（内科学专业论文）以herg基因表达模型为基础的药物在心脏复极方面的安全性评价.pdf

目录 缩略词表l 中文摘要3 英文摘要7 前言1 1 论文正文 第一部分：h e r g h e k 2 9 3 细胞表达模型的建立1 3 材料和方法 药品和试剂1 4 主要实验设备及器材1 6 溶液配制一1 8 细胞电生理研究1 8 细胞培养与转染1 8 膜片钳实验2 2 免疫蛋白印记实验2 4 细胞总蛋白提取及浓度测定2 4 试剂配制2 5 蛋白质的聚丙稀酰胺凝胶电泳2 8 蛋白质转膜3 0 免疫反应及显影3 l 结果3 2 讨 念3 6 参考文献4 0 第二部分：西沙比利对h e r g 基因转染的通道电流和蛋白表达的作用4 4 材料和方法4 4 结果4 7 讨 仑5 2 参考文献5 8 第三部分：关附甲素对h e r g 通道电流和蛋白表达的影响6 l 材料和方法6 2 结果6 5 l 关附甲素对野生型h e r g h e k 2 9 3 细胞上h e l 电流的影响6 5 2 关附甲素对h e r g 基因f 6 5 6 c 突变钾通道电流影响7 5 3 关附甲素对h e i 通道蛋白表达的影响7 7 讨论j 8 0 局限性8 3 总结与展望：8 4 参考文献8 4 论文综述h e r g 钾通道电流对药物致q t 间期延长的评价作用8 8 参考文献：1 0 5 个人简历“o 致谢1 1 2 独创性声明1 1 4 学位论文版权使用授权书1 1 4 北京协和医学院中国医学科学院博上研究生学位论文 英文缩写 a h h a p d d m e m g f a g f p h e k 2 9 3 h e r g h e r g h e k 2 9 3 i c 5 0 糸， k 。 i vc u r v e k k c n h 2 l q t s t d p v i 2 v t w b 缩略词表 英文全称中文全称 a c e h y t i s i n eh y d r o c h l o r i d e盐酸关附甲素 a c t i o np o t e n t i a ld u r a t i o n动作电位时程 d u l b e c c o sm o d i f i e de a g l em e d i 啪d m e m 培养基 g u a i l 如b a s e a关附甲素 ( h e nn u o r e s c e n tp r o t e i l l绿色荧光蛋白 h u m a ne m b 巧o i l i ch d n e y2 9 3人胚肾2 9 3 细胞 h 啪a n p 砌p ，- 口喀d 鼍r d 陀肠胞dg e n e h e r g 基因 转染h e r g 基因的 h e k 2 9 3 细胞 5 0 i i l h i b i t o 巧c o n c e n 缸眦i o n半数最大抑制浓度 r a p i da c t i v a t i n gd e l a y e dr e c t i f i e r 快速激活延迟整流钾电流 p o t a s s i u mc u r r e n t s l o w a c t i v a t i n gd e l a y e dr e c t i f i e r 缓慢激活延迟整流钾电流 p o t a s s i u mc u r r e n t c u n - e n t v o l t a g ec u r v e 电流- 电压关系曲线 s l o pf a c t o r 斜率因子 k c n h 2 基因 l o n gq ts y n d r o m e长q t 综合征 t o r s a d ed ep o i n t e s尖端扭转性室性心动过速 h a l f a c t i v a t i o nv o l t a g e半数最大激活电压 t e s tp o t e n t i a l 测试电压 w r e s t e mb l o t 免疫蛋白印迹技术 2 北京协和医学院中国医学科学院博_ 上研究生学位论文 以h e r g 基因表达模型为基础的药物在心脏复极方面的 安全性评价 中文摘要 药物致q t 问期延长的副作用已成为威胁公众用药安全的重要问题，也是目 前药物安全管理部门和药物公司广泛关注的药物心脏毒性问题。很多药物可以通 过直接阻断心肌复极中的快速激活延迟整流钾通道电流( 如) ，使得复极时程延 长，导致q t 间期延长，甚至发生尖端扭转性室性心动过速或心源性猝死；也可 以通过干扰钾通道蛋白的表达，间接减少k ，使得q t 延长。药物对心脏复极的 不良影响成为美国食品和药品管理局( f d a ) 终止药品上市的主要原因之一，并 要求所有药物上市前必须进行这方面的评价。对，k r 电流的测定成为判断药物是否 能引起q t 延长及是否易产生促心律失常作用的一个指标。因此，本研究拟从细 胞离子通道、蛋白水平上建立一套临床前在体外评价药物对心脏复极影响的方 法，并应用药物进行评估。据此，本研究设计了三个分实验。 第一部分：建立表达h e r g 基因的h e i q 9 3 细胞模型，并培养出稳定转染 的h e r g h e k 2 9 3 细胞株； 第二部分：用己知导致q t 间期延长的药物西沙比利来测定该药对h e r g 通道电流的影响，进一步明确该通道的特性，并评价西沙比利对h e r g 通道蛋 白的影响： 第三部分：评价我国的一类抗心律失常新药盐酸关附甲素对h e i 通 道电流、通道动力学的影响，并对h e r g 基因f 6 5 6 c 突变后的电流进行测定， 明确药物与h e l 通道结合位点；应用免疫蛋白印迹技术( w | e s t e mb l o t ) 评价 关附甲素对蛋白表达的影响。 第一部分：h e r g h e k 2 9 3 细胞表达模型的建立 【摘要】 目的：通过基因转染的方法把h e r g 基因转染进h e l q 9 3 细胞，使之表达h e r g 通道钾电流及蛋白，达到建立h e r g h e k 2 9 3 细胞表达模型的目的。 北京协和医学院中国医学科学院博上研究生学位论文 方法：利用l i p o f e c t a m i n e t m 2 0 0 0 将p c d n a 3 0 h e r g 和绿色荧光蛋白( g f p ) 瞬 时转染进入h e k 2 9 3 细胞，利用膜片钳技术测定h e i 沁h e k 2 9 3 细胞上的h e r g 钾电流；应用g 4 1 8 对瞬时转染的阳性克隆细胞进行筛选，进而利用免疫蛋白印 迹技术( w e s t e mb l o t ) 测定h e r g h e k 2 9 3 细胞的h e r g 蛋白的表达。 结果：l i p o f e c t a m i n e t m 2 0 0 0 介导的瞬时转染成功率在3 0 7 0 ，该方法有效地将 h e r g 基因转染进入h e k 2 9 3 细胞，并表达h e r g 介导h e r g 通道钾电流；g 4 1 8 可成功筛选h e r g 基因阳性的克隆细胞，使得瞬时转染的h e r g h e k 2 9 3 细胞达 到稳定转染，并可用于w r e s t e mb l o t 的研究。 结论：荧光显微镜检查、膜片钳及w e s t e mb l o t 研究证实该h e l h e k 2 9 3 细胞 表达模型的建立成功的。 关键词：h e r g 基因；膜片钳；离子通道；钾通道；人胚肾2 9 3 细胞；免 疫蛋白印迹； 第二部分：西沙比利对h e r g 基因表达的快速激活延迟整流钾通道电流 及蛋白的影响 【摘要】 目的评价西沙比利对转染h e r g 基因表达的快速激活延迟整流钾电流( k ，) 和 蛋白的影响，探讨其致心律失常发生的机制。 方法使用脂质体介导的瞬时转染法把野生型h e r g 基因转染进人胚肾细胞 ( h e k 2 9 3 ) ，采用全细胞膜片钳技术评价西沙比利对砧通道电流和动力学的影 响；使用g 4 1 8 筛选出稳定转染h e r g 的细胞，并用西沙比利进行干预，应用免 疫蛋白印迹技术( 、s t e mb l o t ) 评价药物对蛋白的影响。 结果西沙比利对k ，通道的刺激电流( 如e r g ) 和尾电流( 如i ) 具有浓度和电压依 赖性抑制作用，半数最大抑制浓度( i c 5 0 ) 分别1 4 5 和3 9 啪。儿。西沙比利使 如e r g 和l 的最大峰值电位前移，但不改变激活电位；使激活曲线左移并加快通 道的失活，但不改变通道失活后的恢复时间；西沙比利对h e r g h e k 2 9 3 细胞上 的爪，通道蛋白无明显抑制。 结论西沙比利通过作用于通道的激活态及失活态抑制h e r g 钾电流，但不影响 h e r g 通道蛋白的表达，从而使得心肌复极时程延长，导致心律失常发生。 4 北京协和医学院中国医学科学院 博上研究生学位论文 【关键词】膜片钳；西沙比利；离子通道；钾通道；h e i 沁基因；人 胚肾细胞；免疫蛋白印迹 第三部分：关附甲素对转染h e r g 基因表达的快速激活延迟整流 钾通道电流和蛋白的影响 【摘要】 目的评价关附甲素( g f a ) 对h e r g 基因表达的钾通道电流和蛋白的影响。 方法使用脂质体介导的瞬时转染法把野生型h e r g 基因转染入人胚肾细胞 ( h e k 2 9 3 ) ，使之表达快速激活延迟整流钾电流( 砧) ，采用标准的全细胞膜片 钳技术记录k ，通道电流，观察不同浓度的关附甲素对砧的影响并进行通道动力学 研究。采用定点突变技术使h e r g 基因产生f 6 5 6 c 突变，并应用膜片钳进行药物 对电流影响的测定。应用免疫蛋白印迹技术( w r e s t e mb l o t ) 评价关附甲素对h e r g 钾通道蛋白的影响。 结果 1 关附甲素对糸，通道的峰电流用e r g 具有浓度和电压依赖性抑制作用，半数最大 抑制浓度( i c 5 0 ) 为4 6 5 9 5 呻1 0 l l ；4 0 0 p m o l l 和1 0 0 0 弘m o 儿的关附甲素使h e r g 的最大峰值电位前移，但不改变激活电位。2 5 4 0 0 脚o l l 的关附甲素对尾电 流( 1 ) 抑制不明显，l 、2 5 和5 m m o l 几的关附甲素对抑制率分别为3 4 9 、 5 8 o 和7 0 5 ，i c 5 0 为1 6 4 m m o l l 。1 r 姗o l l 的关附甲素对磊。i l 呈电压依赖 性，并使得最大峰值电位前移，电流一电压曲线的形状产生变化，但对激活电 位没有影响。关附甲素对h e r g 通道电流的抑制无时间依赖性。 2 关附甲素可以使得通道的激活曲线左移并能加快通道的失活过程，并且能在 6 0 m v 的电压上减慢通道失活后的恢复时间，而对去激活时间常数无明显影 响。 3 关附甲素对f 6 5 6 c 突变的h e r g 通道峰电流( 如e r g ) 和尾电流( 五。i i ) 具有抑 制效应，但抑制程度比野生型h e r g 电流明显减弱，并使得激活曲线左移。 4 高浓度的关附甲素可抑制h e r g 钾通道蛋白的转运，且对f 6 5 6 c 突变表达的 h e i 砸钾通道蛋白抑制更明显。 结论2 5 4 0 0 p m o l l 的关附甲素对砧的抑制作用不明显，高浓度的关附甲素可以 北京协和医学院中国医学型兰堕 堡兰堕垄竺兰垡兰兰一一一 抑制髓i 沁电流，关附甲素主要是作用于h e i 沿通道的失活态和激活态，并且主 要是结合在h e r g 通道的s 6 区从而抑制钾电流。关附甲素不影响h e r g 蛋白的合 成，但高浓度的关附甲素可抑制h e r g 蛋白的转运。 【关键词】膜片钳；关附甲素；离子通道；钾通道； h e r g 基因；人 胚肾细胞 6 北京协和医学院中国医学科学院博士研究生学位论史 t h e d r u g ss a f b 锣e v a l u a t i o no nt h ec a r d i a cr e p o l a r 娩a t i o n ：a n 伽v f 打移 s t u d yb a s e d o nt h eh e r g g e n ee x p r e s s i o nm o d e l a b s t r a c t d r u g - i n d u c e dq ti n t e r v a lp r o l o n g a t i o nh 弱b e c o m e 锄i m p o r t a n tp u b l i ch e a l n l p r o b l e m a n dd m gs a f - e 够a u t h o u i t i e sa 1 1 dd m gc o m p a i l i e sp a ym o r ea n dm o r e a n e n t i o nt ot h ed r u gc a r d i a ct o x i c i 妙m 锄yd m g si n d u c e dq ti n t e r v a lp r o l o n g a t i o n b yd i r e c t l yb l o c k e dt 1 1 e t h er a p i d l ya c t i v a t i n gd e l a y e dr e c t i f i e rp o t 弱s i 啪c u r t e n t ( k r ) b e s i d e s ，o m e rd 1 1 j g sc a i li i l l l i b i tp o t a l s s i u mc h a n l l e lp r o t e i i le x p r e s s i o n ，w h i c h i n d i r e c tr e d u c e 砧1 1 1 d e e d ，m a i l yd 1 1 l g sh a v eb e e nw i 廿l d r a 、硼f r o mn l em a r k e tb y f d ab e c a u s et h e yl e a dt ol o n gq ts y n d r o m ea n dv e n t r i c u l a ra r r h y t h m i a s r e g u l a t o 巧 g u i d e l i n e s 【c p m p 9 8 6 9 6 ( 19 9 7 ) a n di c hs 7 b ( 2 0 0 5 ) 】r e c o m m e n dc o n d u c t i n g p r e c l i n i c a l 砌v 如da n d 砌v f f ms t u d i e st 0d e t e c t t l l e q t - p r o l o n 舀n ge f r e c t sa n d 踟瞪h y t l n o g e n i cp o t e n t i a lo fn e wd m g s t h ei n v e s t i g a t i o no f 砧h 2 u sb e c o m e 被i n d i c a t o rf o rw h e t h e rm ed n l gc a i lc a u s e q ti n t e r v a ip r o l o n g a t i o na 1 1 dp r o a r r h y t i a t h ep r e s e n t 咖d yi st ob u i l du pa n 加 1 ，伽dm e m o dt od e t e c t 也eq t - p r o l o n g i n ge f r e c t sb a s eo ni o nc h a m e lc u r r e n t sa n d p r o t e i ne x p r e s s i o n ，a 1 1 dm e ne v a l u a t ed m g se 廊c t s t 1 1 e 咖d yi sd i v i d e di n t ot h r e e p a n s p a r t1 t bb u i l du pah e r g - h e k 2 9 3c e l lm o d e lb y 仃a n s f e c t e do fh e r gg e n e i n t o 艇k 2 9 3 ，a n db u i l du pas 伽l yt r a n s f e c t e d 舵r g - h e k2 9 3c e l l sl i i l e p a r t2 t 0e v a l u a t et i l e e l e c 仃o p h y s i o g i c a le 虢c t so fc i s 印砌eo nt 1 1 e 砷i d l y a c t i v a t i n gd e l a y e dr e c t i f i e rp o t a s s i 啪c u r r e n t ( ，k r ) e n c o d e db yt i l eh e r gg e n ew i t ha w h o l e - c e np a t c hc l 锄pt e c 王l i q u e ，a n ds m d yt l l ee 腩c t so fc i s 印r i d e0 nt i l eh e r g p r o t e i n 仃a m c 心n gb yw e s t e m b l o ta i l a l y s i s p a n3 t oi n v e s t i g a t et h ee f f e c t so fg u a n f ub a s ea ( g f a ) o nt h e 锄p l i t u d e ， c o n c e n t r a t i o na 1 1 dv o l t a g ed e p e n d e n c e ，锄dt h ek i n e t i c so fh e r gc u r r e n t a nh e r g m u t a i l ta tt l l i sp o s i t i o nf 6 5 6 c ，w a sa l s oe v a l u a t e di nt 1 1 i ss t u d y t h eh e r gc u r r e n t w a sm e a s u r e db yt h ew h o l e c e l lp a t c hc l a i i l pm e t h o d t h ee 跪c t so fg f ao nh e r g p r o t e i nt r a 衔c k i n gw e r ei n v e s t i g a t e db yw e s t e mb l o ta n a l y s i s 7 北京协和医学院中国医学科学院 博上研究生学位论文 p a r t1 t h et r a n s f e c t i o no fh e r gg e n ei n t oh e k 2 9 3a n dt h e c e n i f i c a t i o no fh e r gc h a n n e lc u r r e n t sa n dp m t e i n l a b s t r a c t l o b j e c 晰e ：t os e tu p 恤h e r g - h e 勉9 3 c e l ll i n eb y 仃a r i s f e c t e dh e r g g e n ei n t o h e k 2 9 3c e l l s ，柚c hc a i le x p r e s st h et l l er 印i d l ya c t i v a t i n gd e l a y e d r e c t i f i e rk _ c 嗽n t 陬r ) a n dh e r gp r o t e i n m e t h o d s ：t i l eh e k 2 9 3c e i l s 、v e r et m s i e n tt r a j l s 佗c t e db yt l l ep c d n a 3 o h e i 沁 g e n e 锄dg r e e nf l u o r e s c i i lp r o t e i n ( g f p ) u s i n gl i p o f e c t a m i n e2 0 0 0 ，a n dt h e 垴、；l 傩 m e 2 l s u r c d b yw h o l ec e l lp a t c hc l a n l pt e c l l n i q u e s n l e ns c r e e nb yg 4 18t oa c h i e v e s t a b l et m s f e c t i o n ，a n dt h eh e r gc h a i l l l e lp r o t e i nw a sd e t e c t e db yt h ew e s t e mb 1 0 t a n a i y s i s r e s u l t s ：l i p o f e c t 锄i n e2 0 0 0c a n 仃a i l s f e c t e dt h ep c d n a 3 0 一h e r gg e n ei n t h h e k 2 9 3c e l l sa n dt l l et m s i e n tt m s f e c t i o ne 衔c i e n c yw 硒b e t 、v e e n3 0 一7 0 p a t c h c l a m ps t u d yc o n f i m e dt h a th e r gg e n ee x p r e s s e d ，k r g 4 l8c a i lb es u c c e s s m l l y s c r e e n e dh e r g h e k 2 9 3p o s i t i v ec l o n ec e l l s ，m a k i n gm ec e l l ss t a b l ee x p r e s s e d h e r g p r o t e i na n dc a j lb eu s e df o rw e s t e mb l o ts t u d y c o n c l u s i o n s ：b o t ht 王1 ep a t c hc 1 锄ps t u d ya n dw | e s t e mb 1 0 ta n a l y s i sp r o v et h a tt h i si s 觚e 俄c t i v em e t h o df o rt m s f e c t i n g 此h e r gg e n ei n t 0h e k 2 9 3a n de x p r e s s i n gt h e h e r gc h a n n e lc u r r e n t sa n dp r o t e i l l 【k e yw o r d s 】h e r gg e n e ； p a t c hc l 锄p ；i o nc h a n n e l ；p o t a s s i 啪c h a 埘1 e l ； h u m 孤e m b 巧o n i c 妯d n e y ( h e k 2 9 3 ) c e l l s ；w 色s t e mb l o t p a n2 t h ee f 耗c t so fc i s a p r i d eo nt h eh e r gk 。c h a n n e lc u r r e n ta n dp r o t e i n t r a m c “n g 【a b s t 髓c t 】 o b j e c “v e t oe v a l u a t et l l ee l e c 仃o p h y s i o g i c a le 虢c t so fc i s a p r i d e0 nm er a p i d l y a c t i v a t i n gd e l a y e dr e c t i f l e rp o t a s s i 啪c u r 】r e n t ( k r ) e n c o d e db y 1 eh e r gg e n e 、v i t l la w h o l e c e l lp a t c hc l a m pt e c i l i l i q u e ，a i l ds t u d yt h ee 舵c t so fc i s a 曲d eo nt h eh e r g p r o t e i nt r a 衢c k i n gb yw e s t e mb l o t 锄a l y s i s 8 北京协和医学院中国医学科学院博上研究生学位论文 m e t h o d sw i l d 帅eh e r gc d n a p l 弱1 i d s 、e r et r a l i l s f i e c t e d 硫oh 啪锄锄b 巧o i l i c k i d l l e y ( h e k 2 9 3 ) c e l l sb yl i p o 佗c 伽m n em e t h o d t h ew h o l e c e l lp a t c hc l 锄pm e t h o d w a su s e dt 0r e c o r dt h e & ra n dl ( i n e s i c so fc h a 衄e lg a t i n g u s e dg 4 1 8t ob u i l du pa s t a b l yt r a n s f e c t e dh e r g - h e k2 9 3c e l l sl i n e ，a n ds t u d i e dt h ee 旋c t so fc i s a p r i d eo n n l ep r o t e i ne x p r e s s i o n r e s u l t sc i s a p r i d ep r o d u c e dac o n c e n 昀t i o n a i l dv o l t a g e - d 印e n d e n tb l o c k a g eo f 也e 如e r g 锄d i 诵t hi c 5 0 ( 5 0 汕i b i t o 巧c o n c e n t r a t i o n ) o f14 5 柚d3 9 衄o l l ， r e s p e c t i v e l y c i s a p r i d ed e g r a d e dp e a kc u 玎e n tp o t e n t i a lo f 珀e r o 锄d 1w i 也o u t a l t e r e da c t i v a t i o nn l r e s h o l dp o t e n t i a l 1 n l ea c t i v a t i o nc u ew a ss h i r e di nan e g a t i v e d i r e c t i o n 柚da c c e l e r a t e dc h a 蚰e li n a c t i v a t i o nb yc i s a p r i d e ，b u tt l l et i i i l ec o n s t a n t so f r e c o v e qf 硒mi n a c t i v a t i o nw e r en o ts 迳1 1 i f i c a i l tc h a n g e c i s a 州d ed i dn o tp r e s e n t s i g n i f i c a n ti n n u e n c e0 nt 量l e 砧c h a i l n e lp f o t e i nt m m c k i n g c o n c l u s i o nc i s a 两d eb l o c k e dh e r gk 十c h a n n e lv i ai n a c t i v a t e d 锄do p e ns t a t e ，n o t i n f l u e n c e d0 nt h ep r o t e i n 们硒c k i n g ，w 量l i c h 、a st i l em e c h a n i s mo fd r u gi n d u c i n g p r o a r r h y 廿l m i a 【k e yw o r d s 】 p a t c hc l 锄p ；c i s a p r i d e ；i o nc h 猢e l ；p o t a s s i u mc h a n n e l ； h e r gg e n e ；h u m a ne m b 巧o n i c 虹d n e y ( h e k 2 9 3 ) c e l l s ；w e s t e mb l o t p a r t3 t h ee f f e c to ft h en o v e la n t i - a r r h y t h m i ag u a n f ub a s eao nh e r gr c h a n n e lc u r r e n ta n dp r o t e i n 【a b s t n c t 】 o b j e c t i v et 0e v a l u a t et l l ee l e c t r o p h y s i o g i c a le 骶c t so fg u a j l mb a s ca ( g f a ) o nt h e r 印i dd e l a y e dr e c t i f i e rp 0 诅s s i 啪c u 骶n t ( 呔r ) e n c o d e db yt h eh e i 沁g e n eu s i n gp a t c h c l 锄p w 1 1 0 l ec e l l r e c o r d i n gt e c l l l l i q u e s ，a 1 1 ds t u d y m ee 行e c t so fa c e h y t i s i n e h y d 眦h i o r i d eo nm eh e r gp r o t e i n 仃a 硒c j ( i n g m e t h o d sw i l d - 够p eh e r gc d n ap l a s m i d s 、 ，e r et r a n s f e c t e di n t oh u m 锄e m b o n i c k i d n e y ( h e k 2 9 3 ) c e l l sb yl i p o f e c t 锄i n em e t h o d t h ew h o l ec e l lp a t c hc l 锄pm e t h o d w a su s e dt 0r e c o r dt h e 氐r u s i n gs i t e - d i r e c t e dm u t a g e n e s i st e c l m i q u e st om a k ea f 6 5 6 cm u t a t i o no fh e r gg e n e ，a n dt l l e ns t u d yt h ee f r e c t so fg 啪如b a s eao nt h e 爪rb yp a t c hc l 锄p t h ew e s t e mb l o ta n a l y s i sw a su s e dt os t u d yt l l ee 仃e c t so fg u a n 如 q 北京协和医学院中国医学科学院博上研究生学位论文 b 暑l s eao nn l ep m t e i ne x p r e 鹞i o n 1 k s u l t s 1 g f a 。p r o d u c e dac o n c e 蛐眦i o n d e p e n d e n ta n dv o l t a g e - d e p e n d e n tb l o c k a d eo fm e 毛e r gw i t l la i li c 5 0 ( 5 0 i 1 1 h i b i t o 巧c o n c e 砷眦i o n ) o f4 6 5 9 5 岬o l l g f a ( 4 0 0 a n d1o o o 岬1 0 儿) d e g r a d e dp e a l 【c u r r e n tp o t e 而a io f 珀e r gw i m o u ta l t e r e d a c d v a t i o nt h r e s h o l dp o t e n t 址g f a ( 2 5 、1 0 0 、4 0 0 岬。儿) p r c s e n t e d n os 迢i l i f i c 锄t 讪i b i t i o ne 髓c t so n gt h e i ，w h e r e s ，g f aa tc o n c e n 打a t i o no f1 ，2 5a n d5 m m o l l i l l l l i b i t e d jb y3 4 9 5 8 a 1 1 d7 0 5 ，r e s p e c t i v e l y t h ei c 5 0f o r w a s 1 6 4 u n o l l g f a ( 1m m o l l ) p r o d u c e dv o l t a g e - d e p e n d e mb l o c k a g eo ft 1 1 e 七i i ， d e g r a d e dd e 伊a d e dp e a k c u r r e n t p o t e n t i a jo f ，忸i l 、i t l l o u t a l t e r e da c t i v a t i o n t h r e s h o l dp o t e n t i a l g f as h o w e dn ot i m e d e p e n d e n tb l o c k a d eo fh e r gc u r r e n t s 2 t h ea c t i v a t i o nc u l ew a ss h i r e di nar l e g a t i v ed i r e c t i o na n da c c e l e r a t e dc h a l l i l e l i n a c t i v a t i o nb yg f a m o r e o v e r ，g f as l o w e dc h 删e lr e c o v e 巧6 o mi n a c t i v a t i o n a ta b o v e 一6 0 m v 、i t h o u tn os i g n i f i c 锄te a e c t so nt 1 1 ed e a c t i v a t i o nt i m ec o n s t a n t s 3 g f a p r o d u c e dac o n c e n t r a t i o n - 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