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重庆医科大学硕士研究生学位论文 纳米复合材料的合成与电化学生物传感器 摘要 目的： 1 首次合成了一种金胶一纳米管羟基磷灰石复合材料，由于具有 独特的多吸附位点和良好的导电性，该复合材料可作为一种新型的电 子传递促进剂用于血红蛋白的直接电化学研究。 2 探讨了金胶和纳米管羟基磷灰石不同的混合比例对形成复合材 料电子传递速率的影响，并用电子扫描显微镜观察了该复合材料的表 面形貌。 3 分别考察了不同的扫描速率和不同p h 值的缓冲溶液对血红蛋 白金胶一纳米管羟基磷灰石复合材料修饰电极的峰电位及峰电流的 影响。 4 研究血红蛋白金胶一纳米管羟基磷灰石复合材料修饰电极的 电化学行为以及探讨了对过氧化氢的电催化能力。 方法： 1 超声处理氢氧化钙悬浊液，并逐渐加入磷酸，保持环境温度在 6 0 。c ，溶液p h7 0 条件下进行。产物陈化、洗绦、过滤、离心后，在真 空1 0 0 。c 条件下干燥即得纳米管h a p 粉末。柠檬酸钠和h a u c l 4 溶液 的混合物恒沸1 5m i n 后即得到酒红色的胶体金溶液。最后将h a p 粉末 溶入金胶溶液混合，恒频率超声，得到了金胶一纳米管羟基磷灰石复 ， 重庆医科大学硕士研究生学位论文 合材料。 2 分别将h b ，g n p s h a p ，h b g n p s 。h a p 溶液放入微量比色皿中， 用u v v s i 3 6 0 0 n i r 分光光度计，得到紫外可见吸收光谱图。分别用 h b g n p s h a p 、h b h a p 、h b g n p s 、g n p s h a p 修饰玻碳电极，在 p h7 0 ，o 1 m o l l 的p b s 中得到了不同修饰电极的循环伏安图。 3 将修饰电极放在不同p h 值的p b s 缓冲溶液中进行扫循环伏安， 从电流值的响应中寻找最佳p h 值。在最佳p h 值的条件下研究不同扫 速对电流的关系。 4 配制一系列不同浓度的过氧化氢溶液，在3 7 2m v 工作电位下， 探讨了h b g n p s h a p g c e 在p h7 0 ，o 1 m o l l 的p b s 中对h 2 0 2 的电 催化能力。 结果： 1 考虑到复合膜的固定性和对电子传递速率的影响，最终选择金 胶和羟基磷灰石两者最优混合比例为l ：1 。运用电子扫描显微镜( s e m ) 对g n p s h a p 复合膜进行表征，可以看到金胶能够很好的被吸附在呈现 不同长度的管状结构的纳米管羟基磷灰石表面，并形成均匀、多孔的 表面形貌，有利于血红蛋白的镶嵌。 2 从紫外一可见吸收光谱中可以看到，溶解在h a p 和g n p s h a p 溶液中的血红蛋白在4 0 5 7 8n l n 处有明显的吸收带，说明了h a p 和 g n - p s h a p 所提供的微环境能够使h b 保持良好的生物活性和趋向性。 从h b g n p s h a p 、h b h a p 、h b g n p s 、g n p s - h a p 修饰玻碳电极 得到的循环伏安图中可以看到：h a p 和g n p s 之间并不是简单的加和 作用，而是正协同效应。 重庆医科大学硕士研究生学位论文 3 随着缓冲溶液p h 值的变化，血红蛋白的循环伏安峰电流和峰 电位也呈现可逆的变化，其氧化还原峰的式量电位与p h 成线性关系， 斜率为一5 1 m vp h ，说明该电极反应是一质子一电子参与的过程。当 循环伏安扫速在1 0 - - 1 0 0 0m w s 范围内时，扫描速率与阴极和阳极峰 电流均成正比例关系，说明电极过程是一个表面控制过程。 4 在最佳实验条件下，血红蛋白金胶一纳米管羟基磷灰石复合 材料修饰电极，检测过氧化氢浓度的线性范围为o 5 - 2 5g m ，最低检 出限为0 2p , m ，并且制成的过氧化氢传感器具有良好的重复性和稳定 性。 结论： 1 h a p 具有优良的生物相容性和独特的吸附位点可与金胶纳米粒 子按照某种特定的比例混合，合成新型的复合纳米材料，此材料具有 多孔、均匀的表面形貌，能为血红蛋白提供一个特殊的、具有生物兼 容性的微环境，使血红蛋白保持良好的天然构象，有利于研究血红蛋 白的电子传递过程。 2 血红蛋白金胶一纳米管羟基磷灰石复合材料修饰电极，对过氧 化氢的还原有着良好、快速的催化作用，制成的过氧化氢传感器具有 良好的稳定性和重复性。 关键词：纳米管羟基磷灰石，金胶纳米粒子，血红蛋白，直接电 化学，生物传感器 重庆医科大学硕士研究生学位论文 s y n t h e s e so fn a n o c o m p o s i t e sa n dt h e i r a p p l i c a t i o n si ne l ec t r o c h e m i c a l o b j e c t i v e ： b i o s e n s i n g a b s t r a c t 1 t h en a n o s c a l eg n p s h a pc o m p o s i t em a t e r i a lw a ss y n t h e s i z e df o r t h ef i r s tt i m ew i t ht h ep r e c i p i t a t i o nm e t h o d d u et ot h ep a r t i c u l a r m u l t i - a b s o r b i n gs i t e sa n dw e l le l e c t r i cp o w e r ，t h en a n o c o m p o s i t em a t e r i a l c a nb eu s e da san o v e lf a v o r i t ep r o m o t e rf o rt h ed i r e c te l e c t r o c h e m i s t r yo f h e m o g l o b i n 2 t os t u d yt h ee f f e c t so f t h ev o l u m er a t i oo f h a p s u s p e n s i o nt og n p s s o l u t i o no ne l e c t r o nt r a n s f e r s p e e d ，a n do b s e r v et h em o r p h o l o g yo f g n p s - h a pc o m p l e xm a t e r i a lo nc o p p e rn e tb ys e m 3 t os t u d yt h ei n f l u e n c eo fs o l u t i o np ha n dd i f f e r e n ts c a nr a t e so n p e a kc u r r e n t sa n dp o t e n t i a l so fh b g n p s h a p g c e 4 t oi n v e s t i g a t et h ee l e c t r o c h e m i c a lb e h a v i o ro fh b g n p s h a p g c e ， a n de x p l o rt h ec a t a l y s i s a b i l i t y o fh b g n p s h a p g c eo nh y d r o g e n p e r o x i d e 5 重庆医科大学硕士研究生学位论文 m e t h o d s ： 1 a na q u e o u ss o l u t i o no fh 3 p 0 4w a sa d d e dd r o p w i s et os t i r r e d v i g o r o u s l ya q u e o u ss o l u t i o no fc a ( o h ) 2a t6 0 。c ，a n dt h ep ho ft h e r e s u l t i n gs u s p e n s i o nw a sa d j u s t e dt op h7 0 a f t e ra g i n g ，w a s h i n g ，f i l t r a t i o n a n dc e n t r i f u g a t i o n , t h eh a pn a n o t u b e sc o u l db ef o r m e da t10 0 。ci n v a c u u m a d d i n gn a 3 一c i t r a t es o l u t i o nt o ab o i l i n gs o l u t i o no f0 o1 h a u c l 4a n dm a i n t a i n i n gt h em i x t u r ea tt h eb o i l i n gp o i n tf o r15 r a i na n d s t i r r e d f i n a l l y ，m i xas u s p e n s i o no fh a pn a n o t u b e sa n dt h ep r e p a r e da u c o l l o i ds o l u t i o nw i t hs o n i c a t i o nf o r10m i n 2 t os t u d yt h eu v v i ss p e c t r ao fh b g n p s h a p 、f i ba n dg n p s h a p d i s p e r s i n gi nw a t e rb yu v v s i 一3 6 0 0 一n i rs p e c t r o p h o t o m e t e r a n dt oo b t a i n t h ec y c l i cv o l t a m m o g r a m so fh b g n p s h a p ，h b h a p ，h b g n p s ， g n p s h a pi no 1m o l lp h 7 0p b sa t1 0 0m v s 3 t o i n v e s t i g a t e t h ee f f e c to fs o l u t i o n p h o nt h ed i r e c t e l e c t r o c h e m i s t r yo ft h ei m m o b i l i z e dh b a n di nt h eo p t i m i z e dp h ，t o o b s e r v et h er e l a t i o n s h i po fs c a nr a t ea n dp e a kc u r r e n t 4 t h ec y c l i cv o l t a m m o g r a m so fh b g n p s h a p g c ei no 1m o l l p h7 0 p b sc o n t a i n i n gd i f f e r e n th 2 0 2c o n c e n t r a t i o na n d t y p i c a l c u r r e n t t i m er e s p o n s ec u r v eo ft h eb i o s e n s o ru p o ns u c c e s s i v ea d d i t i o n so f d i f f e r e n ta m o u n t so fh 2 0 2i n t o0 1m o l lp h7 0p b sa ta p p l i e dp o t e n t i a l o f 一3 7 2m v 6 重庆医科大学硕士研究生学位论文 r e s u l t s ： 1 c o n s i d e r i n gt h es t a b l ef i l mo fg n p s h a pn a n o c o m p o s i t ew i t hh i g h c a r r y i n gc a p a c i t y ，t h ev o l u m er a t i oo f1 ：1 w a su s e df o rt h ep r e p a r a t i o no f g n p s h a pn a n o c o m p o s i t e i nw h o l ee x p e r i m e n t t h em o r p h o l o g yo f g n p s - h a pn a n o c o m p o s i t ef i l mw h i c hw a sa l s oc h a r a c t e r i z e db ys e m ， g n p sc a ns t r o n g l ya d s o r bo nt h es u r f a c eo fh a pt of o r mau n i f o r m 、 p o r o u s s t r u c t u r e t h ec o n f i g u r a t i o ni n c r e a s e dt h ec a r r y i n g c a p a c i t yo f h e m o g l o b i n e 2 f r o mt h eu v - v i ss p e c t r ao fh b g n p s h a p 、h ba n dg n p s h a pi n w a t e r ，i tc a nb es e e nt h a tb o t hf i l m sc o n t a i n i n gh bd i s p l a y e dam a x i m u m a b s o r p t i o na t4 0 5 7 8n l n t h ep h e n o m e n o ns h o w e dt h eh bh a dm i x e di n t h e n a n c o m p o s i t e f i l mr e t a i n e di t sn a t u r a l s e c o n d a r ys t r u c t u r e s o ， g n p s h a pn a n o c o m p o s i t e f i l m p r o v i d e d a g o o d m a t r i xf o rh b i m m o b i l i z a t i o na n dk e p tt h eg o o db i o c o m p a t i b i l i t y f r o mt h ec y c l i c v o l t a m m o g r a m so fh b g n p s h a p 、h b h a p 、h b g n p s 、g n p s - h a p ， i tc a nb es e e nt h a tt h eg n p s h a pn a n o c o m p o s i t ec o a t i n gs h o w e da s y n e r g i s t i ce f f e c tb e t w e e ng n p sa n dh a pn a n o t u b e sf o ra c c e l e r a t i n gt h e s u r f a c ee l e c t r o nt r a n s f e ro fh b 3 t h ec y c l i cv o l t a m m e t e rp e a kc u r r e n t sa n dp e a kp o t e n t i a l so f h e m o g l o b i nw a sc h a n g e dr e v e r s i b l ea l o n gw i t hd i f f e r e n tp ha n dt h ep l o t o ff o r m a lp o t e n t i a lv e r s u sp hs h o w e das l o p eo f 一51m vp h 1 i tw a s p r o v e d t h a te l e c t r o d er e a c t i o nw a so n e - e l e c t r o nc o u p l e do n e - p r o t o n 7 重庆医科大学硬士研究生学位论文 r e a c t i o np r o c e s s a n dw i t ha ni n c r e a s i n gs c a nr a t er a n g i n gf r o m10t o 10 0 0m v s ，t h er e d u c t i o na n do x i d a t i o np e a kc u r r e n t si n c r e a s e dli n e a r l y ， i n d i c a t e dt h a tt h er e d o xp r o c e s sw a st y p i c a ls u r f a c e - c o n t r o l l e dp r o c e s s 4 i nt h e o p t i m a le x p e r i m e n tc o n d i t i o n , a n e wb i o s e n s o r h b g n p s - h a p g c ef o rh y d r o g e np e r o x i d ew i t hal i n e a rr a n g ef r o m0 5t o 2 5l a ma n dal i m i to f d e t e c t i o no f 0 2b m t h eh y d r o g e np e r o x i d eb i o s e n s o r p o s s e s s e df a v o r a b l er e p e a t a b i l i t ya n ds t a b i l i t y c o n c l u s i o n ： i h a pn a n o t u b e s w i t h g o o db i o c o m p a t i b i l i t y a n d p a r t i c u l a r m u l t i a d s o r b i n gs i t e s ，m i x e dw i t hg n p ss p e c i f i c a l l yp r o p o r t i o n t h en e w n a n o c o m p o s i t eo fg n p s h a pw a ss y n t h e s i z e d ，h a dg o tc h a r a c t e r i s t i co f u n i f o r m 、p o r o u se x t e r n a lf r a m ea n do w n e dt h ep r o p e r t yo fh i g hs u r f a c e a r e aa n d s a t i s f a c t o r yb i o c o m p a t i b i l i t y t h e s ec h a r a c t e r sk e p t n a t i v e c o n f i g u r a t i o no fh b ，b u ta l s og r e a t l ya c c e l e r a t e dt h ed i r e c te l e c t r o n t r a n s f e r 2 o w i n gt ot h eg o o db i o c o m p a t i b i l i t yo ft h en a n o c o m p o s i t e ，t h e a s p r e p a r e dh b g n p s - h a p g c ed i s p l a y sh i 曲e l e c t r o c a t a l y t i c p e r f o r m a n c et o w a r dr e d u c t i o no fh 2 0 2w i t hf a s tr e s p o n s ea n dt h eb i o s e n s o r s h o w sg o o ds t a b i l i t ya n da c c e p t a b l er e p e a t a b i l i t y k e yw o r d s ：h y d r o x y a p a t i t e ，g o l dn a n o p a r t i c l e s ，n a n o c o m p o s i t e ， h e m o g l o b i n , d i r e c te l e c t r o c h e m i s t y , b i o s e n s o r 重庆医科大学硕士研究生学位论文 英文缩写 h a p g n p s h r p h b g o d p d d a d n a c h i t f a d n a d h c i n u n d c m c n t s s e m g c e c h i m c w c p b s u v v i s n i r 符号说明 英文全称中文全称 h y d r o x y a p a t i t e 纳米管羟基磷灰石 g o l dn a n o p a r t i c l e s 金胶纳米粒子 h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e 辣根过氧化物酶 h e m o g l o b i n 血红蛋白 g l u c o s eo x i d a s e 葡萄糖氧化酶 p o l y ( d i a i l y d i m e t h y l a m m o n i u m )聚二烯丙基二甲基胺盐 d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d 脱氧核糖核酸 c h i t o s a n 壳聚糖 f l a v i na d e n i n ed i n u c l e o t i d e黄素腺嘌呤二核苷酸 n i c o t i n a m i d ea d e n i n e还原型辅酶i 二钠盐 d i n u c l e o t i d e c a r b o n c o a t e di r o n 碳掺杂铁纳米粒子 n a n o p a r t i c l e s u n d o p e dn a n o c r y s t a l l i n e d i a m o n d c a r b o x y m e t h y lc e l l u l o s e n a n o t u b e s s c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p e g l a s sc a r b o ne l e c t r o d e c h e m i s t r yi n s t r u m e n t m e s o p o r o u s c a r b o n w h i s k e r 1 i k ec a r b o n p h o s p h a t eb u f f e rs o l u t i o n u l t r a v i o l e t v i s i b l e n e a rin f r a r e d ( r a d ia t i o n ) 不掺杂晶体的金刚石 羧甲基纤维素 钠米管 电子扫描显微镜 玻碳电极 化学仪器 多孔碳 磷酸盐缓冲液 紫外线 可见光 近红外( 辐射) 重庆医科大学 研究生学位论文独创性声明 本人申明所呈交的论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得重庆医科大学或其他教育机构 的学位或证书而使用过的材料，与我n - r - 作的同志对本研究所做的任何贡献均己 在论文中作了明确的说明并表示谢意 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任 学位论文作者签名滥立日期：碰! 玺皇目6 自 学位论文版权使用授权书 本人完全了解重庆医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在攻读学 位期问论文工作的知识产权单位属重庆医科大学本人保证毕业离校后，发表论 文或使用论文工作成果时署名单位为重庆医科大学学校有权保留并向国家有关 部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅学校可以公布学 位论文的全部或部分内容( 保密内容除外) ，可以采用影印、缩印或其他手段保 存论文 论文作者签名： 指导教师签名： 日 期： 重庆医科大学硕士研究生学位论文 血红蛋白在金胶一纳米管羟基磷灰石复合材料上的直 接电化学 土上- j l o 刖置 近年来，在生物电化学领域中，对蛋白质的电化学性质研究引起了科学家的 广泛兴趣和重视。蛋白质( 酶) 作为一类典型的生物大分子和特殊的催化剂，在 生命过程中扮演着极为重要的角色。它们也是电化学生物传感器中应用最广泛的 固定化生物功能试剂，用于传感器的敏感膜制备，能够实现传感器对底物的高选 择性和高灵敏检测。理论上，蛋白质( 酶) 与电极之间的直接电子传递过程更接 近生物氧化还原系统的原始模型，为揭示生物氧化还原过程的机理奠定了基础； 从应用方面而言，直接电化学的实现可用于发展人工心脏用的生物燃料电池。因 此，研究氧化还原蛋白与电极表面之间的直接电子传递在生命科学、环境科学、 能源科学和分析化学中具有重要的理论和实践意义。将氧化还原蛋白固定在具有 生物兼容性的电极表面，可发生一个相当快的电子传递反应第三代生物传感器主 要通过蛋白质( 酶) 的直接电化学来实现，利用这一直接电子传递性质制得的生物 传感器可不需要向分析液中添加电子传递媒介体对底物分子进行电化学测定，这 样的生物传感器又称无试剂传感器，已成为生物电化学研究最终要的发展方向之 一。然而，氧化还原蛋白质与裸露的金属表面直接接触通常会引起蛋白质的结构 与功能发生变化，并失去其生物活性，使蛋白质( 酶) 在电极上的电子传递受到 抑制，而且蛋白质( 酶) 的电活性中心通常被包埋，不易暴露，难于接近电极表 面，因此实现蛋白质( 酶) 与电极之间的直接电子传递通常比较困难。理想的界 面性质可以通过对电极或蛋白质进行修饰而取得。因此，近年来科研工作者都在 通过合成新的导电材料，来研究蛋白质的直接电化学 1 6 】。 纳米材料是当今研究热点之一。纳米管羟基磷灰石 h y d r o x y a p a t i t e ，c a l o ( p 0 4 ) 6 ( o h ) 2 ，h a p 】是生物活性陶瓷，其化学性能以及与人体硬组织极其相似，并 且具有良好的生物相容性和生物活性，对大部分蛋白质具有亲和性，是常用的骨 重庆医科大学磺研究生学位论文 修复材料。此外，规则的六方晶系h a p 立体化学结构( 如陶1 ) 和独特的多吸附位 点特性决定了h a p 对蛋白质具有多点键合的特性，使其广泛的用丁骨修复【7 i 、催 化吼吸附”i 、蛋白质分离i o , i i i 等领域。目前制备羟基磷灰石的方法很多包括离 子喷雾，溶胶- 凝胶法，化学沉淀法，电化学法，水热往等m 。1 w 。纳米管羟基磷灰 石粒了制备的关键问题是c ap 比例的把握。本文采用化学沉淀法，通过对台成温 度，口h 值，分散剂以及反应物的浓度控制首次台成了具有管状结构的羟基磷灰 石。它具有很好的吸附性和生物相容性，可咀为研究蛋白质提供一个理想的界面。 但是直接将h a p 修饰在玻碳电极上，研究血红蛋白分子的直接电化学，往往得不 到理想的循环伏安嘲。在车课题中，引进了导电性强的金胶与h a p 通过静电吸附 的方式结合构成仿生界面，研究蛋白质的直接电化学。 黼 围1 羟墓磷藏石蛄柯的示毒用 f i g lt h es k e t c h m a p o f h y d m x y 。p a 6 k p o 。 重庆医科大学硕士研究生学位论文 金胶是细胞化学与组织化学中的常用标记物，它们利用透射和扫描电镜、光 学显微镜以及f r e e z e e t c h 电子显微镜、增强表面拉曼光谱和表面等离子共振信号 等来表征生物大分子。近年来使用金胶纳米粒子来构筑蛋白质直接电子传递的界 面并保持其生物活性的研究也以被广泛的报道：细胞色素c i l 4 】、辣根过氧化物酶 1 1 5 】、葡萄糖氧化酶【1 6 】和血红蛋卧1 - 2 4 1 。主要因为金胶能加快氧化还原蛋白与电极 之间的电子传递【2 己2 3 】，这一事实可以用下列几种方式形象的进行说明：( 1 ) 金胶， 纳米粒子具有很高的比表面积、表面能和活性，因此能与蛋白质分子发生强烈的 相互作用。( 2 ) 小尺寸的金胶纳米粒子( 约3 0 n m ) 能给蛋白质分子提供更自由 的取向，增加了蛋白质的磷酸盐骨架靠近金属粒子表面的可以性，缩短了蛋白质 分子与金属粒子表面之间的电子传递距离，从而有利于电子传递反应的发生。( 3 ) 金胶纳米粒子能够充当蛋白质分子的磷酸盐骨架与电极表面之间的电子传输通 道，因而加快了电子传递的过程。( 4 ) 蛋白质与金胶纳米粒子表面的强烈相互作 用将导致金胶粒子表面上吸附的蛋白质的表面密度增加，以至于一些本来受到限 制的方位也能适合于蛋白质分子与导电性物质表面的直接电子传递。 血红蛋白( h b ) 是存在于红细胞中的一种重要蛋白质，由四个亚基( 聚合肽 链) 组成，相对分子量约为6 4 5 0 0 。每一个肽链含有一个能贮藏和转移氧的血红 素，血红素中的铁原子能与氧分子可逆地结合，因此，每分子血红蛋白可运输四 分子氧气【2 5 2 6 1 。四条肽链结合的血红素相互挨得很紧，形成近似球形的血红蛋白 分子，直径为5 5a ( 图2 ) 。在血红素附近有两个组氨酸残基，它们的咪唑基恰好 处在血红素卟啉环平面的两侧。离血红素平面较近的一个咪唑基与血红素的铁原 子形成一个配位键。血红素的铁原子上共有五个连结键，此时它的直径较大，不 能全部嵌入卟啉平面。当血红蛋白中的一个o f , 亚基与氧结合后，铁的直径缩小， 而能落入卟啉平面，并使铁原子与组氨酸间连接键的距离改变，进而引起一系列 连接键的变化，使相邻的仪亚基结构变得易与氧分子结合。在此亚基与氧结合后， 接着又引起其余亚基变构，逐渐变得易与氧分子结合，最终整个血红蛋白分子变 成氧合血红蛋白的构像【2 7 , 2 8 】。血红蛋白在生命体内主要起着传输氧的重要作用， 是研究血红素类蛋白质的直接电化学以及生物传感和电催化的理想模型【2 9 1 。但由 于其分子空间结构庞大，电活性中心不容易暴露，许多研究者都借助于电子传递 介体，促进剂或特殊材料修饰电极的表面活化蛋白质的氧化还原中心，并加速此 | 庚医科大学硕士研究生学位论文 类蛋白的电f 传递1 3 0 - 3 4 1 参t “1 ，们 k 州， ， 、 t i 血红蛋白分子组成 图2 血缸蛋白分于的蛄柏囤 f 噼t h es t r u c 恤no f h e m o g l o b i n 本课题运用恒频超声的方法将金胶和纳米h a p 混合，首次得到g n p s - h a p 复 台材料，由于h a p 的吸附作用，g n p s - h a p 能够很好的同定在玻碳电极上。并利 用直接滴涂的方法，将血红蛋白( h b ) 分子滴加在g n p s - h a p 复合材料修饰的玻碳 电极表面，由于静电吸附作用h b 能够报好的固定在电极表面，获得了用于过氧化氢 检测的安培生物传感器。 一 e 一 重庆医科大学硕士研究生学位论文 血红蛋白在金胶一纳米管羟基磷灰石复合材料上的直 接电化学 纳米粒子由于在固体表面的二维和三维有序组装，可制备多种复合纳米光学 和电子传感器件，对于保持蛋白质与酶等生物分子在固体表面上的生物活性、促 进氧化还原蛋白质的直接电子传递和蛋白质或酶与底物问的电子传递具有重要作 用，因此得到电化学、生物分析化学和分析化学工作者的广泛关注。本文运用了 热沉淀法合成纳米管羟基磷灰石，并将其与金胶纳米粒子混合制成了一种新型的 复合纳米材料。这种材料能为血红蛋白提供一个特殊的、具有生物兼容性的微环 境，使血红蛋白保持良好的天然构象，并制成了过氧化氢生物传感器。 1 技术路线 血 分别合成羟基磷灰石和金胶 过氧化氢传感器 吸 目 嘏 帕 黝 谳 一 一 物 傲 孤 o鼢o娥o埘o 剑 砰 置 一 灰 疆 石 磷 日 灰 基 删 一 一 一 基 陪 魅 刚 黼 蛋 以 缀 瞅 重庆医科大学硕士研究生学位论文 2 仪器与试剂 2 1 试剂 牛血红蛋白( h b ，s i g m a 公司) 、h a u c l 4 3 h 2 0 ( d e s i e n h o f e n ，g e r m a n y ) 、过 氧化氢( 3 0 ，w v ，上海化学试剂公司) 。柠檬酸钠、氢氧化钙、碳酸钙、磷酸、 硝酸、铝粉、氢氧化钠、磷酸氢钠、磷酸二氢钠等其它试剂均为国产分析纯。不 同p h 值的0 。lm o l l 磷酸盐缓冲溶液( p b s ) 由标准的n a 2 h p 0 4 和n a i l 2 p 0 4 溶液 配制，加入h 3 p 0 4 或n a o h 调节缓冲液的p h 值。所有溶液都用二次水配制，化 学试剂未经进一步提纯。 2 2 仪器与方法 电化学实验在c h i6 6 0a 电化学工作站( u s a ) 上进行。电化学实验均使用 三电极系统在室温下测定：铂丝电极为对电极，饱和甘汞电极( 或a g a g c i ) 为 参比电极，修饰和未修饰的玻碳电极为工作电极。实验中0 1m o l lp h7 0p b s 在 使用前通氮气2 0 分钟除去溶液中的溶解氧。除非特别指出，实验均在氮气饱和的 溶液中进行。s e m 与紫外表征分别用s - 4 8 0 0 电子扫描显微镜( h i t a c h i ，日本) 和 u v v s i 3 6 0 0 - n i r 分光光度计( s h i m a d z u ，日本) 完成。s h i m a d u l b r o r a e l 2 0 0 天平( 日本岛津公司) 、m i l l p o r e 纯水过滤装置及m i l l p o r e 真空泵( 美国m i l l p o r e 公司) 、s b 3 2 0 0 超声波清洗器( 宁波新芝科器研究所) 、d k z 2 型电热恒温振 荡水槽( 上海) 。 3 实验部分 3 1 g n p s h a p 复合膜的制备 g n p s h a p 复合膜的制备主要分成三步：一是纳米管羟基磷灰石( h a p ) 的制 各，二是金胶粒子的制备，三是将g n p s 组装在纳米管羟基磷灰石表面。 纳米管羟基磷灰石制备过程【3 5 】如下：超声处理0 2 5m o l lc a ( o h ) 2 悬浊液， 然后以lm l m i n 的速度向其中逐渐滴加o 3m o l lh 3 p 0 4 ，保持整个合成的环境温 重庆医科大学硕士研究生学位论文 度在6 0o c ，溶液p h7 0 条件下进行。得到的产物经过陈化、洗绦、过滤、离心 后，放入真空干燥箱中，1 0 0 0 c 条件下干燥即得到纳米管h a p 粉末。 制备金胶1 7 , 3 6 】：通过控制向沸腾的h a u c i 4 水溶液中加入的柠檬酸钠的量很 容易地得到不同直径的金胶纳米粒子。实验前柠檬酸钠溶液和h a u c l 4 溶液都必 须用0 2 2um 的微孔虑膜过滤，所有的玻璃器皿必须在新配制的3 ：lh n 0 3 h c l 溶液中彻底清洗并用二次蒸馏水冲洗干净。将柠檬酸钠和h a u c l 4 溶液的混合物 恒沸1 5r a i n 后即得到酒红色的胶体金溶液，制得的金胶溶液根据需要通常保存在 4o c 的棕色玻璃瓶或聚乙烯瓶中。 称取0 2 r a g 纳米管羟基磷灰石用二次水溶解浓度为0 2 m g m lh a p 溶液，按 照体积比l ：l 将h a p 溶液和金胶溶液混合，恒频率超声10 r a i n ，即得到所需的 g n p s h a p 复合材料。 3 2 h b g n p s h a p g c e 修饰电极的制备 玻碳电极( g c e ，直径3m m ) 先在0 3l x m 和0 0 5p , m 的a 1 2 0 3 麂皮上打磨， 然后分别在l ：l 硝酸、乙醇和二次水中超声2 m i n ，得到平滑光洁新鲜的电极表 面。在室温下晾干，方可进行修饰。取5 9 lg n p s h a p 悬浊液滴涂到玻碳电极表 面，再滴加l o p l ，5 0m g m lh b ，即获得h b g n p s - h a p g c e 修饰电极。为了对 比得到定性图，分别用实验中涉及到的材料组合修饰电极：5 9 lg n p s h a p 得到 g n p s h a p g c e 、l o p t l5 0m g m lh b 获得h b g c e 、l o l a l5 0m g m lh b 和5 9 lh a p 悬浊液得到h b h a p g c e 、1 0 9 l5 0m g m lh b 和5 9 lg n p s 得到h b g n p s g c e 。 将修饰的电极放入干燥器中，室温下干燥8 h ，即得到相应膜修饰的玻碳电极。每 次实验前，电极用二次水冲洗，不用的电极保存在0 1 m o l l 的p b s 溶液中，置于4 o c 冰箱里。 4 结果与讨论 4 1 h a p 浓度的优化 配制浓度分别为0 0 5 、0 1 、o 2 、0 3 、0 5 、o 7 、1 0 、1 5m g m l 的h a p 溶 液，与金胶纳米粒子按l ：l 的比例混合恒频超声。将得到的不同h a p 浓度的混合溶 重庆医科大学硕士研究生学位论文 液修饰到玻碳电极上，干燥后在p h7 0 ，o 1m o l l 的p b s 中扫循环伏安。以h a p 的浓度对修饰电极的电流响应值作图( 见图3 ) 。结果表明，当h a p 浓度为o 2r a g m l 时，电流响应最大，表明此时羟基磷灰石金胶复合膜吸附血红蛋白的位点达 到了饱和。因此，选择h a p 溶液的浓度为0 2m g m l 。 h a pc o n c e n t r a t i o n r a gm l 1 图3h a p 浓度对峰电流的影响 f i 9 3t h ee f f e c to ft h ec o n c e n t r a t i o no fh a p 4 2 g n p s 和h a p 混合比例的优化 金胶与羟基磷灰石混合比例的不同对形成均匀、高承载量复合膜起绝对性的 作用。考察了g n p s 和h a p 混合比例分别为：0 ：1 、l ：3 、2 ：3 、1 ：1 、3 ：2 、 3 ：1 、0 ：l 的情况下合成的纳米复合膜修饰玻碳电极，在p h7 00 1m o l l 的p b s 中扫循环伏安，以g n p s 和h a p 混合比例对h b 的响应电流作图。从图4 中可知： 当金胶与羟基磷灰石的比例大于l ：l 时，形成的复合膜不稳定，容易从电极上脱 落，对血红蛋白的吸附力减小；当金胶与羟基磷灰石的比例小于l ：l 时，可以在 电极上形成稳定的膜，同时也会吸附更多的血红蛋白在电极上，但是由于羟基磷 灰石是一个不导电的材料，阻碍了蛋白质和电极表面之间的电子传递过程。因此， 同时考虑复合膜修饰的牢固性和最大电子传递速率，最终选择两者比例为l ：l 。 | 庆医科大学日t 研究生学位论立 0 。川= 32 = 3 1捕3：2争3：1volumer a 自o ng n p s l = oo t h a 争 圈4g n p s 与h b p 的混合比例对峰电流的影响 f 讲t h ee f f e c to f t h e v o l u m er a t i o no f g n p s - h a p 4 3 g n p s h a p 复合膜修饰电极的表面形貌 片 s e m 对h a p 和g n p s - h a p 两种材料修饰上荆网上进行表征，结果剪i 图5 所示。从电镜罔上i ：1 j 以看出，h a p 能够在铜网l 蛐小同长度的管状结构，均匀 的分散在表面( 图5 a ) 。从图5 b 为g n p s h a p 复合材料的电镜幽，当g n p s 与h a p 混合后完全战变rh a p 的表面形貌，可以看到命_ 胶能够吸附在纳米管静基磷灰打 表们或者进入到，管道内部，形成，均匀的、多扎的表而结构，为j f 【红蛋白的镶 嵌提供r 根好的界面。 图5 日9 和g n p o h t p 复合材料的袁征固 f i g5s c a n n i n ge l e c t r o n m i c r o g r a p h $ o f h a p ( a ) a n d g n p s h a p ( b j f