（作物遗传育种专业论文）普通小麦籽粒多酚氧化酶活性的qtl分析.pdf

独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经 发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得河北盔业大鲎或其他教育机构的学 位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：壶哓 签字日期：伊f 1 年月日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解塑兰垦盔些盘堂有关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借 阅。本人授权塑皇鱼壅些盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 、学位论文作者签名：垒鼎 签字日期：w 1 年6 月乙日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 导师签名： 棍移 签字日期：伽l f 年月日 电话： 邮编： 摘要 删册 y 1 8 9 7 誊芝。：j i i f 普通小麦( t r i t i c u ma e s t i v u ml ) 是世界上最重要、最古老的粮食作物之一。用小 麦面粉制作的馒头、面条、饺子等食物是我国人民的传统主食。小麦面粉白度是商品 面粉品质的重要指标，籽粒中含有的多酚氧化酶( p o l y p h e n o lo x i d a s e ，p p o ) 是引起 面团( 片) 颜色褐变的主要原因。因此，深入研究小麦籽粒p p o 的活性及其分子标 记定位，对于小麦面粉白度的遗传改良具有重要意义。本研究以花培3 号豫麦5 7 杂交获得的的双单倍体( d o u b l e dh a p l o i d ，d h ) 群体为作图群体，在3 种环境下，测 定小麦籽粒p p o 活性，并利用基于混合线性模型的软件l c i m a p p i n 9 2 2 ，对p p o 活性 进行q t l 定位分析，为p p o 活性的基因克隆和分子标记辅助选择奠定基础。主要研 究结果如下： 1 在1 年3 个环境条件下( 2 0 0 9 年j 下常水肥、2 0 0 9 年未施氮肥、2 0 0 9 年雨养f 开) 种 植的d h 群体1 6 8 个系，其父母本的p p o 活性存在明显差异，群体的p p o 活性符合 正态分布，偏度值和峰度值的绝对值小于1 0 ，表明该群体适合q t l 分析。 2 将3 1 5 个s s r 分子标记位点锚定在小麦的2 1 条染色上。图谱全长2 1 4 1 7 c m ， 平均两个标记间的遗传距离7 0 2 c m ，形成2 4 个连锁群。每个连锁群包括3 - - 一，2 4 个位 点，发现了一些标记富集区，这些区域在不同作图群体问多态性较高，有利于q t l 定位。 3 检测到控制小麦籽粒p p o 活性的1 3 个位点，分布于8 条染色体( 2 a 、2 d 、3 d 、 5 a 、5 b 、6 a 、6 b 和6 d ) ，其中7 个q t l s 遗传贡献率较大( 超过1 0 ) ，属主效基因 位点，其余6 个q t l s 遗传贡献率较d , v l , 于1 0 ) ，属微效基因位点。 关键词：小麦；籽粒；p p o 活性；d h 群体；q t l 定位 m a p p i n gq t l s f o r p o l y p h e n o lo x i d a s ea c t i v i t yi nc o m m o nw h e a tg r a i n m a j o r ：c r o pg e n e t i c sa n db r e e d i n g g r a d u a t e ：z h a oy o n g s u p e r v i s o r ：p r o f e s s o ry a n gx u e - j u a b s t r a c t c o m m o nw h e a t ( t r i t i c u ma e s t i v u ml ) i so n eo ft h em o s ti m p o r t a n ta n dt h eo l d e s tc r o p si nt h e w o r l d s t e a m e db r e a d ，n o o d l ea n dd u m p l i n g sa r et r a d i t i o n a lb a s i cf o o di no u rc o u n t r y , w h i c ha r et h e p r o d u c t i o no fw h e a tf l o u rt h ep o l y p h e n o lo x i d a s e ( p p o ) a c t i v i t yi sam a j o rf a c t o rt o c a u s ea n u n d e s i r a b l eb r o w nd i s c o l o r a t i o no fw h e a tb a s e de n dp r o d u c t sd u m i n gp r o c e s s i n go rs t o r a g e h e n c e ， s t u d i n gt h ea c t i v i t yo fp p oi nw h e a ta n dt h el o c a t i o no fi t sm o l e c u l e rm a r k e r si n t e n s i v e l yi so fg r e a t i m p o r t a n c et ot h ei n h e n c e m e n to ft h ew h i t e n e s so fw h e a tf l o u r i nt h ep r e s e n ts t u d y , w er e p o r tan e w g e n e t i cl i n k a g em a pd e v e l o p e df r o ma nf l d e r i v e dd o u b l e dh a p l o i d ( d h ) p o p u l a t i o no f1 6 8l i n e s ，w h i c h w a sg e n e r a t e df r o mt h ec r o s sb e t w e e nt w oe l i t ec h i n e s ec o m m o nw h e a tv a r i e t i e sh u a p e i3a n d y u m a i 5 7 t h ed ha n dp a r e n t sw e r ee v a l u a t e df o rp p oa c t i v i t yi nt h r e ee n v i r o n m e n t s q t la n a l y s e s w e r ep e r f o r m e du s i n gt h es o f t w a r eo fi c i m a p p i n g2 2b a s e do nt h em i x e dl i n e a rm o d e la p p r o a c h t h e p r i m a r yg o a lo f t h es t u d yd e s c r i b e dh e r ew a st od e t e c tq t l sw i t ha d d i t i v ee f f e c t sf o rp p o a c t i v i t y t h e r e s u l t sw e r ea st h ef o l l o w i n g ： 1 ap o p u l a t i o no f1 6 8d hl i n e sw a sp r o d u c e db ya n t h e rc u l t u r ef r o mt h ec r o s sb e t w e e nt w oc h i n e s e c o m m o nw h e a tv a r i e t i e sh u a p e i3 ( f e m a l ep a r e n t ) y u m a i5 7 ( m a l ep a r e n t ) g e n e t i c sa n a l y s i so f q u a n t i t a t i v et r a i t sw e r ec a r r i e do u tb yu s i n gt h ei n v e s t i g a t e dr e s u l t si n t h r e ee n v i r o n m e n t s ：n o r m a l i r r i g a t e da n dt o p d r e s s e du r e ai n2 0 0 9 ( e n v i r o n m e n ti ) ，n o r m a li r r i g a t e db u tn ot o p d r e s s e du r e ai n2 0 0 9 ( e n v i r o n m e n tl d ，n oi r r i g a t e db u tt o p d r e s s e du r e ai n2 0 0 9 ( e n v i r o n m e n tl i d a n a l y s i st h ev a r i a n c eo f d i f f e r e n c eb e t w e e nt h ep a r e n t a lg r o u p so np p oi nt h ee x p e r i m e n t ss h o w e ds i g n i f i c a n td i f f e r e n c ea m o n g t h ep p oi nd h p o p u l a t i o nb ys p s s ，t h et e s ts h o w e dt h et r a i ta p p r o x i m a t e l yf i tn o r m a ld i s t r i b u t i o n s i t w a ss h o w nt h a tt h ed hp o p u l a t i o nc a nb eu s e df o rt h ec o n s t r u c t i o no ft h eg e n e t i cm a pa n dq t l m a p p i n g 2 ag e n e t i cl i n k a g em a pc o n t a i n i n g3 2 4s s rm a r k e r s ，u s i n gm a p m a b e r e x p v e r s i o n3 0s o f t w a r e ， w a sf i n a l l yd e v e l o p e d t h em a pc o v e r e dat o t a ll e n g t ho f2 1 4 1 7c mw i t ha na v e r a g ed i s t a n c eo f7 0 2 c mb e t w e e na d j a c e n tm a r k e r si nt h em a p ，w h i c hr e s u l t e di n2 4l i n k a g eg r o u p sc o m p r i s i n g3t o2 4l o c i e a c ho ft h el i n k a g eg r o u p sc o u l db ea s s i g n e dt oo n eo ft h e2 1c h r o m o s o m e sb a s e do nt h em i c r o - s a t e l l i t e c o n s e n s u sm a p t h i sw o r kf o u n ds o m el a r g eb i n so fc o s e g r e g a t i n gm a r k e r sn e a rt h ec e n t r o m e r i cr e g i o n s ， w h i c ha r ek n o w nt oh a v es u p p r e s s e dr e c o m b i n a t i o n t h e s eu n r e s o l v e dr e g i o n sm a yp r o v i d ea c c e s st oa h i g hd e n s i t yo fm a r k e r sa n dt h e r e b yi n c r e a s et h ec h a n c eo ff i n d i n gp o l y m o r p h i s ma m o n gd i f f e r e n t g e r m p l a s mm a t e r i a l s i tw i l lb ei n t e r e s t i n gt os e ei ft h em a r k e r si nt h ec e n t r o m e r i cr e g i o n sf o u n di no u r s t u d yw o u l db eu s e f u li nd e t e c t i n ga n dt a g g i n gq t l si nf u r t h e rr e s e a r c h af u r t h e ra g r e e m e n tb e t w e e n o u rw o r ka n ds i m i l a rs t u d i e si st h eo b s e r v a t i o no fs e g r e g a t i o nd i s t o r t i o no fc e r t a i nm a r k e r s 3 b a s e do nt h eg e n e t i cm a pe s t a b l i s h e df r o mt h ed hp o p u l a t i o n ，t h eq t l sw e r ed e t e c t e du s i n gt h e s o f t w a r ei c i m a p p i n g2 2w i t ht h ec o m p o s i t ei n t e r v a lm a p p i n go ft h em i x t u r el i n e a rm o d e l q t l sf o r p p ow a sa n a l y z e di n1c r o p i n gs e a s o n sa n d3e n v i r o n m e n t s at o t a lo f1 3q t l sw e r ed e t e c t e da n d d i s t r i b u t e do n1 0c h r o m o s o m e s2 a ，2 d ，3 d ，5 a ，5 b ，6 a ，6 ba n d6 d a m o n gt h e m ，7q t l sw e r em a j o r g e n e s w h i l e6a d d i t i v eq t l sw e r em i n o rg e n e s t l l l ec o n t r i b u t i o nr a t eo fm a i ne f f e c tg e n eq p p o 一2 d - 2 i s6 5 8 4 w h o s eg e n e t i cd i s t a n c ef r o mx c f d l 6 8i s0 c m t h ec o n t r i b u t i o nr a t eo fq p p o - 2 d - 5i s 2 2 7 3 ，w h o s eg e n e t i cd i s t a n c ef r o mx c f d l 6 8i so c m t h ec o n t r i b u t i o nr a t eo fq p p o - 6 di s1 9 1 7 ， w h o s eg e n e t i cd i s t a n c ef r o mx g w m 6 8 1i s2 c m t h ec o n t r i b u t i o nr a t eo fm a i ne f f e c tg e n eq p p o - 2 d - 1i s 1 7 2 4 ，w h o s eg e n e t i cd i s t a n c ef r o mx c f d l 6 8i so c m t h ec o n t r i b u t i o nr a t eo fq p p o 一2 d 2i s6 5 8 4 ， w h o s eg e n e t i cd i s t a n c ef r o mx w m c l 7 0 2i s0 c m t h ec o n t r i b u t i o nr a t eo fq p p o 一5 bi s1 3 4 7 w h o s e g e n e t i cd i s t a n c ef r o mx w m c l 6 0 i s0 c m t h ec o n t r i b u t i o nr a t eo fq p p o 一2 d 一3i s1 1 1 2 w h o s eg e n e t i c d i s t a n c ef r o mx w m c l 7 0 2i s3 c m k e y w o r d s ：w h e a t ( t r i t i c u ma e s t i v u ml ) ；g r a i n ；q t l s ；p p oa c t i v i t y ；d hp o p u l a t i o n ；q t l m a p p i n g 本文所用缩略词及中文对照 目录 1 弓l 言1 1 1p p o 研究进展。1 1 1 1p p o 的结构特性与分布1 1 1 2p p o 作用机理2 1 1 3 影响小麦p p o 活性的因素2 1 1 4p p o 活性的测定方法3 1 1 5p p o 活性的遗传和分子生物学研究进展3 1 2q t l 遗传连锁图谱分析。4 1 2 1q t l 作图的原理及q t l 定位的必要条件4 1 2 2 遗传连锁图谱的构建4 1 2 3q t l 定位方法及效应分析一5 1 2 4q t l 与环境的互作7 1 2 5q t l 的验证及应用一7 1 3 研究的目的意义一9 2 材料和方法1 1 2 1 试验材料1 1 2 2 研究方法1 1 2 2 1 田问试验1 l 2 2 2p p o 活性的测定。1 1 2 2 3s s r 标记检测。1 2 2 2 3 2d n a 浓度及纯度的检测1 3 2 2 3 3s s r 分子标记1 3 2 2 3 4 电泳分析1 4 2 2 4 遗传图谱的构建1 6 3 结果与分析1 7 3 1 小麦d h 群体的p p o 活性1 7 3 2 遗传图谱的构建1 8 3 2 1s s r 和e s t o s s r 标记在作图群体中的分离1 8 3 2 2 分子连锁图谱的构建1 9 3 3 小麦籽粒p p o 的q t l 定位及效应估计1 9 3 3 1 环境i 的p p o 活性q t l 分析1 9 3 3 2 环境i i 的p p o 活性q t l 分析2 0 3 3 3 环境i i i 的p p o 活性q t l 分析2 0 4 讨论2 2 4 1 小麦p p o 活性位点的多效性2 2 4 2 环境和遗传背景对q t l 检测的影响2 2 4 3 小麦籽粒p p o 活性q t l 定位结果的多样性2 2 4 4q t l 的应用2 3 4 5 进一步研究的设想2 3 4 5 1 饱和遗传图谱的构建和群体数量的扩展。2 3 4 5 2 分子标记辅助选择2 4 5 结论2 5 参考文献。2 6 附：衰a 3 i ) 附录b 3 2 在读期间发表的学术论文3 4 作者简历一3 5 致谓 3 6 普通小麦多酚氧化酶活性的o t l 分析 1 引言 普通小麦( t r i t i c u ma e s t i v u ml ) 是世界上最重要、最古老的粮食作物之一。用小麦 面粉制作的馒头、面条和饺子等食品是我国人民的传统主食，这类食品对面粉白度有 较高要求，细腻洁白的面粉及其制品备受消费者青睐。目前我国小麦面粉白度较低， 不能满足高质量蒸煮类食品对面粉色泽的质量要求。市场上，为提高竞争力，国内面 粉厂在生产过程中普遍使用增白剂，尤其是一些小型加工企业超量使用增白剂。这种 增白剂是一种过氧化苯甲酞类氧化剂，其使用量一旦超过国家规定的允许剂量，将会 对肝脏、神经等器官造成损伤。由于增白剂对人体有害，许多国家和地区早已禁用。 随着我国社会和经济的飞速发展以及人民生活水平的不断提高，人们对绿色食品的呼 声越来越高。小麦籽粒中的多酚氧化酶( p o l y p h e n o l o x i d a s e ，简称p p o ) 活性是导致酶 促褐变的主要原刚，可解释面条、水饺、馒头等面制半成品颜色变异的5 5 7 0 i 引。 因此，深入研究小麦籽粒p p o 活性及其分子标记定位，对于提高小麦面粉的白度有 着重要意义，也是小麦育种家面临的新课题。 1 1p p o 研究进展 p p o 广泛存在于植物当中，近几年是谷物化学研究的热点领域之一。p p o 在作 物生理代谢方面起着非常重要的作用，由于p p o 的氧化活性，会发生颜色反应，从 而影响食品的外观和风味。 1 1 1p p o 的结构特性与分布 p p o 是一类广泛存在于植物中的多基因家族表达产物，是一种含有铜离子的结构 蛋白，它可以催化酚类上的羟基，使之转化为醌或催化多酚类变为氧合酬引。因为醌 类具有较强的电化学性质，会发生自动氧化、蛋白质的亲核聚合反应及一些二级反应， 所有这些反应都使得食品发生了褐变。植物中的p p o 包括一些由核基因编码的多基 因家族【4 j 。在蕃茄当中，已有几个控制p p o 活性的基因被分离出来，并从结构上和功 能上将其分为3 组1 5 j 。在马铃薯中，已经有4 条c d n a 被克隆，每一条都显示了独特 的空问图景【6 。在扁豆中，已经有3 条与p p o 活性相关的c d n a 克隆被得到1 7 】。控制 p p o 基因一般有两个区域，一是与铜离子有关的编码区，另一个是引导肽 ( t r a n s i t p e p t i d e ) 区，以便能够准确进入质体。p p o 的前体约为6 0 7 5 k d a ，而成熟的 p p o ( 去除了引导肽的有活性的形式) 约为4 5 6 9 k d a ，由于这种潜在的酶活性的存在， 使p p o 活性的研究十分复杂。未激活的p p o 可被尿素的加入等激测8 1 ，或被陈化作 用、加盐、去污剂( 如s d s ) 、蛋白酶切。 小麦籽粒当中p p o 系统非常复杂，通过电泳( p a g e ) 可以发现p p o 以多种条 带形式存在。依赖于不同的底物，小麦p p o 活性及其表达形式主要，随籽粒的成熟 河北农业大学硕十学位( 毕业) 论文 度变化，当用邻苯二酚作底物时，p p o 电泳条带是6 1 0 个；而用l 广酪氨酸作底物 时，只有一条电泳条带【9 】。选用酪氨酸和邻苯二酚两种底物来测定单粒种子的p p o 活性，相同品种p p o 活性在单粒种子间的平均变异系数分别为3 4 和3 9 ，但是大 约有5 0 的邻苯二酚酶活性和浸种1 6 小时后的水分相关，而全部酪氨酸酶活性与种 子自身相关。因此可以得知，小麦中氧化邻苯二酚和氧化酪氨酸的不是同一种酶i l 。 将p p o 活性与l ( 0 4 8 h ) 值的回归直线外推至p p o 活性为零时，l ( 0 4 8 h ) 截距为1 0 3 ， 表明一定还有某种其它物质能够通过其它反应对颜色的改变起作用，h a t c h e r 等1 1 1 l 推 测可能是另外一种酶。t i k o o 等【1 2 j 在小麦中检测到3 - 5 种p p o 同工酶。k r u g e r 等1 1 3 j 在不同成熟阶段的小麦籽粒中分离到1 2 种p p o 同工酶。 o k o t k o t b e r 等1 8 j 研究了不同小麦品种、不同收获季节和不同地区的小麦籽粒及其 面粉的p p o 活性，结果表明p p o 活性主要取决于基因型的控制，而这种决定性又受 到季节和环境因素等条件的影响。小麦麸皮中p p o 活性较蒯。h a t c h e r 等【1 5 】用5 个 小麦品种，测定了其p p o 活性，结果表明不同品种之间p p o 活性变异很大，但总的 趋势是随麸皮含量的增大而增大。从p p o 底物中分离出来的苯酚酸，可以有效的抑 制p p o 活性，在酸性条件下的甲醇提取某些品种的小麦麸皮，其抽提物可以有效地 抑制p p o 活性。 1 1 2p p o 作用机理 酚类物质作为p p o 的作用底物，广泛存在于小麦的植株、籽粒和面粉中【l6 。，主 要包括自由酚酸、可溶酯化酚酸和三类。阿魏酸主要被酯化成细胞壁的半纤维素组分， 很少以自由酸形式存在。面粉中不溶束缚酚酸占总酚酸的8 0 以上，其中只有阿魏酸 可以被检测到；可溶酯化酚酸多贮存在胚中，占总酚酸的0 1 7 ，乳熟期苯丙氨 酸解氨酶活性峰值后2 0 2 4 d ，籽粒中可溶性酚酸含量最蒯1 。7 j ；自由酚酸最多占总酚 酸的6 【1 8 】。p p o 催化这些内源酚酸氧化生成不稳定的醌，醌可以和许多混合物发生 反应，也可以进一步经非酶氧化或自身聚合，产生深颜色的黑色素，从而引起面条( 团) 失色褐变l l 圳。酚类氧化产物能够和赖氨酸的氨基、氨基酸的a 氨基、胱氨酸的巯 基发生反应，生成其它物质，面筋中的新型交叉链接结构，p p o 在面粉中活性越高， 形成的新型结构就越多【2 0 1 ，因此面制品中p p o 在影响其表观色泽的同时，还直接影 响到食品的品质特性和蛋白质的营养价值。小麦麸皮中的p p o 在6 0 保存1 h 仍有 4 4 的活性1 2 1 】，最适反应p h 为5 6 。6 0 ，该酶可作用于邻苯二酚及多巴、多巴胺，但 对酪氨酸和绿原酸作用很小，l - 抗坏血酸和苯基硫脲、低浓度的亚硫酸氢钠对该酶 均有抑制活性的作用【z 引。 1 1 3 影响小麦p p o 活性的因素 除了基因型的影响之外，影响小麦p p o 活性的其它因素还有许多。许多品质参 数如小麦的籽粒的部分性状( 种皮颜色、饱满度、千粒重等) 、出粉率、面粉的蛋白和 2 背通小麦多酚氧化酶活性的q t l 分析 灰分含量都与面粉和籽粒的p p o 活性显著相关1 2 引。同- - d , 麦品种中，小籽粒比大籽 粒比p p o 活性要高，不同籽粒大小的p p o 活性在同一品种中存在差异。另外，小麦 中籽粒的p p o 活性随成熟度的增加而降低，其间差异和成熟过程中酶的合成及小麦 发芽有关。p p o 活性与面粉蛋白( r = 0 8 3 ) 、籽粒蛋白( r = o 5 7 ) 呈显著正相关，与面粉灰 分含量呈极显著正相关( r = 0 9 9 7 - - 0 9 9 9 ) 。对同一品种而言，蛋白质含量对面条制作过 程中p p o 的影响小于面团色泽稳定性的影响：而对于不同品种，p p o 蛋白质含量的 影响j i a * j d , 于对面团色泽稳定性的影响【l 训。面粉中p p o 含量随出粉率的提高而提高， 随磨粉时麸皮污染程度的增强而增强【2 0 】。小麦p p o 活性也受小麦籽粒类型的影响， 硬粒小麦p p o 活性最低，因此可以通过p p o 活性的测定，检测硬粒小麦的纯度。硬 红冬( 硬质、红皮、冬性) 、硬红春及软红冬小麦高于普通白粒小麦p p o 活性，但是 硬红冬和硬红春、硬红冬和软红冬问p p o 活性差异较小1 2 4 j 。矮秆当中的小麦p p o 活 性较高。其中面粉中p p o 活性与酚酸含量呈显著f 相关i l 引。在做面条的生面团中加 入抗坏血酸能够有效的抑制其变色，这可能与其抗p p o 的氧化特性有关。 1 1 4p p o 活性的测定方法 将酚类物质或邻苯二酚作为底物是最早的用来测定p p o 活性的滴定法，后来研 究发现用极谱电极法测定0 2 消耗更精确一些【2 6 】。但是，无论是极谱电极法还是滴定 法都必须进行种子研磨，为了省时方便的测定，k r u g e r 等1 27 j 创造了无需研磨种子就 可以直接测定小麦p p o 活性的方法：种子在水中浸泡1 6 h ，然后加入邻苯二酚，反应 3 0 m i n 后用微盘计数器测溶液，观察其颜色变化。将这种方法与氧电极法比较发现， 相关系数达到0 8 5 。伴随着科技的发展以及分光光度计的广泛应用，a n d e r s o n 等瞄j 将整粒种子测定方法做了进一步改进：3 巧个整籽粒或o 4 9 被钳碎的种子放入玻璃管 中，加入配制的5 0 m mm o p s 和l - d o p a 的混合缓冲液，室温条件下振荡反应3 0 m i n 或3 7 振摇5 m i n 后过滤，然后采用分光光度计测定其在4 7 5 n m 下的吸光值，这种方 法与研磨种子氧电极法比较，相关系数达到了0 8 6 。 1 1 5p p o 活性的遗传和分子生物学研究进展 j i m e n z 纠2 8 挪j 通过分析，推测控制小麦p p o 活性的主效基因为1 2 个，同时指 出针对p p o 底物的专化性存在多个等位基因。葛秀秀等【3 1 l 应用植物数量性状基因+ 多基因混合遗传模型，对冬小麦p p o 活性的遗传分析表明，p p o 活性受2 对独立主 基因控制。u d a l l 等1 3 2 。3 3 】利用多种分子标记分析表明，控制p p o 活性的主效基因位于 第二同源染色体( 2 a ，2 b ，2 d ) _ l ，在其它染色体如3 b 、3 d 和6 b 上还存在一些微效 基因。张立平等j 利用中优9 5 0 7 1 7 c a 9 6 3 2 的d h 系进行q t l 定位表明，位于2 a l 和2 d l 上的两个主效q t l 可分别解释p p o 活性变异的5 0 0 和2 9 1 。常成等例 利用中国春的缺体四体材料，将两个p p o 基因( p p o 1 ，p p o 2 ) 分别定位在2 a 和2 d 上。它们均表现出一定的等位变异，在p p o 1 等位基因表现出4 种带型，以a 类型 3 河北农业人学硕士学位( 毕业) 论文 最多；p p o 2 基因变异较为丰富，总共检测出1 3 种带型和一个缺失类型，以d 型为 主【3 5 】。a n d e r s o n 掣2 9 j 利用非整倍体小麦中6 0 6 2 k d p p o 活性的蛋白电泳表现，将p p o 活性的主要控制位点定位在2 d 染色体上。 在分子标记方面，u d a l l 掣3 2 j 找到一个p p o 活性的q t l 标记，j i m e n e z 等幽j 发现 第二同源染色体上的p p o 基因起主要作用，a n d e r s o n l l 6 j 发现r f l p 标记x c d 0 3 7 3 能 反映p p o 活性变异的4 0 。孙道杰等1 3 6 j 用2 0 3 个小麦品种( 系) 验证的s s r 引物 x g w m 3 1 2 ，可以扩增出与高p p o 活性有关的1 9 8 b p 片段，他们根据小麦p p o 活性基 因的c d n a 序列，设计了一个新的s t s 标记p p 0 1 8 ，可在p p o 高和低的小麦品种中 分别扩增出6 8 5b p 和8 7 6 b p 的p c r 片段，1 9 1 b p 的差异发生在p p o 基因的内含子区。 p p 0 1 8 是一个共显性的分子标记，对于面条品质形状的改良是非常可靠有效的1 3 7 j 。 利用d h 群体、缺体四体和双端体将p p 0 1 8 定位于小麦染色体2 a l 上。 1 2q t l 遗传连锁图谱分析 1 2 1q t l 作图的原理及q t l 定位的必要条件 q t l 作图是通过分析整个染色体组的d n a 标记和数量性状表型值的关系，将q t l 逐一定位到连锁群的相应位置，并估计其遗传效应。一般步骤包括：( 1 ) 选择具有相 对性状的纯系进行杂交，获得适宜的作图群体；( 2 ) 检测分离世代群体中每一个体的 标记基因型和数量性状值；( 3 ) 构建遗传连锁图谱；( 4 ) 分析标记基因型和数量性状值 的相互关联，确定q t i 在染色体上的相对位置，并估计q t l 的有关遗传参数。 q t l 定位的必要条件：( 1 ) 在选择亲本时尽可能选择性状表现差异大、亲缘关系较 远的材料，目标性状在群体中分离明显，符合正态分布。( 2 ) 高密度的分子标记连锁 图谱( 标记间平均距离小于1 5 2 0 c m ) 和相应的统计分析软件。 1 2 2 遗传连锁图谱的构建 1 2 2 1q t l 的定位群体 进行q t l 定位分析的首要条件是：获得合适的作图群体，运用在作图群体双亲间 存在多态性的分子标记，构建高密度遗传连锁图谱。q t l 定位的精度在很大程度上取 决于分离群体的重组信息量和遗传图谱的标记饱和度。根据分离群体的特点，作图群 体分为：临时性群体。如f 2 及其衍生的f 3 、f 4 家系、回交群体( b c ) 等。f 2 群体是常 用的临时作图群体，f 2 群体容易构建，且f 2 群体包含亲本任意一个位点的所有基因型， 更适合于估算基因效应和检测不同类型的互作。但f 2 群体的一个不足之处是存在杂合 基因型。对于显性标记，将无法识别显性纯合基因型和杂合基因型。f 2 群体的另一 个缺点是不易长期保存；回交群体每一分离的基因座只有两种基因型，直接反映f 1 代配子的分离比例，因而其作图效率最高，但缺点是不易保存。永久性分离群体。 4 普通小麦多酚氧化酶活性的0 t l 分析 主要包括重组近交系( r i l s ) 、双单倍体群体( d h ) 、回交近交系( b i l s ) 以及近等基因系 ( n i l s ) 。它们共同的特点是系内基因型一致，而系间基因型不同，系间除少数甚至一 个染色体区段存在差异外，其余绝大部分染色体区段完全相同。因此，它们可以把种 子分散到各个不同环境做重复试验以增加q t 啦测的准确性，特别是d h 群体的遗传 结构直接反映了f 1 配子中基因的分离和重组，且基因型是纯合的，有利于q t l i 的精细 定位1 3 引。因此，d h 群体是进行基因作图的理想群体1 3 9 j ，已在小麦q t l 石月：究中得到广 泛应用1 4 0 , 4 1 j 。但是d h 群体也存在不足之处，即产生d h 植株有赖于花培技术，且花培 过程可能对不同基因型的花粉产生选择效应，从而破坏群体的遗传结构，造成较严重 的偏分离现象，另； b d h 群体缺少杂合体，这些都会不同程度地影响作图的准确性【4 2 l 。 1 2 2 2 常用的分子标记 目前q t l 研究所采用的分子标记，主要有基于分子杂交的限制性片段长度多态性 ( r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ，r f l p ) 币0 基于p c r 扩增的随机扩增多态性 ( r a n d o ma m p l i f i e dp o l y m o r p h i cd n a ，r a p o ) 、简单序列重复( s i m p l es e q u e n c e r e p e a t ，s s r ) 、扩增片段长度多态。l 生( a m p l i f i e df r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ，a f l p ) 单核苷酸多态 l 生( s i n e # n u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m ，s n p ) 、表达序列标签( e x p r e s s e d s e q u e n c et a g s ，e s n 等，此外近年来还发展了序列标志位点( s e q u e n c et a g g e ds i t e s ， s t s ) 、反转录转座子分子标记( s e q u e n c e s p e c i f i ca m p l i f i c a t i o np o l y m o r p h i s m s ， s s a p ) 、反转录转座子间扩增多态性( i n t e r r e t r o t r a n s p o s o na m p l i f i e dp o l y m o r p h i s m ， m a r ) 、反转录转座子微卫星扩增多念性( r e t r o t r a n s p o s o n m i c r os a t e l l i t ea m p l i f i c a t i o n p o l y m o r p h i s m ，r e m a p ) 和反转录转座子插入多态性( r e t r ot r a n s p o s o nb a s e d i n s e r t i o np o l y m o r p h i s m s ，r b i p ) 等。其中早期应用最多、分子标记连锁图谱密度最大 的是r f l p 标记，标记多态性高且适应大批量应用的是s s r 标记1 4 3 1 ，最有发展f j 景的 可能是s n p 标记。 1 2 3q t l 定位方法及效应分析 连锁是q t l 定位的遗传基础。q t l 定位就是根据数量性状表型和标记基因型的关 联分析，即应用一定的统计方法，当标记与特定性状连锁时，依据不同标记基因型个 体的表型值存在显著差异，来确定各个数量性状( q t l ) 位点在遗传连锁图上的位置、 效应。q t u 定位方法可分为两大类，一类是基于性状的分析方法( t r a i tb a s e da n a l y s i s ， t b a ) i 4 4 1 ；另一类是基于标记的分析方法( m a r k e rb a s e da n a l y s i s ，m b a ) 【4 5 1 。 1 2 3 1 基于性状的分析方法 基于性