的含量。，用水、甲醇、 乙醇作溶剂，检测波长为2 5 4 n m 。 差示脉冲极谱法：溶剂选用磷酸盐缓冲溶液一甲醇( p i t = 6 0 ) ，在e p 为一1 0 2 v 处出现波峰“。 双波长分光光度法：以测定波长为5 8 9 n m ，参比波长为6 4 7 n m 进行组合，甲醇 为空白溶液。以金丝桃素对照品溶液浓度为横坐标，a x6 4 7 x5 8 9 为纵坐标 制得金丝桃素标准曲线。其回归方程为a 6 4 7 5 8 9 = 0 0 0 5 + o 0 0 4 8 7 c ，r = o 9 9 9 8 ”3 。该方法简单易行，结果较为准确，可排除大部分干扰测定 克服目前应用单波长分光光度法抗干扰能力差的缺点。不足之处在于二阶导数光 谱处理后，所需信息量大大减少，使测定相对误差增大。 高效液相色谱一荧光检测法：色谱条件为色谱柱：c 1 8 ( 5 1 1m 4 6 x2 0 0 m m ) ， 流动相：甲醇一p h 6 5 的磷酸盐缓冲液( 5 5 ：4 5 ) ，流速：1 o m l m i n 一1 ，柱温：3 04 c ， 荧光检测波长： e x = 5 8 0 n m ，xe m = b o o n m 。该方法的线性范围为2 5 5 1 0 2 n g ，回 归方程为y = 1 9 5 3 x + 3 0 8 2 r = o 9 9 9 9 。“3 。平均加样回收率为1 0 1 1 ，r s d 为1 4 。 方法快速，简单，灵敏度高。由于金丝桃素为强酸性。p h 对荧光强度有较大影响， 测定时宣选取p h 为6 5 的溶液，此时灵敏度高，峰型好。 4 金丝桃素的提取与分离 i n ； i - 有关金丝桃素的提取方法的研究是在8 0 年代开始进行的，国内对贯叶 连翘的研究主要集中在金丝桃素的药理方面，而对会丝桃素提取分离方法的研 究工作进行的较晚，直到上世纪9 0 年代末才有报道。目前，国内现行的方法大 部分停留在金丝桃素的提取方法上，而对其分离、纯化的方法研究的较少。 由于贯叶连翘全草中所含的金丝桃素只有万分之几，只有通过化学手段对其 进行提取和精制，爿能使贯叶连翘提取物中金丝桃素的含量达到国际市场上的大 于0 3 的要求标准。国内外对其提取的方法有以下几种： 4 1 乙醇提取法 用乙醇作溶剂从贯叶连翘中提取金丝桃素是一种比较常用的方法。通过多 次实验发现，用乙醇法提取贯叶连翘中的金丝桃素时，提取溶剂用量，提取温度， 提取时间和提取溶剂浓度对贯叶连翘提取物的提取率和提取物中金丝桃素的含 量影响显著。王晓菊等人用不同浓度的乙醇作为提取溶剂得到结果如表一： 表一不同洗脱剂洗脱产物的金丝桃素含量 洗脱剂提出物的量( g )金丝桃素质量百分含量( ) 4 0 乙醇 1 8 l o o 0 7 6 0 乙醇 1 7 22 3 0 8 0 乙醇 3 2 81 8 5 9 0 乙醇 4 9 3o 4 5 由表1 可以看出用不同浓度的乙醇溶液进行洗脱，4 0 乙醇洗脱物中金丝桃 素含量非常少，可除去原料中的大量杂质，6 0 乙醇及8 0 乙醇洗脱物中金丝桃素 含量较大，9 0 乙醇洗脱物中金丝桃索含量又减少，且杂质含量增大。通过上述研 究结果表明，溶剂以8 0 乙醇、温度以8 0 。c 为宜，提取时间最佳为2h ，这样的条 件下提取率最高“1 。但此方法存在产品易吸湿，发粘的缺点，因此需要对该方法 进行改进。温普红”等对金丝桃素的醇法提取工艺进行了研究和改进，研制出了 价廉、无毒、新型的w x 除杂剂。由于该除杂剂的使用，使导致吸湿发粘的杂质 如糖类、叶绿素等较彻底地除去，使生产工序大为简化，只需经过提取w x 除杂、 调p h 、沉降三步，即可得到合格的产品。所得产品在空气中长期暴露仍保持粉 末状，不会发粘结块，而且提高了金丝桃素的相对含量( 含量为0 7 0 9 ) ，大大超 过了国际市场对金丝桃素含量大于0 3 的要求。消除了原料中金丝桃素含量高 低对产品质量的影响，但该实验中仅以金丝桃素含量为指标，没有收率的相关指 标，并且尚未报道w x 除杂剂的组成和成分。该实验在调p h 值沉降过程中，发 现( 1 ) p h 值越低，产品析出的速度越快，但产品中金丝桃素的含量相对降低。 ( 2 ) 金丝桃素的析出酸度比黄酮类等其它物质的析出酸度低，析出速度也比其 它物质快。因此，通过控制溶液的p h 值及沉降时间，可以调节产品中金丝桃素 的含量。但此方法析出金丝桃素时，在酸化的提取液中将会残留一定量的金丝桃 素，造成金丝桃素的析出不完全，由于金丝桃素在贯叶连翘中含量极低，提取费 时费力，应尽量减少提纯过程中的流失。实验分别采用甲醇和乙醇作为提取剂， 进行比较实验。结果表明：用乙醇作提取剂时，所得产品中金丝桃素的含量较高； 但提取温度比甲醇时高，乙醇的价格也较贵。考虑到甲醇的毒性，用乙醇作提取 剂较为适直。 4 2 碱液提取法 金丝祧素的碱液提驳法是近几年才研究提出的。李俊1 等通过多次实验，确 定最佳工艺为：称取一定量干燥粉碎的贯叶连翘全草，用3 0 倍原料重的i n a o h 溶液在9 5 1 0 0 沸腾状态下浸提2 h ，提取3 次，集中滤液，用0 1 m o l lh c l 溶液 中和滤液至p h ：3 ，真空浓缩干燥即得产品。此工艺的原料重量比、温度、提取时 间、溶剂浓度是通过多次正交设计实验得出的，在此条件下，提取物中金丝桃素含 量最高，为大规模生产提供了理论依据。 谈曾毅等m 1 通过采用碱溶液对贯叶连翘药材保温发酵，具体方法是：取干药 材1 0 0 0 9 ，用剪刀剪成2 c m 长短，用7 0 8 0 。c n a o h 溶液( 0 2 m o l ) 迅速拌润， 装入塑料袋中，立即用棉絮包裹，保温发酵5 d 后，整个草药变为黑色腐烂状，此 时，加入甲醇一丙酮( 7 ：3 ) 6 0 0 0 m l ，5 0 。c 温浸1 2 h ，过滤，如此温浸3 次，合 并滤液，6 0 减压浓缩，回收溶剂，6 0 。c 真空干燥，得干浸膏粉8 6 4 9 。做出的 干浸膏中金丝桃素的含量与浸膏对照品基本一致，含量约为0 3 。收率为8 6 4 。 他采用多种溶剂提取，进行对照实验，或加水后润湿提取，或加碱液提取，均不 能使金丝桃素的含量达到满意的结果，只有加氢氧化钠碱溶液保温发酵后，方能 达到最佳的效果。 4 3 其它方法 李翠芹等“”提取分离金丝桃素的方法是以会丝桃素含量和干品得率为指标， 采用f 交试验法研究了从贯叶连翘中提取金丝桃素的工艺，经过综合考虑各种因 素，结果表明较佳的提取工艺为：4 5 。c 的水浸泡2h 后，加入0 5 n a o h ，7 5 甲 醇，0 0 5 m p a ，7 8 。c 提取5 次，每次1 5 小时，溶媒量5 倍，浓缩和干燥温度7 8 。最终提取物中金丝桃素含量大大提高”“。 吴迎春“”等对太白产贯叶连翘进行化学成分分析时，依次用体积百分数9 5 和6 0 乙醇回流提取，减压浓缩乙醇提取液为浸膏，用热水悬浮浸膏，再用乙酸 乙酯和正丁醇萃取，乙酸乙酯部分经硅胶柱反复层析和重结晶，即得到有一化合 物为黑色粉末状晶体( 吡啶一含盐酸甲醇溶液重结晶) ，经过结构鉴定，确定该化 合物为金丝桃素。 国外已在8 0 年代对提取金丝桃素的工艺进行了研究。美国专利报道，提取 工艺采用丙酮提取，硅胶柱精制“。“。 5 金丝桃素的药理作用及临床应用 5 1 抗抑郁 2 0 0 0 年，美国研究者b r e n n e r 等人用会丝桃素浸膏制剂与斯托宁作对照试验 ”，以两种药物治疗3 0 位轻、中度抑郁症患者，进行双盲、随机研究，临床用药 一周后，所用制剂中金丝桃素日剂量为2 7 m g ，结果表明金丝桃制剂疗效与斯托 宁相当，甚至优于斯托宁。最近德国与美国的研究者报道了以金丝桃制剂( 经金 丝桃素含量标化) 治疗1 7 5 7 个轻、中度至严重抑郁症患者的2 3 次随机、双盲、 对照试验m e t a 一分析。临床用药为单独的贯叶金丝桃制剂，对照组为安慰剂或标 准抗抑郁药。2 3 次实验中的2 0 次为双盲法，i 次为单盲法，2 次为公开实验。 大多数病人治疗4 8 周，所用制剂中金丝桃素及总提取物同剂量分别为0 4 2 7 m g 和3 0 0 1 0 0 0 m g 。结果表明金丝桃明显优于安慰剂，其疗效与标准抗抑郁药 马普替林、丙咪嗪、阿米替林相当。荷兰研究者d es m e t 认为以上数据可以接受， 但会丝桃素作为有效的抗抑郁剂，理由还不充分，采用的制剂必须标准化，而且要 选择严重的抑郁症患者，并进行长期的治疗，以评价复发的危险及长期用药的副 作用。临床观察中发现，未经纯化的金丝桃制剂，其疗效优于金丝桃素纯品，有些 研究者还发现金丝桃素抑制m a o 最强的部位含有的黄酮类化合物的浓度最高，贯 叶连翘中黄酮类化合物的结构与m a o 抑制剂类抗抑郁药( t o l o xt o n e ) 和溴法罗 明( b r o f a r o mi n e ) 相似，所以认为金丝桃制剂抗抑郁功效是其中总金丝桃素和总 黄酮等化合物协同作用的结果。金丝桃素的作用机制可能是多位点，并且与余丝 桃素以及其他临床上常用的抗抑郁化学合成药物不同。它通过m a o i 机制起作用。 5 2 抗病毒作用 近年发现贯叶连翘中所含金丝桃素( h y ) 对多种逆转病毒( 包括h i v ) ，包 膜病毒有一定的抗病毒作用，引起a f t 的高度重视。国外丌发金丝桃素抗病毒剂 专利，令世人瞩目”。艾滋病( a i d s ) 是威胁人类健康的顽症，引起a i d s 的主要原 因是h i v 。1 9 8 8 年，m e r n e l 等报道了会丝桃素抗逆转录酶的作用。在体外，金 丝桃素能抑制包括h i v 在内的多种包膜病毒。美国研究人员采用口服金丝桃素 的方式，对3 0 例艾滋病感染者进行临床观察，患者每天口服0 5 m g k g ( 体重) 金 丝桃素，其中1 6 人c d 值保持稳定或有所上升，表明免疫状况好转。美国学者近 年还进行了治疗艾滋病i 期临床，考查了金丝桃素在抗h i v 活性的剂量下能否保 证安全等问题。因此，金丝桃素抗h i v 感染作用尚需进一步临床研究。根据d e c l e r c q “”的观点，破坏h i v 的复制循环有1 0 个攻击目标，包括吸附、融合、脱 壳、反转录、整合、d n a 复制、转录、翻译，装配和释放。金丝桃素不影响病毒 的转录和翻译而是干扰病毒的装配与释放“。另外，h i v i c d n a 整合作用离体实 验“”表明，金丝桃素可抑制从h i v 感染细胞中分离的熬合酶。因而金丝桃素可能 也影响病毒的整合作用。还有一些报道认为金丝桃素的抗h i v 活性是由于对单氧 介导的病毒膜蛋白的交联以及合胞体的形成。 f r i e n d 病毒( f r i e n dl e u k e m i av i r u s ，f v ) 为一侵染性逆转录病毒，可引 起动物急性感染，使敏感的b a i b 小鼠脾脏迅速增大，并导致急性红白血病。金丝 桃素对感染f r i e n d 白血病病毒的小鼠有治疗作用，每只小鼠用i 0 5 0 金丝桃 素，可延长感染小鼠的寿命；5 0 金丝桃素，可抑制感染小鼠脾脏重量的增加， 并有抑制病毒复制的作用。l p b m 。病毒( 鼠白血病病毒) 可引起鼠艾滋病( a i d s ) 。 鼠感染后可出现类似h i v 感染的早期症状。小鼠接种l p b m - 病毒21 d 后可出现 病毒血。当鼠接种病毒后第2 周开始腹腔注射金丝桃素，每2 周注射一次，则至少 在9 0 d 内可防止病毒产生，并可明显改善l p b m 。诱发的淋巴增值，长时间阳_ 隔治 疗有明显效果“。 金丝桃素对逆转录病毒的作用可归纳为：1 干扰病毒的侵染和传播，阻止病 毒在细胞上脱壳，发芽和装配，达到直接使成熟的和正常装配的病毒灭活；2 可有效的抑制病毒释放逆转录酶( r t ) ，但对r t 无直接作用；3 不能抑制病毒蛋 白转录，转译与转运至细胞膜；4 可直接干扰聚蛋白前体的编码；5 小鼠给予低 剂量的金丝桃素可防治逆转录病毒诱发的疾病，且无副作用。 研究发现金丝桃素对鼠巨噬细胞中的自细胞素i l 1 2 有抑制作用1 抑制 i l1 2 所需金丝桃素浓度为1 4 5ug m l ，若在荧光照射下活性更大。金丝桃素的 抗病毒与其光敏活性有很大关系。光照条件下，金丝桃素吸收光子，然后激发单线 态氧，释放能量。产生的单线态氧进而破坏细胞膜，干扰蛋白质和核酸。这一反应 机制的必要条件是光照、氧、光敏色素。p a r k 等人”。1 研究了氧在该机制中的重 要作用，发现氧浓度下降时金丝桃素抗病毒活性急剧下降，但低氧条件下仍有较 低活性，这可能是由于金丝桃素分子在激发态释放出质子，增强了活化氧粒子 ( r o s ) 的活性。尽管如此，氧仍是金丝桃素抗病毒活性的一个重要条件。 5 3 抗癌或抗肿瘤作用 利用金丝桃素治疗肿瘤，一般需使用光动治疗( p d t ) “”，也称光化学治疗 ( p c t ) ，这种治疗方法是指对人体施用可定位于肿瘤细胞的光敏物质金丝桃素，然 后以一定波长的光局部照射激活金丝桃素，引发一系列的光化学和光生物学进程 导致肿瘤细胞的不可逆的光损伤。c a r s o n 等”用金丝桃素治疗胰腺癌取得了良 好效果。金丝桃素的光动治疗法可以治疗膀胱癌“、淋巴癌“”、前列腺癌。“、 基体细胞癌m 3 、喉癌”等，还可以治疗各种肿瘤、甚至脑瘤。a n k e r 等m 1 研究 了从贯叶金丝桃浸膏精制的金丝桃素对慢性人神经胶质瘤细胞和原发性人神经 胶质细胞系的作用，发现当金丝桃素的浓度为5 0 u g m l 时，能明显抑制培养基中 瘤细胞生长在进行的复发性神经胶质瘤i 期临床实验中，采用的剂量是 0 5 u g m l ，较抗病毒剂量低，较抗抑郁剂量高。 金丝桃素光激发后，在激发态发生分子内质子转移和质子释放，可使溶剂酸 化，降低细胞内p h 水平，这一过程可能参与金丝桃素的抗癌作用“。深入了解 金丝桃素的抗癌机制还须研究其在组织细胞水平的分布、作用位点和亚细胞水 平的攻击目标。金丝桃素有荧光，可由显微荧光观察推测它在细胞内的分布。短 期培养时，金丝桃素主要集中在膜上；长期培养后，金丝桃素可到达细胞质和细 胞核，核内有明显吸收”。另有报道”，金丝桃索主要分布在细胞核周围的细胞 质中，细胞核无明显吸收。观察结果并不一致，这与不同的实验条件有关，也受 显微荧光观察本身的局限性影响。荧光发射随光敏物质在细胞内不同的分布位置 改变，因而不能准确地反映光损伤发生位点。由于细胞毒性产物单线态氧形成后 9 的位移距离小于00 2 m ，光损伤的位置可间接反映光敏物质受激发时的分布， 许多研究者转而研究盒丝桃素亚细胞水平的光损伤位点。 余丝桃素可直接引起癌细胞程序性死亡“，并伴随有细胞色素c 由线粒体向 细胞质释放“1 。另有报道，l t 岫o l l 光活化的金丝桃素可导致细胞总a t p 水平 和线粒体呼吸功能显著而不可逆的下降，提出线粒体可能是金丝桃素细胞光损伤 的主要攻击目标：“。 5 4 金丝桃素的光动力学疗法( p d f ) 5 4 1 金丝桃素的光敏性： 金丝桃素是最有效的光敏剂之一，具有很大的三线态量子产额( q u a n t u m y i e l d ) ，并能有效地产生单线态氧”“。体外实验表明金丝桃素可以抑制蛋白激酶 c ( p k c ) 、上皮生长因子受体、酪氨酸激酶活性，并且具有琥珀酸氧化酶的活性。 金丝桃素的光敏作用可使呼吸控制比率和线粒体膜电势( v m ) 下降。“。av m 降低，目前被认为是细胞凋亡早期阶段的特征性表现：细胞皱缩、细胞核裂解、d n a 片段化。此作用可能与线粒体通透性改变导致氧化磷酸化的解偶联以及产生超氧 阴离子有关，因此线粒体可能是金丝桃素的重要靶标，并与其抗肿瘤活性有关”3 1 。 一项对接种r i f l 肿瘤的c 3 h 小鼠的研究发现，会丝桃素在光照条件下给药0 5 h 后主要分布在肿瘤血管中；而在无光照情况下，6 h 后肿瘤细胞中药物浓度达到最 大，但在血管中荧光微弱，由此说明血管损伤也是金丝桃素诱导的p d t 抗肿瘤的 重要途径”“。 5 4 2 金丝桃素的细胞毒作用 p d t 可以快速清除肿瘤细胞，在肿瘤活组织检查中发现，存在细胞凋亡与坏 死区域。光敏剂诱导细胞凋亡和坏死的效价与细胞类型、光敏剂浓度、亚细胞定 位、光照强度等因素有关”。光敏剂的亚细胞定位决定了光损害的细胞内位点， 是影响细胞死亡的关键因素。h e l a 细胞能高度富集金丝桃素，并对光诱导产生的 细胞毒作用有良好的反应性。对癌细胞的检查发现金丝桃素位于细胞核周围，很 可能分布在内质网与高尔基体内。这种亚细胞分布可在金丝桃素与癌细胞共同孵 育3 0 m i n 内达到，并且不受细胞外金丝桃素的浓度和随后的光照条件的影响。增 加金丝桃素浓度，肿瘤细胞由凋亡转变为坏死。浓度在8 0 2 5 0 n m o l l 光激活的 金丝桃素引起的细胞死亡，几乎都是由于诱导细胞凋亡引起的。在光照条件下， 增加金丝桃素的浓度达到1pm o l l 时可产生细胞坏死。采用1 2 5 n m o l l 的余丝 桃素进行p d t ，光照后很快就产生凋亡的特征性形态改变。需要强调的是，在这个 过程中细胞死亡严格地依赖光照，因为在没有光照的条件下金丝桃素的浓度即使 达到1 0l am o l l ，与对照组比较都没有显著性差异。细胞内a t p 的水平是决定细 胞死亡的关键因素。11 1m o l l 光激活的金丝桃素还能导致细胞总a t p 水平和线 粒体呼吸功能显著不可逆地下降，当细胞a t p 耗竭达到临界值时凋亡信号可以转 变为坏死信号”。金丝桃素在p d t 中促进细胞凋亡并不伴随主要的炎症反应，但 是否可以将其作为治疗优势还需进一步探讨。 5 4 3 金丝桃索p d t 诱导细胞凋亡 天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶c a s p a s e s 介导了濒死细胞中高度特异的蛋 白裂解活动，集中体现了细胞凋亡的表型。c a s p a s e s 按结构和功能可分为上游 起始c a s p a s e s 和下游效应c a s p a s e s 。一旦被激活，起始e a s p a s e s 即转活化其 他的c a s p a s e s 酶原，引起级联反应。c a s p a s e s 信号级联反应的发生主要通过2 种机制实现，即死亡受体介导的信号系统和线粒体调节的途径。 p a r p p o l y ( a d p r i b o s e ) p o l ym e r a s e 是效应c a s p a s e 一3 和c a s p a s e 一7 的细胞核 底物之一，p a r p 的断裂被作为细胞凋亡程序执行的标志。引起细胞凋亡浓度的光 激活金丝桃素可以诱导p a r p 断裂成凋亡特征性的片断。z v a d f m k 是广谱的 c a s p a s e 抑制剂，z d e v d f m k 是c a s p a s e 一3 的专属抑制剂，在给予光照之前均能有 效地阻断凋亡状态下p a r p 的断裂。两者都能有效地拮抗金丝桃素诱导的凋亡， 特别是z d e - v d f m k 能阻止膜空泡的形成。s e r p i n 类似物的抑制剂c r m a ( 优先作 用于c a s p a s e 一1 和一8 ) 在h e l a 细胞中的过量表达不能保护由金丝桃素诱导的细胞 凋亡。由于c r m a 的过量表达能有效的阻断t n f 和f a s 在此细胞系中诱导的细胞 凋亡。认为金丝桃素诱导的凋亡不依赖于t n f r 1 和f a s 介导的c a s p a s e 信号通路 ”“。使用单克隆抗体f a s ( s m l 2 3 ) ，f a s l ( n o k 一2 ) ，t n f r 1 ( m a b 2 2 5 ) 和多克隆兔抗 人t r a i l ( t n f r e l a t e da p o p t o s i s i n d u c i n gl i g a n d ) 抗血清对死亡受体的分析 结果表明，t r a i l 抗体能阻断t r a i l 与会丝桃素诱导的j u r k a t 细胞凋亡；而 s m l 2 3 和n o k 一2 抗体不能阻断金丝桃素诱导的凋亡，m a b 2 2 5 无效，说明金丝桃素 诱导的细胞凋亡部分地通过t r a i l t r a i l 一受体系统和对上游的c a s p a s e 的激活 而起作用 t x o 会丝桃素在j u r k a t 细胞中诱导的细胞凋亡与c a s p a s e 一8 的激活作 用有关，能被c a s p a s e 一8 抑制剂2 - i e t d f m k 所阻断。因为c a s p a s e 一8 是细胞死亡 受体的上游起始c a s p a s e ，因此认为t n f 受体家族可能参与金丝桃素诱导的细胞 凋亡。a l i 等在研究金丝桃素对鼻咽癌细胞的p d t 中发现其能诱导死亡受体所介 导的细胞凋亡。金丝桃素p d t 的这种只对某些类型细胞( 如j u r k a t ) 诱导 c a sp a s e 一8 酶原的激活，而对其他细胞无此作用的性质，可能与其是否能产生有 功能的死亡诱导信号复合物( d i s c ) 有关”。因此需进一步对多种类型的细胞进行 研究，以证明金丝桃素p u t 诱导的细胞凋亡与死亡受体介导的通路有关。 5 4 4 抗凋亡j n k p 3 8 m a p k 信号通路 由于线粒体激活的蛋白激酶m a p k 信号通路在决定细胞死亡过程中起重要作 用，p a t r i z i a 3 研究了金丝桃素的光敏活性对m a p k 家族成员：细胞外信号调节激 酶e r k 、c j u n n 一末端激酶i n k l 和p 3 8 m a p k 激酶的作用，发现引起凋亡浓度的金 丝桃素能快速持续性的激活j n k l 和p 3 8 m a p k ，而严重抑制基础水平的e r k 2 的活 性：而未被光激活的金丝桃素对此2 种激酶均无作用。在h e l a 细胞中观察p d t 对于m a p k 活性的影响，可认为是余丝桃素治疗作用在细胞水平上的反映。使用光 敏剂苯卧啉衍生物b p d 进行p d t 表现出诱导j n k l 和p 3 8 m a p k 的活性，并且这些应 激激酶的活性能被加入抗氧剂如n - 乙酰半胱氨酸所反转，提