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胚胎肝造血干细胞分化为树突状细胞的调控研究 摘要 目的：既往研究发现，小鼠胚胎肝l i n c 一a t + 造血干细胞在体外能分 化为树突状细胞。其分化所需的培养条件除细胞因子g m c s f + s c f + f l t 3 l + n 师仪外，还需要有基质细胞p a 6 的存在。本研究拟探讨在没有 基质细胞p a 6 存在的情况下，胚胎肝l i n c 一舫广造血于细胞能否在体外分 化为树突状细胞，找出决定胚胎肝l i n c k i t + 造血干细胞向树突状细胞分 化的关键因子，并进一步验证其在体内分化为树突状细胞的能力。 材料和方法：采用f a c s 分离小鼠胚胎肝l i n c k i t + 造血干细胞，以 i m d m 培养基调整细胞密度为3 1 0 4 m l ，在细胞因子组合g m c s f + s c f + f l t 3 l 的基础上，单独或联合加入细胞因子i l 3 、几一7 、i l 1 5 ，培 养1 2 1 4 天后，继续用g m c s f + n 师仅刺激3 5 天。观察细胞形态，收 集细胞后荧光染色流式细胞仪分析表型，或在混合淋巴细胞反应中检测 刺激异体c d 4 + t 细胞增殖的能力。接着，分别将b 6l y 5 2 小鼠胚胎肝 或骨髓来源的l i n 。c k i t + 细胞经尾静脉输入致死剂量照射的b 6l y 5 1 受鼠 体内，建立造血重建的嵌合鼠模型。在特定的时间点观察胚胎肝l i n c 一舡广 细胞在体内分化为树突状细胞的能力，比较其与骨髓细胞来源的树突状 上海交通大学医学院博士论文 细胞在表型及功能上的异同；将中和型抗i l 3 或抗i l 7 抗体注射入受鼠 腹腔，观察并比较不同因子对l i n c 一a t + 造血干细胞体内分化为树突状细 胞的影响。 结果：1 ) 在没有基质细胞p a 6 ，仅存在g m c s f + s c f + f l t 3 l + n 师仅 的条件下，i l 3 能诱导胚胎肝l i n c 一肪广细胞分化为树突状细胞，这些树 突状细胞在混合淋巴细胞反应中能刺激初始c d 4 + t 细胞增殖。i l 7 能提 高i l 3 诱导产生的树突状细胞数量，但i l 7 或i l 1 5 均不能诱导胚胎肝 l i n c k i t + 细胞分化为树突状细胞。2 ) 胚胎肝l i n 。c k i t + 细胞输入致死剂 量照射的受鼠后，能够分化为脾脏d c 。这些d c 高表达i a 、c d ll c ，同 时表达中等水平的c d 4 0 、d e c 2 0 5 、t h y l 2 、c d 8 a ；同时发现，胚胎肝 l i n 。c k i t + 细胞能够在体内分化为皮肤郎格罕氏细胞，这些细胞表达 e c a d h e r i n 、i a 、d e c 2 0 5 和t h y1 2 ，但仅表达低水平的c d l lc ，且不表 达c d 8 a 。无论是脾脏还是皮肤的树突状细胞，均能有效刺激t 细胞增 殖。中和型抗i l 3 抗体能抑制胚胎肝来源的l i n c 一a t + 细胞向树突状细胞 分化，而中和型抗i l 7 抗体则不影响胚胎肝l i n c k i t + 细胞在体内向树突 状细胞分化。 结论：1 、胚胎肝l i n c k i t + 造血干细胞在体外没有基质细胞的存在下 能分化为功能性的树突状细胞。 2 、胚胎肝l i n 。c 舫广造血干细胞在体内能分化为树突状细胞。 3 、i l 3 是调控胚胎肝l i n 。c 一兢广造血干细胞在体内外分化为树 上海交通大学医学院博士论文 突状细胞的关键细胞因子。 关键词：树突状细胞，i l 3 ，造血干细胞，胚胎肝 上海交通大学医学院博士论文 g e n e r a t10 n 0 fd e n d riticc e l l sf r o mm u rin ef e t a l liv e r - d e rlv e dh e m a t o p ole tics t e mc e l l s a b s t r a c t o b j e c t i v e ：i th a sb e e nr e p o r t e d t h a t l i n e a g ep h e n o t y p e ( l i n ) c k i t + h e m a t o p o i e t i cs t e mc e l l s ( h s c s ) i s o l a t e df r o md a y13p o s t c o i t u s ( 1 3d r , c ) m u r i n ef e t a ll i v e rc a nd e v e l o pi n t od e n d r i t i cc e l l s ( d c s ) 加v i t r oi nt h e p r e s e n c e o fg m c s f , s c f , f i t 3 la n dt n f x c u l t u r eu n d e rt h e s e c i r c u m s t a n c e si sd e p e n d e n tu p o nt h ep r e s e n c eo fp a 6s t r o m a lc e l l s h o w e v e r , t h ef a c t o r si np a 6s t r o m a lc e l l sr e s p o n s i b l ef o rd c g e n e r a t i o nh a v en o tb e e n d e f i n e d t h e p r e s e n ts t u d y e x a m i n e st h ec y t o k i n e sr e s p o n s i b l ef o rf l h s c - d e r i v e dd cg e n e r a t i o ni nv i t r oi nt h ea b s e n c eo fs t r o m a lc e l l s ，a n d e x p l o r e st h ea b i l i t yo f f ll i n 。c k i t + h s c st og e n e r a t ed c si nv i v o m a t e r i a l sa n dm e t h o d s ：l i n 。c k i t + h s c sw e r ei s o l a t e df r o m13d p c m u r i n ef e t a ll i v e ru s i n gf a cs c e l l sw e r ei n c u b a t e da tac o n c e n t r a t i o no f3 10 4c e l l s m li ni s c o v e sm o d i f i e dd u l b e c c o sm e d i u mi nt h ep r e s e n c eo f g m c s f + s c f + f l t 3 lf o r1 2 1 4d a y s i n t e r l e u k i n ( i l ) - 3 ，i l 一7o ri l 一15w a s 4 上海交通大学医学院博士论文 a d d e da l o n eo rc o m b i n e di n t ot h ec u l t u r e c e l l sw e r er e s t i m u l a t e db y g m - c s f + t n f c tf o ra na d d i t i o n a l3 - 5d a y s t h e s ec u l t u r e dc e l l sw e r e c o l l e c t e dt oa n a l y z et h ep h e n o t y p eu s i n gf a c s ，a n dt od e t e c tt h ea b i l i t yt o s t i m u l a t etc e l l si nm l r n e x t ，w ee s t a b l i s h e dam u r i n ec h i m e r am o d e lo f r e c o n s t i t u t e dh e m a t o p o i e s i sw i t h13d p cf lo ra d u l tb o n em a r r o wl i n c - k i t + h s c s a ti n d i c a t e dt i m ep o i n t s ，w ed e t e c t e dt h ed e v e l o p m e n to fd c si n s p l e e na n ds k i n ，a n da n a l y z e dt h ep h e n o t y p ea n df u n c t i o no fd o n o r - d e r i v e d d c s i ns o m ee x p e r i m e n t s ，n e u t r a l i z i n ga n t i b o d i e st oi l 一3a n d o ri l 一7w e r e i n t r a p e r i t o n e a l l yi n je c t e di n t ot h er e c i p i e n tm i c et o s e et h e i re f f e c t so n l i n c i c i fh s cd e r i v e dd cd e v e l o p m e n t r e s u l t s ：1 ) f ll i n c k i t + h s c sa r es h o w nt od e v e l o pi n t od c s n v i t r oi n t h ea b s e n c eo fs t r o m a lc e l l sw h e ni l - 3i sa d d e dt oac y t o k i n ec o c k t a i l i n c l u d i n gg m - c s f , s c f , f l t 3 la n dt n f 仪t h e s ec u l t u r e dc e l l sc a ns t i m u l a t e t h ep r o l i f e r a t i o no fc d 4 + tc e l l si nm l r i l 一7c a ns i g n i f i c a n t l ya u g m e n tt h i s i l 一3i n d u c t i o n i l 一7o ri l 一15a l o n ed o e sn o ta p p e a rt oh a v eas i g n i f i c a n t i n d u c t i v ee f f e c t 2 ) a f t e ri n t r a v e n o u st r a n s f e ri n t ol e t h a l l yi r r a d i a t e dm i c e ，f l l i n c k t + h s c sc a ng e n e r a t es p l e n i cd c s nv i v o d o n o rd e r i v e ds p l e n i cd c s e x p r e s sh i g hl e v e l so fi a ，c d 1lc ，a n di n t e r m e d i a t el e v e l so fc d 4 0 ，d e c 2 0 5 ， t h y 1 2 t h e s es p l e n i cd c sc a ne f f i c i e n t l ys t i m u l a t etc e l lp r o l i f e r a t i o n n v i t r o d o n o rf lh s c sc a na l s od e v e l o pi n t os k i nl a n g e r h a n sc e l l st h a t 5 上海交通大学医学院博士论文 e x p r e s si a , d e c 2 0 5 ，e - c a d h e r i na n dm a r g i n a l l y , c d 1le s u c hl a n g e r h a n s c e l l s r e a d i l y t a k e u p a n d p r e s e n ta n t i g e n a si n d i c a t e d b y c o n t a c t h y p e r s e n s i t i v i t yr e s p o n s e a n t i i l 一3n e u t r a l i z i n ga n t i b o d yi ss e e nt oi n h i b i t d cg e n e r a t i o nf r o mf lh s c si nc h i m e r i cm i c e ，w h e r e a sa n t i - i l - 7a n t i b o d y t r e a t m e n th a sl i t t l ee f f e c t c o n c l u s i o n ： 1 l i n c k i t + h s c sf r o m13d p cm u r i n ef lc a nd e v e l o pi n t od c s nv i t r o w i t h o u tt h es u p p o r to fs t r o m a lc e l l 2 l i n c k i t + h s c sf r o m13d p cm u r i n ef lc a nd e v e l o pi n t od c s nv i v o 3 i l - 3i sc r u c i a lf o rt h e p r o c e s so ff l h s c d e r i v e dd cd e v e l o p m e n t k e yw o r d s ：d e n d r i t i cc e l l s ，i l 一3 ，h e m a t o p o i e t i cs t e mc e l l s ，f e t a ll i v e r 6 上海交通大学医学院博士论文 缩略词表 p b s ，p h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n e ，磷酸盐缓冲液 m a c s ，m a g n e t i cb e a ds e l e c t i o n ，免疫磁珠分离法 f c s ，f e t a lc a l fs e r u m ，胎牛血清 p e ，p h y c o b i l i p r o t e i n ，藻胆蛋白 f i t c ，f l u o r e s c e i ni s o t h i o c y a n a t e ，异硫氰酸盐荧光素 m l r ，m i x e dl e u k o c y t er e a c t i o n ，混合淋巴细胞反应 c h s ，c o n t a c th y p e r s e n s i t i v i t yr e s p o n s e ，接触性超敏反应 d c ，d e n d r i t i cc e l l ，树突状细胞 l c ，l a n g e r h a n sc e l l ，郎格罕氏细胞 m t t ，3 ( 4 ，5 一d i m e t h y lt h i a z o l y l 2 ) 2 ，5 一d i p h e n y l t e t r a z o l i u mb r o m i d e ，噻唑蓝 m m c ，m i t o m y c i nc ，丝裂霉素 f a c s ，f l u o r e s c e n ta c t i v a t e dc e l ls o r t e r ，流式细胞术 f l ，f e t a ll i v e r ，胚胎肝 a p c ，a n t i g e np r e s e n t i n gc e l l ，抗原递呈细胞 a g m ，a o r t a - g o n a d - m e s o n e p h r o s ，主动脉一性腺中肾 i l ，i n t e d e u k i n ，白介素 h s c ，h e m a t o p o i e t i cs t e mc e l l ，造血干细胞 f t o c ，f e t a lt h y m i co r g a nc u l t u r e ，胚胎胸腺器官培养 a e c ，3 - a m i n o 9 e t h y l c a r b a z o l e ，3 一氨基一9 一乙基咔巴唑 c l a ，c u t a n e o u sl y m p h o c y t ea n t i g e n ，皮肤淋巴细胞抗原 m m p ，m a t r i x m e t a l l o p r o t e i n a s e ，基质金属蛋白酶 上海交通大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立 进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究 做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意 识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名： 日期：细。，年年月2 4 e l 上海交通大学 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同 意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许 论文被查阅和借阅。本人授权上海交通大学可以将本学位论文的全部或 部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制 手段保存和汇编本学位论文。 保密口，在年解密后适用本授权书。 本学位论文属于 | 不保密硇。 ( 请在以上方框内打“”) 学位论文作者签名# 价 指导教师签名： 日期：如，了年群月以日 日期一f 砰廖8 日 上海交通大学医学院博士论文 - 上- - _ 一 刖吾 树突状细胞( d e n d r i t i cc e l l s ，d c ) 是一群高度异质性的细胞，分布在不同的组织 器官，具有不同的表型标志，同时行使不同的免疫功能( 1 ，2 ) 。未成熟d c 低表达共刺 激分子( c d 8 0 、c d 8 6 ) 和黏附分子( c d 4 4 ) ，成熟d c 贝i j 表达高水平的m h c i i 、c d 8 0 、 c d 8 6 、c d 4 0 、c d 4 4 、c d 5 4 、整合素( 1 3 1 、1 3 2 ) 及特征性标记如c d l a 、c d ll c 、c d 8 3 等。d c 是已知功能最强大的抗原递呈细胞( a n t i g e np r e s e n t i n gc e l l ，a p c ) ，能够摄 取、加工并递呈抗原给t 细胞；同时，d c 也是唯一能刺激初始t 细胞活化、增殖的a p c ， 处于启动、调控并维持免疫应答的中心环节。此外，d c 还扮演着诱导免疫耐受的关 键角色。胸腺中d c 摄取少量蛋白抗原并加工处理后将m h c 抗原肽复合物表达于细 胞表面，递呈给胸腺中未成熟的t 细胞，可造成t 细胞的凋亡和失能( 3 ) 。因此，d c 具 有调控免疫应答和诱导免疫耐受的双重作用( 4 6 ) 。胚胎发育时期，d c 可能通过清除 自身反应性t 细胞而诱导耐受，这对于维持机体的稳定起着重要作用。因此，认识d c 在胚胎早期的分化发育对理解机体免疫系统的功能具有指导意义。 通常认为d c 起源于造血干细胞( h e m a t o p o i e t i cs t e mc e l l ，h s c ) ( 7 ) 。在胚胎发 育时期，造血干细胞相继出现在卵黄囊、主动脉性腺中肾( a o r t a - g o n a d m e s o n e p h r o s ， a g m ) 区、胚胎肝、脾脏和骨髓( 8 ) 。骨髓中的造血干细胞与周围的间充质细胞或者 内皮细胞密切接触，其分化发育受此微环境的调控( 9 ) 。尽管骨髓中存在大量的造血 干细胞，然而，骨髓造血主要是满足出生后机体生长发育的需要。在小鼠胚胎发育 时期，胚胎肝常被认为是主要的造血器官。当胚胎发育至第1 0 天，胚胎肝中就出现 了造血干细胞。由于胚胎肝能够提供一个独特的环境，从而使造血干细胞在此不断 扩增，这些数量众多的造血干细胞随后才迁移并定居于骨髓( 1 0 ) 。但直到今天，对胚 胎肝的造血微环境尚不了解，也因此不能很好地研究胚胎肝中造血干细胞的发育分 化。 多年以来已经研究发现，小鼠胚胎肝来源的造血干细胞在体外能分化为t 淋巴细 胞、b 淋巴细胞、n k 细胞、巨噬细胞和d c ( 1 1 1 3 ) 。然而值得注意的是，骨髓来源 9 上海交通大学医学院博士论文 的造血干细胞只需要细胞因子组合g m c s f + n 师0 【+ s c f + f i t 3 l 的刺激就能在体 外分化为d c 。而胚胎肝来源的造血干细胞在体外除了接受上述细胞因子组合的刺 激，还要在同时存在基质细胞p a 6 的情况下，才能够分化为d c 。考虑到在发生过程 中，胚胎肝造血要早于骨髓造血，两者所产生的造血细胞分化程度也不相同，上述 状况可理解为胚胎肝来源的造血干细胞和骨髓来源的造血干细胞在分化为d c 的过 程中需要不同的调节( 环境) 因素。 自从1 9 9 2 年，s c h e i c h e r 等首次发现较小剂量的细胞因子g m c s f 可诱导小鼠骨 髓细胞向d c 分化以来，已经相继发现多种细胞因子在d c 的诱导分化过程中起着重 要作用，g m c s f 、i l 4 、t n f g t 是使骨髓或脐血来源的造血干细胞分化为d c 的最 常见的细胞因子( 1 4 1 8 ) 。i n a b a 等发现小鼠骨髓中的前体细胞在g m c s f 的作用下能 够分化为d c ( 1 5 ) 。c a u x 等发现g m c s f 和耵师0 c 联合应用可诱导人c d 3 4 + 细胞分 化为d c ( 1 9 ) 。他们发现，加入g m c s f 诱导生成的细胞以单核细胞为主，而加入 t n f o t 可增强g m c s f 反应性并能显著促进d c 的产生和成熟。g m c s f 诱导小鼠骨 髓细胞分化的d c 主要表达m h c i i 类分子和c d 8 0 ，不表达c d 8 6 分子。当i l 4 与 g m c s f 联合使用时，能诱导小鼠骨髓细胞分化为同时表达m h c i i 类分子、c d 8 0 、 c d 8 6 等表面分子的相对成熟的d c 。这些体外实验都表明，g m c s f 能刺激前体细 胞分化，是维持d c 分化所需的核心细胞因子，但单独使用g m c s f 只能产生少量 的d c 集落，联合i l 4 、t n f ( t 等细胞因子，则能产生大量具有典型表型及功能的 d c 。 f l t 3 l 是生长因子家族成员，可以刺激造血细胞增殖，动员造血干细胞进入外周 血。b r a s e l 等研究发现，小鼠骨髓细胞在接受大剂量的人重组f l t 3 l 刺激9 天后，能 够分化为d c ，表达c d l l c 、c d 8 6 及m h c i i 类分子( 2 0 ) 。进一步的研究发现，f l t 3 l 能够增加人c d 3 4 + 骨髓前体细胞分化得到的d c 数量。与f i t 3 l 具有类似作用的是 s c f 。s c f 是c 一枷的配体，当s c f 与c 一砌结合后，能增强它们对其他细胞因子促增 殖和分化的反应。f i t 3 l 和s c f 都是对产生最大量的d c 起作用的细胞因子。s z a b o l c s 等已经证实s c f 、g m c s f 和t n f a 可以增强c d 3 4 + 骨髓细胞来源的d c 扩增。而 f l t 3 l 与g m c s f 、i l - 4 、t n f o t 联合应用的作用也得到验证。研究发现，g m c s f + i l 4 1 0 上海交通大学医学院博士论文 诱导外周血单核细胞分化，或用g m c s f + i l - 4 + f l t 3 l 诱导造血干细胞分化扩增后， 继续用t n f t x 刺激能使之分化为成熟d c 。此外，不同来源的前体细胞在不同的培养 基及不同的刺激因子作用下分化得到的d c ，其数量、表型、刺激t 细胞增殖的能力 均有一定差异。这些对比性实验研究更进一步表明不同的细胞因子会对d c 的分化 成熟产生不同的影响。 已有的证据表明，基质细胞p a 6 促进胚胎肝l i n c k i t + 细胞分化为d c ，主要是 依赖于其中的可溶性因子成分。然而，由于其可溶性因子成分复杂，目前尚不能明 确判断到底是哪一种或几种因子对d c 的分化有促进作用。当没有p a 6 存在时，在 g m c s f 、t n f o c 和f i t 3 l 的基础上添加i l - 4 或t g f 3 ，胚胎肝l i n c k t + 细胞同样未 能向d c 分化，提示可能有其他因子参与了d c 分化的过程。近年来的研究表明，除 以上细胞因子以外，i l 3 、i l 6 、i l 7 、i l 1 2 、i l 1 5 等均对d c 的分化具有重要影 响，但它们的作用往往被忽略。结合近几年细胞因子对d c 分化影响的研究，我们 尝试在没有p a 6 的存在下，在体外利用不同的细胞因子组合来诱导胚胎肝l i n c k t + h s c 分化为d c ，分析其表型和功能，寻找诱导胚胎肝l i n - c _ k t + 细胞分化为d c 的 关键细胞因子；进而建立造血重建嵌合鼠模型，观察胚胎肝l i n c 细胞在体内是 否也能够分化为d c ，并比较其与骨髓细胞来源的d c 在表型和功能上的异同，同时 迸一步验证体外诱导分化的细胞因子在体内是否对d c 的分化起着关键作用。以上 研究能够加强对胚胎早期d c 发育分化的理解，有利于认识d c 在免疫系统建立期间 的作用。 上海交通大学医学院博士论文 第一部分胚胎肝造血干细胞分化为树突状细胞的 体外调控研究 既往研究发现，小鼠胚胎肝l i n c k t * 造血干细胞在体外能分化为d c 。其所需 的培养条件除g m c s f + s c f + f l t 3 l - i - t n f 伐外，还需要有基质细胞p a 6 的存在。然 而，基质细胞p a 6 内的成份复杂，难以明晰其中起作用的关键因子。在近年来对d c 诱导分化研究的基础上，本研究拟进一步探讨在没有基质细胞p a 6 存在的情况下， 胚胎肝l i n - c k t + 造血干细胞能否在体外发育为d c ，并找出决定其向d c 分化的关键 因子。 1 材料和方法 1 1 小鼠 c 5 7 b l 6 小鼠、b a l b c 小鼠购自上海斯莱克实验动物有限公司。8 1 0 周龄。动 物饲养于无病原体的动物房。上海交通大学医学院实验动物中心提供设备协助饲养 1 2 主要试剂及仪器 1 2 1 主要试剂 磷酸盐缓冲液( p h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n e ，p b s ) - 9 5 5gp b s 粉剂( g i b c o ，德国) 配制成1 0 0 0m l 溶液，加入2 5 的灭活胎牛血清( f e t a lc a l fs e r u m ，f c s ) ( 杭州四季 青公司) 培养基：i s c o v e sm o d i f i e dd u l b e c c o sm e d i u m ( i m d m ) ( g i b c o ，美国) 重组小鼠细胞因子：g m c s f 、s c f 、t n f o c _ 、f i t 3 l 、i l 3 、i l 7 、i l 1 5 ( r & d ， 美国) 红细胞裂解液：4 1 4 5gn h 4 c 1 、o 5gk h c 0 3 、1 8 6m gn a e d t a ( 上海化学试剂 1 2 上海交通大学医学院博上论文 公司) ，溶于5 0 0 i n l 双蒸水中，p h 值校正至7 4 ，过滤除菌。 抗体：藻胆蛋白( p e ) 标记的抗小鼠i a 抗体，异硫氰酸盐荧光素( f i t c ) 标记 的抗小鼠c d ll e 、c d 8 6 、c d 4 0 、c d 8 a 、c d 3 、c d 4 、b 2 2 0 、g - r - 1 、c d l l a 、c d l l b 、 n k l 1 抗体( b dp h a r m i g e n ，美国) ，f i t c 标记的羊抗大鼠i g gf ( a b ) 2 抗体( c a t a g ， 美国) ；大鼠d e c 2 0 5 抗体( s e r o t e e ，英国) ，e c a d h e r i n 抗体( d a i n i p o np h a r m a c e u t i c a l ， 日本) ； 细胞分离、分选试剂：淋巴细胞分离液f i c o l l ( a x i s s h i e l d ，挪威) ；小鼠c d 4 抗体免疫磁珠( m i l t e n y i ，德国) 其他：氨苄青霉素、链霉素( h y c l o n el a b ，美国) 丝裂霉素( m m c ) ( 协和，日本) 噻唑蓝( m t t ) ( s i g m a ，美国) 吉姆萨染色液( 上海西唐生物，中国) 1 2 2 主要仪器和材料 离心机( h i t a c h i ，日本) ；流式细胞仪( b df a c s a r i a , 美国) ；l s 免疫磁珠分 离柱( m i l t e n y i ，德国) ；免疫磁珠分离支架( m i l t e n y i ，德国) ；倒置显微镜( n i k o n ， 日本) ；c 0 2 培养箱( g b b l 6h e r a u s ，德国) ；酶标仪( t h e r m o ，芬兰) ；培养板 ( c o r n i n g ，美国) 1 3 胚胎肝细胞悬液制备 8 一l o 周龄c 5 7 b l 6 小鼠饲养l 周以适应环境。选择健康雌鼠2 只、雄鼠1 只合 笼2 4 小时，以利于雌性小鼠配种怀孕。合笼2 4 小时后，将雌鼠、雄鼠分笼喂养， 标记雌鼠合笼时间。继续喂养一周左右称体重观察是否怀孕。如果怀孕，则将其合 笼的中间时间确定为受精时间，此时怀孕时间定为0 天。于孕1 3 天处死孕鼠，无菌 操作取出胎鼠，用生理盐水冲洗胎鼠后取出胚胎肝，经2 0 0 目筛网研磨吹打制成单 细胞悬液。1 5m l 离心管中加入3m l 淋巴细胞分离液f i c o l l ，将6m l 细胞悬液缓慢地 加至分离液上层，形成平稳的分界面。在2 0 ，1 8 0 0 转分钟，离心2 0 分钟，并将 离心加速度和离心减速度降至最低。离心结束后，收集低密度层的细胞加p b s 后离 心洗涤，细胞沉淀加入3 5m l 红细胞裂解液，3 7 。c 水浴3 分钟，加入双倍体积以上 上海交通大学医学院博士论文 的p b s 中止，并离心洗涤两次，1 3 0 0 转分钟，4 离心1 0m i n 。用含1 0 f c s 的i m d m 培养基调整细胞浓度为lx 1 0 o l ，用于分离胚胎肝l i n 。c _ k i t + 细胞。 1 4l i n - c - k i t + 细胞分离 将胚胎肝细胞悬液置于流式管，首先加入生物素标记的c 船抗体，4 避光孵育 3 0 分钟，1 3 0 0 转分，洗涤两次；随后加入p e 标记的s t r e p t a v i d i n , 以及一系列f i t c 标记的抗体：c d 3 、c d 4 、c d 8 、b 2 2 0 、g r - 1 、c d ll a 、c d ll b ，混合均匀后，4 避 光孵育3 0 分钟，洗涤两次后细胞重悬，用f a c s 分选l i n c k i t + 细胞( l 计即为： c d 3 。、c d 4 。、c d 8 。、b 2 2 0 。、g r - 1 。、c d l l a 、c d i l b 。) 。分离的细胞重新用f a c s 进 行检测，纯度大约为9 8 。 1 5 体外诱导树突状细胞 将分离出的小鼠胚胎肝l i n c 彬细胞调整浓度为3x1 0 4 m l 接种于2 4 孔板，基 础培养体系为：加入2 0 f c s 的i m d m 培养基，庆大霉素( 1 0 0u r n l ) ，链霉素( 1 0 0 i _ t g m 1 ) ，g m - c s f ( 4n g m 1 ) ，s c f ( 1 0n g m 1 ) ，f l t 3 l ( 1 0n g m 1 ) 。在此基础上，分 别单独或联合添加不同的细胞因子：i l - 3 ( 1 0n g m 1 ) ，i l 一7 ( 1 0n g m 1 ) ，i l 1 5 ( 2 0 n g m 1 ) 。每2 3 天半量换液，添加新鲜细胞因子。培养1 2 1 4 天后，继续添加细胞因 子g m c s f ( 4n g m 1 ) 和t n f c t ( 5 0n g m 1 ) ，继续培养3 至5 天，倒置显微镜下观 察细胞形态。收集悬浮和轻微黏附的细胞以待进一步分析。在某些实验中，我们采 用p a 6 诱导l i n - c - k i t + 细胞分化为d c 。 1 6c d 4 + t 细胞分离 将b a b l c 小鼠颈椎脱臼法处死，双蒸水冲洗后浸泡于7 5 酒精3 5 分钟。分离 脾脏，将组织经2 0 0 目筛网研磨、吹打制成单细胞悬液。1 5m l 离心管中加入3m l 淋巴细胞分离液f i c o l l ，将6m l 细胞悬液缓慢地加至分离液上层，形成平稳的分界 面。在2 0 ，1 8 0 0 转分钟，离心2 0 分钟，并将离心加速度和离心减速度降至最低。 离心结束后，吸取中间白膜层，加p b s 后离心洗涤，1 3 0 0 转分钟，4 ，离心1 0 分钟。洗涤后重悬计数。采用免疫磁珠分选法( m a g n e t i cb e a ds e l e c t i o n ，m a c s ) 阳性 分选c d 4 + t 细胞。根据细胞计数以每1 1 0 7 个细胞加入l o “l 免疫磁珠的比例，加 入抗小鼠c d 4 免疫磁珠，反应体系为5 0 0g l 1 1 0 8 细胞。6 1 2 充分避光孵育1 5 1 4 上海交通大学医学院博士论文 分钟，其间弹震数次以利充分反应。p b s 离心洗涤1 次后重悬。l s 磁珠分离柱嵌入 分离架中，3m l 缓冲液润洗分离柱后加入细胞悬液，待液体完全过柱，加入3m l 缓 冲液洗涤分离柱3 次。将分离柱卸下，加入5m l 缓冲液，用活塞将液体一次推入收 集管中，获得c d 4 + t 细胞，洗涤两次后细胞计数，重悬并置于冰盒内保存。 1 7 流式细胞仪分析 调整细胞浓度为4 1 0 5 5 0i l l ，置于流式管内，加上p e 标记的i a 抗体，同时加 入f i t c 标记的c d l l e ，或c d 8 6 、c d 4 0 、c d 8 、n k l 1 抗体，避光4 孵育3 0 分钟， 洗涤2 次后用4 0 0 “lp b s 重悬；标记e c a d h e r i n 或d e c 2 0 5 时，首先与纯化的大鼠 d e c - 2 0 5 或e - c a d h e r i n 一抗孵育，然后结合f i t c 标记的羊抗大鼠i g gf ( a b 7 ) 2 二抗。 在进行三色分析时，细胞尚需与生物素标记的l y 5 2 抗体结合，而后连接a p c 标记 的s t r e p t a v i d i n 。以相同类型荧光标记的i g g 作为同型对照。 1 8 混合淋巴细胞反应 收集d c 后用丝裂霉素( 1 5i _ t g m 1 ) 3 7 。c 处理3 0 分钟，p b s 洗涤2 次后作为刺 激细胞( 1 0 0 3 1 0 4 孔) 。采用m a c s 分离的c d 4 + t 细胞作为效应细胞( 3 1 0 5 孔) ， 接种于u 底9 6 孔板，在2 0 0g l 培养基中培养5 天，恒温箱培养条件为3 7 。c ，5 c 0 2 ， 饱和湿度。第5 天加入1 5l x lm t t ( 5m g m l 溶于p b s ) ，3 7 。c 孵育4 小时。酶标仪 5 5 0 n m 读取光吸收值。 1 9 统计学分析 数据以均数标准差表示，通过s t u d e n t st 检验进行分析，多组间的比较通过 方差分析( a n a l y s i so f v a r i a l i c e ，a n o v a ) 或是k r u s k a l w a l l i st e s t 分析。当p 值小于 0 0 5 时认为存在显著统计学差异。 2 。结果 2 1il - 3 诱导胚胎肝l n - c 咕，f 造血干细胞分化为d c 在没有基质细胞p a 6 存在的情况下，体外将胚胎肝l i n c 一彬造血干细胞在以下 1 5 上海变通大学医学院博论文 细胞因子存在的条件下培养：g m c s f + s c f + f i t 3 l + 1 l - 3 + i l 一7 + i l 一1 5 。我们发现， 培养至第4 天，培养板中的贴壁细胞逐渐悬浮；继续培养后，悬浮细胞渐渐增多， 且细胞变大；培养至1 2 1 4 天，大量细胞悬浮并形成集落。此时加入g m c s f 和n m a 继续培养3 5 天。镜下观察发现细胞形态不规则，胞质丰富，周边有小突起( 图i a ) ， 呈现典型的d c 形态。收集细胞悬液并富集后，涂片自然干燥，进行吉姆萨染色， 倒置显微镜下可见细胞有明显的毛刺状突起，部分核偏位且不规则，部分细胞含有 双核( 图i b ) 。 黼 b 图l 倒王显微镜下细胞彤态观察 说明：胚胎肝l i n c - m t * 造血干细胞在g m - c s f + s c f + f i t 3 l 的培齐体系中，加入i l 3 ，i l 7 、 i l 一1 5 培养1 2 1 4 天，继续加八g m c s f + t n f q 培养3 - 5 天。( a ) 细胞形态不规则，聚集成簇， 周边有小突起x4 0 0 ；( b ) 吉姆萨袭色，细胞有明显的毛刺状突起，部分桉偏位且不规则，部 分细胞含有双核x40 0 。 上海交通大学医学院博士论文 收集悬浮和轻度贴壁细胞，染色后流式细胞仪上机分析i a + 的细胞。结果显示这 些i 矿的细胞高表达细胞表面分子c d 8 6 、c d l l c 、c d 4 0 和d e c 2 0 5 ，同时表达一定水 平的e c a d h e f i n ，然而，c d 8 a 和n k l 1 的表达却很少( 图2 ) 。c d 8 6 和c d 4 0 为d c 表面的共刺激分子，未成熟d c 通常低表达c d 8 6 和c d 4 0 。而成熟的d c 则高表达这 些共刺激分子。由此提示，在没有基质细胞p a 6 存在的情况下，我们成功由胚胎肝 l i n c _ k t + 细胞诱导分化出成熟的d c 。 n k l 1 c d 8 a e - c a d h e r i n c d 4 0 d e c 2 0 5 c d l l c c d 8 6 01 02 03 0 4 0 5 0 ( p o s i t i v e ，均 图2 流式细胞仪分析d c 表型 说明：胚胎肝l i n 。c k t + 造血干细胞在g m c s f + s c f + f i t 3 l4 - i l 3 + i l 7 + i l 1 5 的培养体系中， 培养1 2 1 4 天，继续加入g m c s f4 - t n f c t , 培养3 5 天。收集悬浮和轻度贴壁细胞，荧光染色后 流式细胞仪分析l a * 的细胞。 1 7 揖空速大学k 学院嶙十论立 为了确定i l 3 、i l 7 和i l 1 5 这乏种细胞因子中，哪一种或哪几种细胞因子对于 胚胎肝l i n c - k t * 细胞向d c 分化更为重要，我们对这三种因子分别进行了分析。结 果发现，当g m c s f + s c f + f i t 3 l 的基础培养体系中只加入i l 7 或i l - 1 5 ，培养1 2 1 4 天后同样添加g m c s f 和t n f c t 继续培养3 - 5 天，培养扳中未见明显集落形成