（内科学专业论文）雌激素通过α受体亚型途径促进内皮祖细胞增殖和迁移.pdf

f f f f 掣掣必 雌激素通过q 一受体亚型途径促进内皮祖细胞增殖和迁移 摘要 目的：观察1 7 p 雌二醇( 1 7 p e s t m d i 0 1 ，e 2 ) 及其受体激动剂p p t ( 选 择性雌激素受体( e r ) o 【激动剂) 、d p n ( 选择性雌激素受体( e r ) p 激 动剂) 对内皮祖细胞( e n d o t h e l i a lp r o g e n i t o rc e l l se p c s ) 增殖和迁移的影响。 探讨e 2 可能通过何种e r 亚型起作用。方法：( 1 ) 脐带血单个核细胞的分 离：抽取健康足月孕产妇胎盘脐带血6 0 i i l l ，按2 0 u h l 加入普通肝素抗凝， 采用明胶沉淀联合密度梯度离心法分离获得单个核细胞，并进行细胞活力 计算( 死细胞着蓝色、活细胞不着色) ，活细胞占9 8 以上可进行接种，上 述过程在四个小时内完成。( 2 ) 诱导分化：将细胞以4 1 0 6 c m 2 密度接种 于纤维连接蛋白包被的2 5c m 2 培养瓶中( 4 州c m 2 ) ，加入5 “m 1 9 9 培养基， 添加l o 胎牛血清、1 青链霉素( 1 万单位i i l l ) 、v e g f5 0 n g m l 、b f g f 1 n 咖l ，置于5 c 0 2 、饱和湿度、3 7 孵育箱中，成纤维细胞多于2 4 小时 以内贴壁，2 4 小时后取未贴壁细胞继续培养至第四天，用磷酸盐缓冲液洗 掉未贴壁细胞，加培养液培养至第七天，进一步用磷酸盐缓冲液洗掉未贴 壁细胞，贴壁细胞供试验用。( 3 ) e p c s 鉴定：取细胞爬片先后加入硫氰酸 荧光素标记荆豆凝集素i ( f i t c u e a i ) 、d i i 标记的乙酰化低密度脂蛋白 ( d i i a c l d l ) 孵育，荧光显微镜观察；7 d 的e p c s 进行c d l 3 3 免疫荧光 鉴定。( 4 ) 研究e 2 、p p t 和d p n 对e p c s 增殖及迁移的影响。培养的e p c s 分别加入不同浓度的e 2 、p p t 和d p n 进行细胞增殖实验分析( w s t ) 、显微 镜下e p c s 计数和流式细胞技术检测e p c s 细胞周期。另外将e p c s 细胞悬 液接种于c o s t e rt r a n s w e l l ( 膜直径6 5 m m ，孔径8 u m ) 的上层，下层加入 6 0 0 u 1 的培养液，并分别在培养液中加入不同浓度的e 2 、p p t 和d p n 孵 育2 4 h ( 实验均设双复孔) 。于高倍镜下计数定向迁移至滤膜下表面的细胞数 目，研究e 2 、p p t 和d p n 对细胞迁移的影响。结果：( 1 ) 培养3 - 4 天的单 核细胞开始贴壁；7 天后呈簇状生长，并有一定方向性；9 天可见多个血岛 样细胞团出现。免疫荧光鉴定显示 9 0 的贴壁细胞呈双荧光染色阳性， c d l 3 3 免疫荧光检测显示绿色阳性率 9 0 。( 2 ) w s t 实验分析发现e 2 及 p p t 能促进e p c s 的增殖，呈浓度依赖性，而d p n 对e p c s 的增殖无明显 影响。e 2 在1 l o 。1 0 m 0 1 l 、1 1 0 9 m 0 1 l 、1 l o 8m 0 1 l 、1 1 0 。7m 0 1 l 浓 度下，4 5 0 m n 吸光光度值分别为o 3 4 6 6 o 0 1 3 2 、o 5 0 8 3 o 0 1 6 、 o 5 3 9 7 o 0 2 0 、o 4 7 8 5 o 0 1 8 9 ；p p t 在同等浓度下其吸光光度值为 o 3 2 6 5 o 1 2 9 0 、o 4 5 0 3 o 0 2 1 0 、o 5 0 4 0 o 0 1 6 1 、o 4 2 7 2 o 0 2 2 0 ，各浓度 的e 2 组和p p t 组与空白对照组o 2 9 6 1 士o 0 1 0 6 相比有明显统计学意义( p o 0 5 ) ；同等浓度的e 2 及p p t 与d p n 组相比有明显统计学意 义( p o 0 5 ) ；同等浓度的e 2 与p p t 相比有明显统计学意义( p o 0 5 ) 。 ( 3 ) 手工计数显示e 2 及p p t 作用后e p c s 数增多，在1 1 0 8 m o 坍浓度下 分别为( 2 8 3 o 2 9 ) 1 0 5 个、( 2 5 6 o 1 1 ) 1 0 5 个，与对照组( 2 2 1 o 0 9 ) 1 0 5 个相比有明显统计学意义( p o 0 5 ) ；e 2 、p p t 与d p n 组相比有明显统计学 意义( 尸 o 0 5 ) ；e 2 与p p t 相比有统计学意义( p o 0 5 ) 。( 4 ) 细胞周期 实验表明e 2 及p p t 作用后，s 期的e p c s 所占百分比为( 1 7 2 6 3 8 9 ) 、 ( 1 2 1 1 8 4 ) ，分别与空白对照组( 2 9 3 o 1 5 ) 相比有明显统计学意 2 义( p o 0 5 ) ；e 2 作用后g 1 期细胞所占比例为( 7 2 5 3 3 3 6 2 6 4 5 ) ，分别与 对照组( 8 7 2 6 6 7 7 9 7 5 8 ) 、d p n ( 8 7 6 o 7 1 0 4 ) 相比有明显统计学 意义( 尸 o 0 5 ) ( 5 ) 细胞迁移实验表明e 2 及p p t 能促进e p c s 的迁移，浓度在l 1 0 8 m 0 1 l 时作用最强，e 2 在1 1 0 。1 0 m 0 1 l 、l 1 0 。9 m 0 1 l 、1 1 0 8 m 0 1 l 、1 l o 7m 0 1 l 浓度下迁移至下层细胞数分别为3 5 6 4 4 9 、4 4 2 6 3 9 3 、5 0 1 0 6 2 2 、 3 9 8 l 4 7 3 个，p p t 在同等浓度下为2 9 o o 3 6 1 、4 0 0 6 4 6 8 、4 3 4 7 4 7 8 、 3 5 1 8 2 7 1 ，与空白对照组相比1 8 7 8 1 3 5 个相比有明显统计学意义( p o 0 5 ) ；同等浓度的e 2 及p p t 与d p n 组相比有明显统计学意义( 尸 o 0 5 ) ；同等浓度的e 2 与p p t 相比 有明显统计学意义( 尸 o 0 5 ) 。结论：e 2 及p p t 能促进e p c s 的增殖和迁 移，使处于增殖期s 期的细胞增多，p p t 刺激作用不及e 2 ，d p n 无刺激作 用。说明e 2 主要通过0 【受体亚型途径刺激e p c s 的增殖和迁移。 关键词：1 7 p 一雌二醇；内皮祖细胞；p p t ；d p n ；增殖；迁移 3 e s t r o g e np r o m o t e sp r o l i f e r a t i o n a n d m i g r a t i o n o fe n d o t h e u a l p r o g e n i t o rc e u sv i a 仅一r e c e p t o rs u b t y p e s a b s t r a c t ：b j e c 仉e ：a i mi st os t u d yt h ee 虢c to fe s t r o g e n ( e 2 ) a 1 1 de s 仃o g e n r e c 印t o “e r ) a g o n i s t sp p t ( s e l e c t i v ee i 地a g o n i s t ) a n dd p n ( s e l e c t i v ee 邓 a g o n i s t ) o n p r o l i f e r a t i o n a n d m i g r a t i o n o fe n d o t h e l i a l p r o g e n i t o r c e l l s ( e p c s ) i v e s t i g a t et h er o l eo fe 2a n dt h er e l a t i o n s h i pt oi t sr e c 印t o rs u b t y p e s m e t h o d s ：( 1 ) t 1 1 em o n o n u c l e a u rc e l l ss 印a r a t i o n ：6 01 1 1 lc o r db l o o d sw e r e c 0 1 l e c t e d 丘。o mp l a c e n t ao fh e a l t h yw o m e nw i t h 如l lt e m p r e g n a i l c y ，c o m m o n h 印撕na n t i c o a g u l a t i o n ( b y2 0i up e r1m 1 ) ，t o t a lm o n o 肌c l e a rc e l l s ( m n c s ) w e r e i s o l a t e d b yg e l a t i np r e c i p i t a t i o nc o m b i n a t i o n d e n s i t yg r a d i e n t c e m d 如g a t i o n ，t h ec a l c u l a t i o no fc e l lv ia _ b i l i t y ( d e a dc e l l sw e r em eb l u e ，l i v e c e l l sw e r en o tc o l o r e d ) ，t h ei l u 瑚【b e ro fv i a b l ec e l l sc o u n t e df o rm o r et h a n9 8 c a nb ev a c c i n a t e d ，f i n i s h e da b o v ei nf o u rh o u r sa r e rb l o o d s a i 】叩l e sw e r e c o l l e c t e d ( 2 ) i n d u c t i o no fd i f f e r e n t i a t i o n ：t h ec e l l sw e r es u s p e n d e di n5m l m19 9c u l t u r em e d i u mw i t h4 10 6 c i n 2 d e n s i t y o fc e l l sa n d p l a t e d o n f i b r o n e c t i n c o a t e d2 5c n l 2c u l t u r en a s k ( b y4 u gp e rl c m 2 ，a d d i n g 1o f e t a l b o v i n es e m m 、1 m y c i l l i n ( b y1 0 ，o o ou n i t s p e rlm 1 ) 、v e g f5 0n 咖l 、b f g f ln g m 1 t h ec e l l sw e r ec u l t i v a t e di n 5 c 0 2 、s a t u r a t e dh u m i d 匆、3 7 i n c u b a t i o nb o x b e c a u s et h ef i b r o b l a s t sw e r el e s st h a n2 4h o u r sa d h e r e n t ，t h e n o n 。a d h e r e n tc e ll sa r e r2 4h o u r sc o n t i n u e dt oc u l t i v a t et ot h ef o u r t hd a y s ，w a s h e do u tn o n 。a d h e r e n tc e l l sw i t hp h o s p h a t e b u f f e r ，c h a n g e dt l l ec u l t u r em e d i u mt oc o n t i n u et oc u l t i v a t et ot h es e v e n t hd a y ，如r t h e rw a s h e do u tt h en o n a d h e r 4 e n tc e l l sw i t hp h o s p h a t eb u 岱ta d h e r e n tc e l l sf o re x p e d m e n t a lu s e ( 3 ) e p c si d e n t i f i c a t i o n ：7 da 仕a c h e dc e l l sw e r ed e t a c h e da n ds t a i n e d 埘t hd i l a c l d l 、f i t c u e a - 1 、c d133 ，a 1 1 do b s e e du n d e rf l u r o m i c r o s c o p e ( 4 ) i n v e s t i g a t et h ee 毹c t o fd i 仃e r e n tc o n c e n t r a t i o n so fe 2 、p p ta n dd p no np r o l i f e r a t i o na n dm i g r a t i o n o fe p c s e p c sw e r es e e d e do n t ot h et h eu p p e ro fc o s t e r1 伽s w e l l ( m e m b r a n e d i a m e t e ro f6 5 m m ，印e r t u r e8 u m ) a n d6 0 0 u1c u l t u r em e d i u mw i t hd i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s o fe 2 、p p t 、d p nw e r ea d d e di n t ol o w e rl a y e r ( e x p e r i m e n t 1 0 c a t e dap a i r so fh 0 1 e ) m a n u a lc o u n t i n gc a l u c a t e dt h en u m b e ro fe p c s i i l i g r a t e dt o w a r dl o w e rs u m c eu n d e rh i 曲m a g n i f i c a t i o na 1 1 di n v e s t g a t e dt h e e f f e c to fd i f - f e r e l l tc o n c e n t l a c i o n so fe 2 、p p ta n dd p no nm i g r a t i o no fe p c s r e s u l t s ：( 1 ) 觚a c h e dc e l l sw e r eo b s e e da r e r4d a y sa n dc l u s t e rg r o w t hw e r e n o t i c e da r e r7 d a y s ，i tc a l lb es e e nm o r eb 1 0 0 di s l a n d - l i k ec e nc l u s t e r sa r e r 9 d a y s m o r et h a n9 0 a t t a c h e dc e l l sw e r ed o u b l ep o s i t i v en u o r e s c e n c e a n d c d13 3g r e e np o s i t i v ef l u o r e s c e n c ea c c o r d i n gi m m u - n e o f l u o r e s c e n c e ( 2 ) w s t s h o w e dt 1 1 a te 2a n dp p tc a np r o m o t et h ep r 0 1 i f e r a t i o no fe p c s ，p r e s e n t i n g c o n c e n t r a t i o n d 印e n d e n t ，d p nh a d n oe 跣c t t h ea b s o 印t i o nv a l u e sa t4 5 0i u i lo f e p c si nr e s p o n s e dt oe 2o f t h ec o n c e n t r a t i o no f l 1 0 。1 0 m 0 1 l 、1 1 0 。9 m 0 1 l 、 l 1 0 8 m 0 1 l 、1 l o 。7m 0 1 lw e r eo 3 4 6 6 o 0 1 3 2 ，o 5 0 8 3 o 0 1 6 ， o 5 3 9 7 o 0 2 0 ，o 4 7 8 5 o o18 9 ，u n d e rt h es a l ec o n c e n t r a t i o np p tw e r e o 3 2 6 5 o 1 2 9 0 ，o 4 5 0 3 o 0 2 1 0 ，o 5 0 4 0 o 0 1 6 2 ，o 4 2 7 2 士o 0 2 2 0 ，w h i c hh a d s i g n i f i c a n t l ys t a t i s t i c a l l ys i g l l i f i c a n t ( 尸 o 0 5 ) c o m p a r e dw i 廿lm ec o n t r o lg r o u p ；a tt h es 锄e c o n c e n t r a t i o ne 2a n dp p th a ds i g i l i f i c a n t l ys t a t i s t i c a l l ys i 弘i f i c 锄( 尸 o 0 5 ) c o n l p a r e d 谢t hd p n a n de 2h a ds i 咖f i c a l l n ys t a t i s t i c a l l ys i 弘i f i c a n t 俨 o 0 5 ) c o m p a r e dw i t l lp p t ( 3 ) m 锄a lc o u m i n gt e s ts h o w e dt h ec e l ln u n l b e r sw e r e i n c r e a s e di nr e s p o n s et oe 2a n dp p to f1 1o 。8 m o l 1 ，t h ec e nn u n l b e rw e r e ( 2 8 3 o 2 9 ) 1 0 5 、( 2 5 6 o 1 1 ) 1 0 5 ，w h i c hh a ds i g i l i 母c 锄l ys t a t i s t i c a l l y s i g n 湎c a n t ( p 0 0 5 ) c o m p a r e dw i t ht 1 豫c o n 旬0 1g r o u p ；a tt h es 锄 c o n c e n t r a 【t i o ne 2a n dp p th a ds i g n j f i c a n n ys t a t i s t i c a l l ys i 印i f i c a n t ( p o 0 5 ) c o n l p a r e dw i md p n a n d e 2h a ds i g l l i f i c a i l n ys t a t i s t i c a l l ys i g n i f i c a m 俨 o 0 5 ) c o m p a r e dw i mp p t ( 4 ) c e l lc y c l ea i l a l y s i sd i s c l o s e dm a tsp h a s ee p c s i n c r e a s e di nr e s p o n s et oe 2a n dp p t ，t h ep e r c e n t a g ew e r e ( 1 7 2 6 3 8 9 )、 ( 12 1 1 8 4 ) w h i c hh a ds i 鲥f i c am l ys t a t i s t i c a l l ys i g n i f i c 锄t 俨 o 0 5 ) c o m p a r e d w i t ht h ec o i l 仃o lg r o u p ；t h ep e r c e n t a g eo fg 1p h a s ee p c si nr e s p o n s et oe 2i s ( 7 2 5 3 3 3 6 2 6 4 5 ) ，、油i c hh a ds i g n i f i c 锄l ys t a t i s t i c a l l ys i g l l i f i c a l l t ( 尸 o 0 5 ) c o n l p a r e dw i t hc o n 仃d lg r o u p ( 8 7 2 6 6 7 士7 9 7 5 8 ) a n dd p n ( 8 7 6 o 7 1 0 4 ) ；e 2h a ds i g n i f i c a n t l ys t a t i s t i c a l l ys i 印i f i c a j l t 俨 o 0 5 ) c o m p a r e dw i t hp p t ( 7 7 3 5 2 6 0 2 ) ( 5 ) t r a n s w e l la s s a yr e v e a l e dt h a te 2a n dp p te i l h a n c e de p c s m i g r a t i o na n dt h ep e a ki m p a c to c c u n e dw i t ht h ec o n c e n t r a t i o nl 1o 8 m o l 1 ， t h ec e l ln u m b e r sm i 刚e dt o w a r d1 0 w e rl a y e ri nr e s p o n s e dt oe 2o f1 1o 。1o m o 6 1 l 、l 1 0 。9 m ol l 、1 1 0 。8 m 0 1 l 、l 1 0 刁m o l lo fw e r e3 5 6 4 4 9 5 、 4 4 2 6 3 9 3 、5 0 1 0 6 2 2 、3 9 8 1 4 7 3 ，a tt h es a m ec o n c e n t r a t i o np p tw e r e 2 9 o o 3 6 1 、4 0 0 6 4 6 8 、4 3 4 7 4 7 8 、3 5 1 8 2 7 1 ，h i c hh a ds i g n i f i c a n t l y s t a t i s t i c a l l ys i g i l i f i c a n t ( 尸 o 0 5 ) c o m p a r e dw i t hm e c o n t r o l g r 0 1 1 p ； a tt h es a i n ec o n c e n t r a t i o ne 2a n dp p th a ds i g i l i f i c a n t l y s t a t i s t i c a l l ys i g l l i f i c a m ( p o 0 5 ) c o m p a r e d w i t hd p na n de 2h a ds i g n i f i c a n t l y s t a t i s t i c a l l ys i g n i f i c a n t 俨 9 0 的贴壁细胞为绿色染色。见( 图4 ) 。 2 3 e p c s 双染鉴定用内皮细胞特异性抗体d i l a c l d l 和 f i t c u 址1 对9 d 的贴壁细胞进行免疫荧光染色。d i l - a c l d l 染色成红色， f i t c u a e 1 染色成绿色，d i l a c l d l 和f i t c u a e 1 双染阳性的细胞为 e p c s ，结果显示 9 0 的贴壁细胞为双荧光染色，为黄色。见( 图5 ，6 ，7 ) 。 3 e 2 及其受体激动剂对e p c s 增殖的影响 3 1w s t 实验 在e 。及p p t 作用下e p c s 在4 5 0 光吸收值增加，1 1 0 。1 0 m 0 1 l 到 1 1 0 。8 m 0 1 l 呈浓度依赖性，浓度在1 1 0 。8 m o l 1 时作用作用达到高峰，1 1 0 7 m 0 1 l 细胞增殖开始减弱，e 2 在1 1 0 郴m 0 1 l 、1 1 0 9 m 0 1 l 、1 1 0 8 m 0 1 l 、1 1 0 。7 m 0 1 l 吸光光度值分别o 3 4 6 6 o 0 1 3 2 、o 5 0 8 3 o 0 1 6 、 o 5 3 9 7 o 0 2 0 、o 4 7 8 5 o 0 18 9 ，p p t 在同等浓度为o 3 2 6 5 o 1 2 9 0