（作物遗传育种专业论文）黄霉素产生菌的菌种选育和发酵工艺研究.pdf

摘要 黄霉素为磷酸多糖类抗生素。是一种新型的抗生素类药物添加剂或促生长剂。以其高效、低 毒和低残留在畜牧业上有着广阔的应用前景。本文研究的主要目的是通过对黄霉素产生菌加纳链 霉菌s g w e 1 i 菌种选育和发酵工艺优化，有望得到几株高产菌株，以不断提高黄霉素产量，为 实现我国饲料工业的高效、优质和低耗做出积极的探索。 根据黄霉素的理化特性和代谢调控原理，运用紫外线、亚硝酸等诱变因子对菌种进行诱变， 并结合自然分离，筛选得到抗自身代谢产物黄霉素和链霉素的高产突变株s g w e 2 5 ，发酵单位 为8 7 5 u m l ，比出发菌株加纳链霉菌s g w e - i l 提高了4 4 倍。对菌株s g w e - 2 5 进行了遗传稳定 性试验，自然分离5 次后斜面传代5 次，结果表明，该菌株具有良好的遗传稳定性。 对菌株s g w e - 2 5 孢子培养工艺进行了研究，从7 种供试培养基中筛选出一种有利于s g w e - 2 5 产孢子的培养基，通过单因素实验研究了斜面培养基培养条件；然后，利用正交实验方法优化液 体种子培养基的配方，通过单因素实验研究了孢子接种龄和接种量对种子生长的影响。结果表明： 1 在2 c m 培养基上，p h 值为7 0 ，3 7 c 恒温培养时，菌株s g w e - 2 5 产孢子量最多，产孢子量为 5 0 4 亿个支斜面2 ，优化的液体种子培养条件为：培养基配方：豆饼粉5 ，玉米粉3 ，葡萄 藉2 5 ，蛋自繇2 ，硫酸铵o 2 。m g s 0 40 ，0 1 5 ，k h 2 p 0 40 0 0 8 r 孢子赞为$ 4 h ，接种量为 1 9 5 亿个5 0 m l 。在优化的培养条件下培养，种子液中d n a 含量达o 5 5 3 9 m l 。 研究了不同碳源、氮源对发酵的影响；利用全因子试验、最陡爬坡试验和响应面法优化 s g w e 2 5 发酵培养基配方，并通过单因素实验优化了发酵培养条件。结果为：优化的发酵培养 基配方：豆饼粉4 6 1 ，玉米粉3 0 1 ，葡萄糖0 4 9 。可溶性淀粉3 ，硫酸铵0 2 硫酸镁 o 0 1 5 ，k h 2 p 0 4o ，0 0 8 ，c , c 0 3o 2 ；优化的发酵条件是：摇床转速2 0 0 r r a i n 、摇瓶装量 5 0 m l 5 0 0 m l 、接种量6 ，温度3 7 ，发酵周期1 6 0 h 、培养基初始p h 为7 5 。在优化的培养条 件下培养，发酵液中黄霉素含量达1 1 4 4 u m l 。 1 0 l 发酵罐优化黄霉素的发酵工艺：搅拌速度3 0 0 r p m ：通气量1 5 v m ：培养温度3 7 1 2 ；发 酵周期1 6 0 h ，需采用聚醚类消泡剂。此条件下，发酵液中黄霉素的效价可达1 2 7 9 u m l 对s g w e - 2 5 菌株1 0 l 发酵罐小试的发酵液浓缩、冷冻干燥后制得黄霉素粗品，对该粗品中 黄霉素各组分进行硅胶柱层折分离提纯，生物活性跟踪和t l c 分析后得到只含单一组分s 2 的结 晶。h p l c 检测该结晶和粗品，色谱图和黄霉素标品的色谱图相对照，发现s 2 组分为黄霉素主 要组分a 。 关键词：抗生素，黄霉素，蕴种选育，工艺优化 a b s t r a c t f l a v o m y c i n ，ak i n do fk e t o s ea n da l d o s ep h o s p h a r e sa n t i b i o t i c s ，i san e wt y p eo fd i g e s t i v e e n h a n c e r t h ed e v e l o p m e n to ft h ep r o d u c th a st h eg o o de c o n o m i ca n ds o c i a lp e r f o r m a n c ef o ri t s e f f e c t i v es a f e t ya n dl o w r u d i m e n t a i i t y i nt h i sp a p e r , w ei m p r o v ep r o d u c t i o no ff l a v o m y c i nb y f l a v o m y c i nr a t i o n a ls c r e e n i n ga n do p t i m i z a t i o no f f e r m e n t a t i o np r o c e s s s a c c o r d i n gt o t h eb i o s y t h e s i s p a t h w a ya n dt h e m e t a b o l i cr e g u l a t i o no ff l a v o m y c i n ，s t r a i n i m p r o v e m e n tw a sp e r f o r m e db ym u t a t i o na n dr a t i o n a ls c r e e n i n gt oi m p r o v et h ep r o d u c t i v i t y t h r o u g h t r e a t m e n tb yr a t i o n a ls c r e e n i n ga n dm u t a g e n ss u c ha su va n dh n 0 2 啦f l a v o m y c i nh i g h - y e i l db t r a i n s g w e 一2 5w a so b t a i n e d p r o d u c t i v i t yo fs t r a i ns g w e 一2 5r e a c h e d8 7 5 u m l ，w h i c hw a s4 4 - t i m e shj i g h e r t h a nt h a to ft h eo r i g i n a lo fs t r a i ns t r e p t o r a y c e s g h a n a e s i sd m s4 0 7 4 6 ( s g w e - 1 1 ) s u b c u l t u r et e s t i n d i c a t e dt h a tt h eh e r e d i t a r yc h a r a c t e ro f s t r a i ns g w e - 2 5w a so f s t a b i l i t y w ei n v e s t i g a t e dt h ec u l t u r ep r o c e s so fs p o r e so fs g w e - 2 5 ，w eh a v es c r e e n e dt h eo p t i u m m e d i u mo f s p o r e s ，t h ep ho f m e d i u ma n dt h ec u l t u r et e m p e r a t u r eb ys i n g l ef a c t o re x p e r i m e n t s t h e n ，t h e s e e dm e d i u mw a so p t i m i z e db yo r t h o g o n a ie x p e r i m e n t s ；t h es p o r et i m ea n ds p o r ei n o c u l u m se f f e c to n s e e dw a ss t u d i e db ys i n g l ef a v o re x p e r i m e n t s t h er e s u l ti n d i c t e dt h a t ：1 t h ec u l t i v a t i o nc o n d i t i o n so f s p o r e so f s g w e - 2 5i s2 c mm e d i u m , 3 7 c p h 7 0 2 t h eo p t i m a lm e d i u mi s5 o f b e a nc a k ep o w e r , 3 o f c o r nf l o u r , 2 5 o f g l u c o s e ，2 o f p e p t o n e ，0 2 o f a m m o n i u ms u l f a t e ，0 0 1 5 o f m g s 0 4 ，0 0 0 8 o f k h 2 p 0 4 , w h c l 3s p o r et i m ei s8 4 ha n ds p o r ei n o c u l u mi s1 9 5 x 1 0 5 0 m l t i l ed n ac o n c e n t r a t i o no f s e e d w a sm a x i m i z e d t h ed n ac o n c e n t r a t i o no f s e e dw a s0 5 5 3 9 m l ， w ei n v e s t i g a t e dc a r b o ns o u i c a a n dn i t r o g e ns o u r c e s , o p t i m i z e dt h ef e r m e n t a t i o nm e d i u ma n dt h e c u l t u r ec o n d i t i o n sr e s p e c t i v e l yb yf u l lf a c t o r i a ld e s i g ne x p e r i m e n t , t h es t e e p e s ta s c e n ts e a r c h e x p e r i m e n t , r e s p o n s es u r f a g em e t h o d o l o g ya n ds i n g l ee x p e r i m e n t s t h eo p t i m a lm e d i u mi s4 6 1 o f b e a nc a k ep o w e r , 3 0 1 o fc o n lf l o u r , 0 4 9 o fg l u c o s e ，3 o fs o l u b l es t a r c h ，0 2 o fa m m o n i u m s u l f a t e , 0 0 1 5 o f m g s 0 4 。0 0 0 8 o f k h 2 p 0 4 ，o 2 o f c a c 0 3 t h eo p t i m u mf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s i s2 0 0 r m i n , 5 0 m lc u l t u r em e d i u mi n5 0 0 m lf l a s k , 6 o fi n o e n i u m , f e r m e n t a t i o nt i m e1 6 0h o u r sa t 3 7 c ，i n i t a t i n gp h 7 5 t h ey i e l do f f l a v o m y c i ni sl1 4 4 u m lu n d e rt h eo p t i m i z e dc u l t i v a t i o nc o n d i t i o n s b y1 0 lb i o r e a c t o r , t h eo p t i m u mf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sw e r ei n v e s t i g a t e d ，a n dt h er e s u l t sw e r e s t i r r i n gs p e e d3 0 0 r p m , a e m t i o n1 5 v m , c u l t u r et e m p e r a t u r e3 7 c ，u s i n gt h ep o l y e t h e rs u b d u e sb u b b l e p h a r m a c y e u t i c a l ，f e r m e n t a t i o n t i m e1 6 0 h t h e t i t e rr e a c h e d1 2 7 9u m l w ec o n d e n s e dt h ef e r m e n t a t i o nb r o t ho ft h e1 0 lb i o r e a c t o ra n dg o tt h ec r u d ep r o d u c to f f l a v a m y c i n ，b ys i l i c ag e l - c o l u m nc h r o m a t o g r a p h y , b i o a s s a ya n dt l ca n a l y s i s ，w eg o tt h ec r y s t a lo fa s i n g l ec o n s t i t u t e ( s 2 ) b yh p l c ，w ee x a m e dt h ec r y s t a la n dc r u d ep r o d u c t w ef o u n dt h a tt h en l a i n c o m p o s i t i o no f e r y s t a l l i s y t i o nw a sf l a v a m y c i na k e y w o r d s ：a n t i b i o t i c s ，f l a v o m y c i n ，r a t i o n a ls c r e e n i n g , f e r m e n t a t i o np r o c e s so p t i m i z a t i o n i l 缩写 a n o 、，a s a s s p s s f f d m 枷a b d 0 2 m 1 c 卯埘 t l c h p l c 缩写说明 英文名称 a n a l y s i so f v a r i a n c e s t a t i s t i c a la n a l y s i ss y s t e m s t a t i s t i c a lp r o d u c ta n ds e r v i c es o l u t i o n s f u l lf a c t o r i a ld e s i g n m a t r i xl a b o r a t o r y d i s s o l v e do x y g e n m m i n i m u mi n h i b i t o r yc o n c e n t r a t i o n v o l a t i l i t yf a t t y a c i d t h i nl a y e rc h r o m a t o g r a p h y h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y 中文名称 方差分析 统计分析系统 统计产品和服务解决方案 全因子试验设计 矩阵实验室 溶解氧浓度。 最低抑茵浓度 挥发性脂肪酸 薄层色谱 高效液相色谱 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经 发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得黑龙江八一农垦大学或其它教育机构的 学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在 论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 孑多农历 时间： 跏7 年多月孑日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解黑龙江八一农垦大学有关保留、使用学位论文的规定，i i ：学校 有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印 或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意黑龙江八一农垦大学可以用不同方式 在不同刊物上发表，传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名： 孑；戮历 时间： 沥7 年歹月蜃日 时间：功哆年，月孚日 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文第一章绪论 第一章绪论 黄霉素( f l a v o m y c i n ) 又称为斑伯霉素b m ( b a m b e r r n y c i n s ) 、黄磷脂醇素f v ( f l a v o p h o s p o l i p 0 1 ) 、默诺霉素a ( m o e n o m y e i n a ) ，商品名为富乐霉素1 1 4 i ，是一种新型的抗生 素类药物添加剂( a n t i b i o t i c sa d d i c t i v e ) 或促生长剂( e n h a n c e r ) 是由l i n d n e r 等人于1 9 5 5 年从 灰绿链霉素菌s b a n b e r g i e n s i s ( 斑伯氏链丝菌) 的发酵产物中分离的磷酸多糖类抗生素1 5 1 。此种 抗生素存在于菌丝体中，可进行提取分离 6 1 。对纯化后的该抗生素进行理化分析表明，它是一种 含磷的糖酯1 7 “，不同于现有的任何一种抗生素。黄霉素抗革兰氏阳性菌活性高，如金黄色葡萄 球菌、链球菌和双球菌等，部分革兰氏阴性菌，如巴氏杆菌、布氏杆菌等也对黄霉素敏感1 5 9 “ ”j 。黄霉素对蜡样芽孢杆菌具有很高的抗菌活性。对真菌病毒等无效。本身无抗原性，该药与其 他用于治疗的常用抗生素之间无交叉耐药性i s l 。 黄霉素作为一种安全、高效的的饲用抗生素，在全球畜禽养殖业中已得到广泛应用。许多学 者对饲用黄霉素影响肠道微生物变化规律以及如何抑制细菌的增殖等方面进行了大量研究，且多 数试验停留在饲养试验水平上，对黄霉素作用机理在分子水平和如何提高黄霉素生产次生代谢产 物的能力的研究较少 目前发酵法生产黄霉素是现在最经济有效的方法，如何提高发酵法生产黄霉素的产量是一个 重要研究课题。本章评述了黄霉素的性质、作用机理、生物学功能、在养殖业中的应用、生产概 况、分离提纯和检测、菌种选育和发酵条件的影响、黄霉素的应用动态及展望，并在此基础上阐 述了本论文的研究内容。 1 1 黄霉素的性质及作用机理 黄霉素用量少，促生长效果显著，无残留，无污染，安全性很高，在西欧、东欧、美国、噩 洲、大洋洲和中东各国都许可使用，特别在欧美各国使用十分普遍，美国肉鸡使用率占3 0 以 上，而且日益广泛，多数国家除去肉鸡和猪之外，还许可用于小牛、育肥牛和蛋鸡2 1 。在我国， 黄霉素的应用刚刚起步，但已显示出十分广阔的前景。 1 1 1 黄霉素的理化特性 黄霉素属弱酸性物质，分子量1 5 8 2 ，经验分子式为c h l o t n 4 0 3 5 p 。结构复杂，至少由5 种 组分组成，即黄霉素a 、组分l 、组分2 、组分3 、组分4 ，其中只有主要组分黄霉素a 的结构 式明确( 结构式如下图) i l ”。纯品为无色无味的非结晶性粉末，易溶于水、甲醇、二甲基酰胺 等小分子物质，不溶于苯、三氯甲烷等其它有机溶剂。在各种条件下都比较稳定，但在强酸或强 碱条件下则易失效。黄霉素无明显熔点，2 0 0 开始分解。粉末和水溶液在室温和中性条件下比 较稳定，此条件下存放两年后其存活率为1 0 0 和9 4 ，但是制粒对黄霉素的破坏可达9 0 以上 1 7 ，| 1 4 1 。黄霉素与其它药物添加剂、维生素和微量元素等无配伍禁忌。 1 1 ，2 黄霉素的作用机理 黑龙扛八一农垦大学硕士学位论文第一章绪论 1 1 2 1 抑菌原理 黄霉素是通过干扰构成细胞壁的结构物质一肽聚糖的生物合成从而抑制这些细菌的繁殖( 肽 聚糖层状结构的毁坏导致了细菌细胞的破裂) 口“5 l 。黄霉素是抑制肽聚糖生物合成最活泼的物 质之一，在极低的剂量下即有作用。同另外一个也作用于细胞壁的抑菌促生长剂杆菌肽的对比， 可以清楚地显示这一点( 详见表1 ) 。具有这种促生长作用方式的抗生素尤其适合用作饲料添加 剂，因为动物细胞上没有与细菌相似的、易受该类抗生素破坏的细胞壁结构，这就是黄霉素非常 高效而又具有良好耐受性的原因盼。 1 1 2 2 促生长原理 黄霉素影响肠道细菌的滋生，使肠道菌群的代谢活动变得有益于动物，间接改善了营养物质 十 黄霉素a 的结构 s m , c n u eo f m o c n o m y c i n a 表1 黄霉素和杆菌肽抑制细胞壁合成的效能 的消化和利用，从而提高了家禽、猪和牛的生长性能和蛋鸡的产蛋性能。 ( 1 ) 黄霉素提高能量和蛋白消化饲料中添加黄霉素，能够把竞争性消耗营养物质的微生物数 量控制在一个生理水平上，从而减少能量和蛋白的消耗，节约能量和蛋白质，并能使肠腔内挥发 性脂肪酸和氨的含量降低，提高氨基酸的消化率一。”j 。据资料表明，黄霉素可提高氨基酸的 消化率5 左右。在反刍动物上，黄霉素能促进可分解淀粉和纤维素的微生物的生长，如琥珀酸 拟杆菌、溶纤维丁酸弧菌和梭状芽孢杆菌，使其分解纤维素的速度提高1 5 。 ( 2 ) 黄霉素能使肠壁变薄，从而提高营养物质的吸收饲喂含黄霉素饲料的动物肠道内细菌毒 2 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文 第一章绪论 素和氨含量降低，从而使肠壁的重量和厚度降低( 氨提高了动物小肠粘膜内核酸和蛋白质的合成， 因而可增加小肠重量) i ，1 “。黄霉素能提高能量、蛋白质、维生素和色素的吸收以及大肠对水分 的吸收，使畜禽的饮水量减少，粪便中含水量也降低1 15 9 1 。 ( 3 ) 黄霉素保护肠道菌群的平衡和瘤胃p h 值稳定应用黄霉素可以使动物保持稳定的肠道菌 群而降低死亡率和增强动物的抗应激能力。另外黄霉素可使瘤胃p h 值稳定在6 _ - 7 的极佳范围， 有利于碳水化合物的分解和蛋白质的生物合成h “2 0 , 2 ”。 1 2 黄霉素作饲料添加剂的生物学功能 ( 1 ) 具有维持肠道内菌群平衡，降低肠壁厚度，促进营养物质吸收和动物生产性能的发挥黄 霉素能促进动物肠道有益微生物的生长繁殖、抑制或杀灭革兰氏阳性菌等有害微生物的繁殖与 生长，又可使畜禽生长。吴龙 2 2 1 ( 1 9 9 1 ) 、沈建忠( 1 9 9 4 ) 均分别报道了黄霉素的上述作用。 ( 2 ) 无配伍禁忌和性能稳定黄霉素与其它抗生( 菌) 素、微量元素等促生长剂无配伍禁忌， 与抗生( 菌) 素也不会产生交叉抗药性，且与之合用对防治畜禽疾病还具有增效作用。同时，黄 霉素在预混剂中混合、制粒等常规加工过程中不会影响其效价：在室温和中性条件下保存2 年， 其活性不下降。 ( 3 ) 使用安全。无副作用黄霉素属大分子物质，其分子量1 5 8 2 ，因而它在消化道中不被吸 收，发挥作用后遂即以原型捧出体外，在机体组织中无残留。排出体外的黄霉素又在土壤被降解， 不被植物吸收。据报道，以l 临床剂量的3 5 0 倍饲喂肉鸡，其各组织中均未测出残留，其它安全系 数高达3 3 0 倍；小白鼠1 2 服l d 5 0 为 o o o o m g k g 。说明黄霉素是一种无残留、无污染、安全的 饲料添加剂。 1 3 黄霉素在养殖业中的应用 1 3 1 畜类养殖 1 ，3 1 1 养牛 黄霉素是一种理想的肉牛饲料添加剂，在喂养肉牛时加入黄霉素，能促进牛瘤胃中分解纤维 素和淀粉的微生物的生长，明显提高肉牛的日增重、饲料转化率以及经济效益。在杂交一代肉牛 的试验结果表明，每日添加4 5 r a g 头剂量的黄霉素，可使牛的日增重提高1 3 2 6 ，精料、租料 和饲料增重比分别下降1 1 5 8 、1 5 2 6 和1 4 4 0 ，经济效益增加2 5 9 8 。在养殖奶牛方面，黄 霉素可增加牛奶产量以及牛奶中脂肪和蛋白质的含量。连续6 5 天给奶牛精饲料中加入6 4 m g k g 的黄霉素，结果使每头奶牛每天多产奶0 5 k g ，乳脂肪和乳蛋白分别增加1 1 8 9 和2 8 9 头奶牛 每天多收入0 8 元。在饲养母牛方面，z a c h w i e j a 等在母牛的预产期4 个星期前开始。每天在每 头母牛的日粮里加入4 0 r a g 黄霉素，结果使母牛对饲料中蛋白质的利用率提高，体重增加，所产 小牛也比不喂黄霉素的对照组个体大而且健康1 4 j 。 1 3 1 2 养猪 采用黄霉素作为猪的饲料添加剂，也有相当好的效果。如饲养仔猪时，在饲料里加入2 0 p p m 3 黑龙扛八一农垦大学硕士学位论文 第一章绪论 的黄霉素，能明显提高仔猪日增重和饲料转化率；黄霉素还能防止仔猪腹泻，提高仔猪的成活率， 从而显著增加饲养者的经济利益【2 4 】。黄霉素在肥育猪的养殖上也有很好的作用，在肥育猪日粮 中加入黄霉素、土霉素、喹乙醇等抗生素药物添加剂，结果显示使用黄霉素对肥育猪的促生长效 果明显优于后两种药物。在三元杂交猪育肥时，将5 m g k g 的黄霉素加入到2 0 0 头试验猪的基础 日粮中，经过1 1 5 天的饲养，每头猪的平均日增重比对照组( 不喂黄霉素) 的平均日增重提高 8 5 6 ，收入平均增加1 4 5 8 元，经济效益提高了1 1 6 4 。 1 3 2 禽类养殖 黄霉素在禽类中应用最多的是肉鸡和蛋鸡的饲养。s a n c h e z 等添加黄霉素在幼龄肉鸡的饲料 中，o 2 1 天龄为4 m g k g ，2 2 4 9 天龄为i o m g k g , 等到为期4 9 天的实验结束时，不同组幼鸡租 蛋白分别增加2 1 5 0 d t a1 8 。在肉鸡日粮里掭加黄霉素5 5 p p m ，能提高增重率9 8 7 ，增加经济 效益2 3 5 在鸡球虫病发生时，饲喂黄霉素可降低发病率和死亡率9 0 左右，而且肉色鲜艳， 鸡肉的品质及口感均有明显的改善在蛋鸡饲养上，大连某养鸡场证明，饲料中添加了5 m g k g 的黄霉素后，可以使蛋料比降低，提高产蛋掣。黄霉素还能使蛋鸡的产蛋日龄提前，产蛋期 延长把黄霉素用作肉鸭、蛋鸭和鸽子的饲料添加剂。效果也相当理想。例如陈婉如等用3 2 0 只1 日龄肉用雌番鸭进行为期1 0 周的饲养试验，试验结果表明，饲科中加入5 m g k g 黄霉素的一 组比不加的对照组，净增重7 7 7 ，料肉比降低5 7 2 ，每只鸭增加收入1 2 2 元，综合经济效益 提高2 9 7 6 纠”。 1 3 3 水产养殖 尽管黄霉素在水产养殖中的应用相对不多，但是它的价值仍值得我们重视。在鲤鱼饲科中添 加4 种浓度的黄霉素，结果显示黄霉素可使鲤鱼体重明显增加，饲料成本下降，其中以2 m g k g 组 下降幅度最大，达到了2 8 7 。张满隆等报道在草鱼饲料中加入黄霉素，可以提高鱼的生长速度， 降低饲料系数，减少其养殖成本：黄霉素还能促进草鱼的营养平衡，使草鱼中蛋白质和租灰分含 量增加，这说明鱼的品质已变得更好，营养价值更高n 除此之外，黄霉素也开始应用于其他水 产品的养殖中，例如鲫鱼、鳗鱼、罗非鱼、虾、鳖等，均取得了令人满意的结果和良好的经济效 益。在鲫鱼的配合饲料中加入0 、2 、4 、8 m g k g 的黄霉素，结果显示后两组均出现明显的增重现 象，说明黄霉素对鲫鱼有着良好的促生长作用 2 6 1 。 除了以上应用最多的四个方面外，近些年黄霉素也应用于其他动物的养殖中如兔的饲养、 绵羊的养殖等。 1 4 黄霉素的生产概况 黄霉素最先由德国赫斯特公司( h o e c h s ta c ) 注册专用于动物饲料添加剂类抗生素，而且 还是一种有效促生长剂在医学和公共卫生方面也很安全。自7 0 年代起，对黄霉素产品进行了实 用性实验，结果表明，使用低浓度剂量就可发挥显著的促生长作用。由于黄霉素的分子量极大 4 黑龙江八一农垦大学颈十学位论文 第章绪论 在动物消化道内不吸收不会在体内和产品中残留，因而公认它是安全的”。2 7 1o 该药具有很好 的稳定性，甚至在制成颗粒饲料时也很少破坏，而且可以和其他饲料添加剂配合使用。黄霉素在 土壤中能被降解，不被植物吸收，对环境无污染，也有人把黄霉素称绿色添加剂，获得世界各国 的高度评价已在世界几十个国家获得使用许可，成为畜牧生产企业提高经济效益的法宝p 1 5 1 黄霉素在我国的使用起步较豌，1 9 9 3 年开始批准荷兰英特威公司( i m e r v e t ) 的黄霉素- 4 0 和 黄霉素一8 0 ( 每千克商品分别含黄霉素4 0 9 和8 0 9 ) 在我国使用，其投放在中国的黄霉素商品名 为“富乐旺”。黄霉紊也是我国1 9 9 7 年发布的允许作饲料药物添加剂的兽药品种及使用规定 中无停药期且产奶期可使用的两种抗菌药之一。黄霉素的饲料添加剂不是纯品形式，而是发酵物 经喷雾干燥的产品与载体的均匀混合物，般选轻质碳酸钙作载体。黄霉素原来仅用作饲料添加 剂，不作为治疗用药i “”j 由于黄霉素杀菌强、安全性高、无毒鄙作用，因此成为目前被欧盟批准使用的四种抗生素类 促生长剂之一。而国外允许在养殖业中使用的含磷糖脂类抗生素只有黄霉素一种“。自从加入 世界贸易组织后，我国农副产品的出口，受到了很大程度的限制，一个重要的原因就是我国产品 的药物残留严重超标，因此我国农业部于2 0 0 2 年6 月发布公告，禁止生产一批高残留、毒性大 的兽药( 包括饲料添加剂) 。9 月农业部又批准黄霉素为新兽药，这说明农副产品的安全生产已 受到我国农业主管部门的高度重视。近年我国浙江海王药业股份有限公司等几家大制药企业，已 经成功研制开发了黄霉素4 和8 预混剂阁。随着近几年来黄霉素生产的国产化，尤其国内的大 型抗生素制药企业进入到动物保健品行业中，黄霉素的产品质量有了大幅度的提高。可以预见。 今后几年内，黄霉素在国内畜牧业生产中的应用将会进入一个持续增长期。 1 5 黄霉素的分离提纯和检测 1 5 1 黄霉素的分离提纯嘲 德国h o e c h s t 公司生产的黄霉素预混合剂2 0 9 ，加入5 0 e 0 醇水溶液浸泡，搅拌后，用n a o h 调至p h8 0 ，8 5 1 2 水浴加热1 5 r a i n ，凉后用盐酸调p h7 0 ，过滤。滤液减压浓缩，浓缩液倒入小 烧杯，加入适量硅胶，拌匀，自然干燥后，装入已用异丙醇：氨水( 9 ：2 ) 预先平衡好的硅胶柱 中( 1 0 0 目硅胶1 1 0 9 ) ，以异丙醇：氨水( 9 ：2 ，8 ：2 ，8 ：3 ) 各9 0 0 m l 分级梯度洗脱。以每份 2 5 m l 进行收集。铡定活性。合并有较强括性的组分，蒸去溶剂，以水溶解，冷冻干燥。获褐色 粉末。取1 5 0 m g 配成2 0 m g m l 水溶液，每次2 0 0 0 l 进样，注入预先用l m l 甲醇冲冼，l m l 蒸 馏水平衡好的i m l ( 3 0 m g ) 规格的w a t e r o a s i s h l be x t r a c t i o n c a r t r i d g e 然后用6 0 z , 腈水溶液 加0 0 5 z 氯乙酸( t f a ) 作为洗脱剂，洗脱活性成分，收集保留时间为2 2 2 3 m i n 的主成分峰， 合并后蒸去溶剂。冷冻干燥，获得纯品 1 5 2 黄霉素的检测方法 黄霉素的定性检测可用薄层色谱法( t l c ) ， 可用紫外吸收法，低含量样品用生物自显影法， 检测范围为0 0 i r a g ，k g - - o i m g k g 。高含量样品 以金黄色葡萄球菌作为试验菌株。定量检测时。 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文 第一章绪论 含量0 5 m g k g - - t 0 0 0 m g k g 的样品用琼脂扩散法，高于1 0 0 0 m g k g 的样品用浊度测定法”3 1 1 1 6 菌种选育和发酵条件的影响 1 6 1 菌种选育 工业微生物的菌种选育在发酵工业中占有重要的地位，是决定该发酵产品能否具有工业化生 产价值及发酵过程成败与否的关键。现代发酵工业之所以如此迅猛发展，除了发酵工艺有改进和 发酵设备的更新之外，更重要的因素是由于进行了菌种的选育和改良而为发酵工业提供了人类需 要的各种类型的突变株。 自从1 9 2 8 年英国的f l e m i n g 首次发现青霉素( p e n i c i l l i n ) ，1 9 4 0 年f o r e 3 , 和c h a i n 成功应用 于临床以来，短短几十年青霉素的研究和生产获得很大发展。依靠菌种选育和工艺革新，青霉素 的产生菌的生产能力从刚发现时的1 2 单位，毫升到目前已达6 0 0 0 0 单位，毫升以上比原始菌株 的产量提高了上千倍至于其他抗生索，通过菌种选育都获得了很大提高 3 2 1 。育种技术可分为 自然分离、经典诱变育种技术和现代生物技术。在自然界中，由于菌种基因自然突变的几率很小， 而且突变往往导致菌种退化，符合生产要求的突变非常难求，因此自然选育是比较缓慢和被动的 过程。同时在自然分离过程中由于菌种的同源基因反复传代，易引起菌种遗传上的退化。因此自 然分离技术目前在工业生产中仅用于维持菌种的优良性状。达到纯化菌种，稳定生产的目的，很 少单独用于菌种选育。 经典的诱变育种技术( 包括物理因子：u v 诱变、磁场处理、r 射线处理、高温和激光处理 等：化学因子：d e s 、c o 、l i c i 、n t g 等) p ”具有速度快、收效大、方法简便等优点，是抗生 素产生茵选育的一种重要方法，但诱变育种缺乏定向性，比较盲从，育种周期长，工作量大。从 5 0 年代末在经典育种的基础上根据微生物遗传和代谢调节的理论发展了一种新的育种技术，实 现人为的定向控制育种，通过打破微生物调节机制，获得各种解除或绕过微生物正常代谢途径的 突变株，从而人为地使有用产物选择性的积累，并且在控制条件下培养，大量的生产这种有用的 产物。使工业微生物育种展示了极为光明的前景p 2 j 。 随着现代生物技术的发展，将目的基因导入宿主菌，进行克隆和表达，从而构建基因工程菌 的报道已有不少，在1 9 5 7 1 9 8 0 年期问瑞士的c i b a 公司，意大利l e p e t i t 研究所、莫斯科全苏抗 生素研究所，以及中国、韩国和日本的几个研究所已经对地中海拟无枝酸菌进行过遗传操作，使 得利福霉素b 的产量提高或可产生活性更高的利福霉素类及其衍生物。在1 9 8 0 年后，采用改进 重组d n a 技术便于进一步对地中海拟无枝酸菌菌株的操作，达到菌种改息的目标。但基因工程 菌用于大规模工业生产的还为数不多，经典的诱变育种仍是目前最重要的遗传育种手段，特别是 对遗传背景不很清楚的对象，诱变育种更是必不可少。对于抗生素生产厂家，理化因子诱变育种 技术和原生质体融合技术是为提高抗生素产量而经常采用的有效方法】 1 6 2 发酵条件的影响 在发酵过程中，培养液中各成分的浓度和类型都会影响黄霉素的生物合成。其中碳氮比是一 6 黑龙江八一农垦大学硕士掌位论文第一章绪论 个关键因素，氮源能促进菌体的生长繁殖，同时要在发酵中流加补充适当的碳源，合适的碳氮比 可以使菌体处于生产黄霉素的最佳状态。黄霉素以葡萄糖和可溶性淀粉作为混合碳源时产量最 高，这可能是因为前期可溶性淀粉为菌体的生长提供能量。而葡萄塘的中间代谢产物能渗入到黄 霉素的分子中去。氩源的类型对菌体生长和黄霉素的产量有较大影响，菌体生长最好的氮源是酵 母抽提物，面黄霉寨生产的最佳氮源是豆饼耪，所以两种氮源复合使用可以使黄霉素的产量得到 大幅度提高。 发酵在好氧条件下进行，搅拌速度在不同时期有所不同。在发酵的第一阶段的搅拌速度是 2 0 0 r p m ，到发酵第二阶段，由于产物及代谢物的积累，产物的产生速率有所下降，故应适当增 加搅拌速度以保持发酵罐内足够的溶解氧水平；同时还要持续地抽去发酵罐中的旧培养液，并以 与之相同的速率向发酵罐中添加新培养液这样就能有效的避免有害代谢物在发酵罐中过度积 累，并能及时地补充新鲜的营养成分。另外，在发酵的中后期，添加的新鲜培养液各营养成分的 浓度应该比原来的培养液有所增加，这样才会比较有利于产物的生成，从而进一步提高产量。 1 7 黄霉素的应用动态及展望 现在，国外许可使用的磷酸多糖类抗生素只有黄霉素各国使用黄霉素的目的一般是促进生 长，改善饲料效率。此外还有消除动物消化道内r 质粒( r - p l m i d ) 耐药菌的作用。与聚醚类 抗生素混合使用，对肉鸡起改善颜色和健肠作用，对蛋鸡起增加产蛋量和减少猝死作用。对成长 缓慢的小猪喂高浓度黄霉素，可促进生长，可消除育肥猪的“厌怠现象”，缓解由于过密饲养而产 生的应激。 黄霉素作为一种安全，高效的饲用抗生素，在全球畜禽养殖业中已得到广泛应用。以前的结 果尚未充分证明饲用黄霉素可给环境卫生和人体健康带来直接危害，但还存在潜在的危险。许多 学者对饲用黄霉素影响肠道微生物变化规律以及如何抑制细菌的增殖等方面进行了大量研究，但 由于各种动物的胃肠条件差异较大，且多数试验停留在饲养试验水平上，对黄霉素作用机理在分 子水平的研究较少。总之，黄霉素的残留问题、提高生产性能机制以及是否引发细菌的抗药性等 问题还有待于深入研究。 1 8 项目的立项依据和主要研究内容 1 & 1 项目的立项依据 本文主要目的是通过菌种选育和发酵条件优化来提高黄霉素生产能力。要大幅度提高菌种的 生产能力，更多地依靠诱交选育。在菌种的选育中，随机筛选易受环境条件的影响工作量很大 而效率却很低，因而有一定的盲目性。而理性化筛选具有定向性、工作量适中和筛选效率高的优 点。本文拟采用物理和化学诱变以及理化筛选和随机筛选相结合的方法进行菌种选育。总而言之， 旨在能得到优质高产黄霉素生产菌株，为实现国内黄霉素工业化生产进行初步探索和研究 1 ，8 2 主要研究内容 7 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文第一章绪论 ( 一) 菌种的诱变筛选 1 ) 筛选因子的浓度筛选 2 ) 各种物理、化学诱变方法的应用 ( 二) 菌种工艺的研究 1 ) 固体斜面培养基的筛选 2 ) 固体斜面培养条件的研究 3 ) 种子培养基工艺研究 4 ) 种子培养基配方的调整和优化 5 ) 种子培养条件的研究 ( 三) 摇瓶发酵工艺的研究 1 ) 不同碳源、氮源对发酵的影响 2 ) 发酵培养基配方的调整和优化 3 ) 研究不同种龄、接种量、p h 、温度和发酵周期等综合因素对黄霉素产量的影响，确定黄 霉素发酵的最佳工艺 4 ) 碳源补加的时间和补加量的探讨 ( 四) 发酵罐发酵工艺的研究 1 ) 发酵罐发酵各种参数的建立 2 ) 对聚醚类消泡剂使用的考察 ( 五) 黄霉素主要组分的分离提纯 1 ) 柱层析流动相的选择 2 ) 柱层析分离效果的检测 3 ) h p l c 检测柱层析结果 3 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文 第二章实验材辩和方法 2 1 实验材料 2 1 1 菌种 第二章实验材料和方法 加纳链霉菌( s t r e p t o m y c e s g h a n a e s i s ) d m s 4 0 7 4 6 ( s g w e - 1 1 ) ，来自德国国家菌种保藏中心。 生物测定指示菌种：金黄葡萄球菌2 6 0 0 3 。 2 2 培养基 斜面和平板培养基：高氏一号培养基( 可溶性淀粉2 0 9 ，k n 0 3l g ，m g s 0 4 7 h 2 00 5 9 ，n a c i o 5 9 ，k 2 h p 0 40 5 9 ，f e s 0 4o 0 1 9 ，琼脂2 0 9 ，定容1 l ，p h7 4 ) ； 初始液体种子培养基：豆饼粉3 0 9 ，玉米粉2 0 9 ，葡萄糖2 5 9 ，蛋白胨2 0 9 ，硫酸铵2 9 ，m 萨0 4 o 1 5 9 ，k h 2 p 0 40 0 $ g ，定容l l ，p h7 2 - - 7 4 ； 初始发酵培养基：玉米粉2 5 9 ，豆饼粉3 5 9 ，可溶性淀粉3 0 9 ，硫酸铵2 9 ，葡萄糖1 0 9 ，硫 酸镁0 1 5 9 ，k h 2 p 0 4o 0 8 9 ，c a t 0 32 9 ，定容l l ，p t - - i7 2 7 4 ； 2 1 3 分离提纯用材料 黄霉素标准品：中国曾医药品监察所( 每l m g 相当于9 5 8 黄霉素单位) ，富乐旺( 含1 0 黄 霉素，德国赫斯特公司生产) ；黄霉素粗品：实验室自制： 2 1 4 原料和试剂 表( 2 i ) 原料和试剂 2 1 5 仪器及设备 9 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文 第二章实验材料和方法 表( 2 - 2 ) 仪器及设备 2 2 分析方法 2 2 1 总糖测定方法 采用3 ，5 二硝基水杨酸法( d n s 法) 嘲 2 2 2 氨态氮的测定法 采用靛酚蓝反应测定法嘲 2 2 3 核酸量的测定 ( 1 ) 取2 m l 发酵液，加$ m l 水，混匀。3 0 0 0 r p m 离心1 5 m i n ： ( 2 )弃上清，在沉淀中加冷的1 0 的三氯乙酸溶液2 m l ，振荡，冰水浴中放置2 - 3 m i n ，3 0 0 0 r p m 离心1 5 r a i n ： ( 3 )弃上清，沉淀中加冷的5 的三氯乙酸溶液2 m l ，混匀，沸水浴中加热3 0 r a i n ，冷却后离 心，3 0 0 0 r p m 离心