（作物遗传育种专业论文）利用高世代回交群体分析水稻粒型qtls.pdf

华中农业大学2 0 0 6 年硕士学位论文 中文摘要 稻米外观品质是水稻重要的育种目标之一。准确鉴定和定位水稻粒型数量性 状基因位点( q t l ) 、精细定位克隆相关q t l ，对水稻品质育种具有较大的理论意义 和实际价值。近年来，我们广泛引进国际优异稻种资源，获得一批以优良籼稻杂交 组合汕优6 3 的亲本珍汕9 7 b ( z s 9 7 b ) 为遗传背景的高世代回交群体。本研究选择利 用来源于2 个供体亲本( k d m l l 0 5 和日本晴) 的高世代回交群体为主要材料，进行 了粒型q t l 的定位分析，主要研究结果如下： 1 利用来源于z s 9 7 门四m l l 0 5 的高世代回交群体( 0 5 i m 0 7 7 ) ，通过b u l k 分析策略结合区间作图分析，共检测到控制粒长的2 个q t l ( q g l 3 和q g l l ) ， 其中位于第3 染色体的q g l 3 效应是位于第1 染色体上的q g l l 效应的2 5 倍，这2 个q t l 共同解释的遗传变异为3 1 3 。控制粒宽的1 个q t l ，q g w 5 ，贡献率达到 3 3 6 。控制长宽比的2 个q t l ，其中q g s 3 的贡献率为1 6 6 ，q g s l 的贡献率约 为1 0 ，这2 个q t l 共可解释的表型变异为2 6 6 。控制粒体积的2 个q t l ，q g v 3 的贡献率为8 1 2 ；q g v 5 的贡献率为1 6 5 2 ，它们共同解释遗传变异为2 4 6 。 位于第1 染色体的r m l l 6 9 4 标记位点附近的q g w l 是一个新发现的粒长q t l ，它 与q g l 3 存在累加效应。 2 利用z s 9 7 日本晴的高世代回交群体( 0 5 l m 0 6 9 ) ，通过b u l k 分析策略 结合区间作图分析，检测到1 个控制粒长的q g l 3 ，效应较大，可解释的遗传变异 为1 7 8 。控制粒宽的q g w l ，可解释的遗传变异为1 9 7 ，是一个新发现的q t l 。 控制长宽比的q g s 3 ，可解释的变异为1 1 5 。检测到2 个控制粒厚的q t l ，q g t l 的贡献率为9 3 ；位于第9 染色体上q g t 9 的贡献率为1 1 6 ，这2 个q t l 共解 释变异为2 0 8 ，这2 个q t l 可能也是新的粒厚q t l 。1 个控制粒体积的q t l ， q g v 3 可解释的变异为8 7 。 3 利用来源于z s 9 7 b k d m l l 0 5 的另一回交群体( 0 6 t y c 3 4 2 ) 通过单因素方 差分析，发现位于c h r 3 的r m 7 r m 2 3 2 标记区间控制粒长、粒宽、长宽比的q g l 3 a 、 q g w 3 a 、q g s 3 a 可能为同一q t l ，表现出一因多效。位于c h r 3 上r m 4 6 8 标记位 点附近的q g l 3 b 、q g t 3 b 、q g v 3 b 同时控制粒长、粒厚、粒体积，可能为相同q t l ， 表现一因多效。位于c h r l 上与r m l 2 8 标记紧密连锁的q g w l 和q g s l 分别控制 粒宽、长宽比。 关键词：稻米外观品质：近等基因系；数量性状位点；分群分析法；高世代回交群 体 i i i a b s t r a c t g r a i nq u a l i t yi so n eo ft h ei m p o r t a n tb r e e d i n gt r a i t s i ti sv e r yi m p o r t a n tt od e t e c t ， i s o l a t ea n dc l o n eq t l sc o n f e r r i n gg r a i nq u a n l i t ya n dg r a i ns h a p ef o r t h er i c eb r e e d i n g i nr e c e n ty e a r s ，w ed e v e l o p e dal o to fa d v a n c e db a c k c r o s sp o p u l a t i o n si nt h eg e n e t i c b a c k g r o u n do fi n d i c av a r i e t yz h e n s h a n 9 7 b ( z s 9 7 b ) ，t h ep a r e n to fh y b r i ds h a n y o u 6 3 ， t h r o u g hb a c k c r o s s i n gt h ev a r i e t i e sw i d e l yc o l l e c t e df r o mt h ei n t e r n a t i o n a le l i t er i c e g e r m p l a s ma s d o n o rw i t hz h e n s h a n 9 7a sr e c u r r e n tp a r e n t i nt h i ss t u d y ，t h r e e a d v a n c e db a c k c r o s sp o p u l a t i o n sd e r i v e df r o mt w od o n o r s ，i n d i c av a r i e t yk d m l l0 5 a n dj a p o n i c av a r i e t yn i p p o n b a r e ，w e r eu s e dt oa n a l y z eg r a i ns h a p eq t l s t h em a i n r e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： 1 a na d v a n c e db a c k c r o s sp o p u l a t i o n ( 0 5 l m 0 7 7 ) d e r i v e df r o mz s 9 7 b k d m l l 0 5 w e r eu s e dt od e t e c tg r a i ns h a p eq t l st h r o u g hb u l k e ds e g r e g e n ta n a l y s i sa n d i n t e r v a lm a p p i n g t w oq t l so fg r a i nl e n g t hq g l 3w i t hm a j o re f f e c ta n dq g l l w i t hm i n o rw e r ef o u n dw i t ht h et o t a lg e n e t i cv a r i a n c eo f3 1 3 e x p l a i n e d o n e q t l , q g w 5 ，d e t e c t e df o rg r a i nw i d t hw i t ht h ee x p l a i n e dv a r i a n c eo f3 1 3 t w o q t l so fg r a i nl e n g t ht ow i d t h ，q g s 3w i t h1 6 6 v a r i a n c ee x p l a i n e da n dq g s l w i t ha b o u t1 0 o t w og r a i nv o l u m eq t l sw e r er e v e a l e dw i t hq g v 3a c c o u n t e d f o r8 1 2 v a r i a n c ea n dq g v 5a c c o u n t e df o r1 6 5 t h ea d d i t v ee f f e c t sw e r ef o u n d b e t w e e nq g l 3a n dq g l l ，t h el a t t e rm a yb ean e w l yd e t e c t e dq t l 2 o t h e ra d v a n c e db a c k c r o s s p o p u l a t i o n ( 0 5 l m 0 6 9 ) d e r i v e d f r o m z s 9 7 b n i p p o n b a r ew e r ea l s ou s e dt od i s c o v e rg r a i ns h a p eq t l st h r o u g ht h es a m e s t r a t e g i e s o n l yo n em a j o rg r a i nl e n g t hq t l , q g l 3 ，c o u l da c c o u n tf o rt h et o t a l v a r i a t i o no f1 7 8 i nt h ep o p u l a t i o n an o v e lq t l , q g w lf o rg r a i nw i d t h ， e x p l a i n e dt h ev a r i a n c eo f1 9 7 o n eq t lo fg r a i nl e n g t ht ow i d t hq g s 3w e r e f o u n dw i t h1 1 5 v a r i a t i o ne x p l a i n e d t w on e wq t l so fg r a i nt h i c k n e s s ，q g t l a n dq g t 9 ，e x p l a i n e dt h ev a r i a n c e so f9 3 a n d11 6 r e s p e c t i v e l y q g v 3f o r g r a i nv o l u m ed e t e c t e dw i t ht h ee x p l a i n e dv a r i a n c eo f8 7 3 t h et h i r d a d v a n c e db a c k c r o s s p o p u l a t i o n ( 0 6 t y c 3 4 2 ) d e r i v e d f r o m z s 9 7 b k d l m l 0 5w e r eu s e dt oi d e n t i f yg r a i ns h a p eq t l sb ya n o v aa n a l y s i s t h ep l e i o t r o p i ce f f e c t so fan e w l yd e t e c t e dq t lt h a tf l a n k e db yr m 7 - r m 2 3 2o n c h r o m o s o m e3w e r ef o u n do ng r a i nl e n g t h ，g r a i nw i d t ha n dl e n g t h w i d t h s i m i l a r e f f e c to faq t ln e a r b yr m 4 6 8o nc h r o m o s o m e 3w a sr e v e a l e do ng r a i nl e n g t h ， t h i c k n e s sa n dv o l u m e t h eq t ln e a r b yr m l 2 8o nc h r o m o s o m e lw e r ed e t e c t e d p l e o t r o p i ce f f e c t so ng r a i nw i d t h ，l e n g t h w i d t ha n dg r a i nv o l u m e k e yw o r d s ：r i c eg r a i nq u a l i t y ；n e a ri s o g e n i cl i n e ；q u a n t i t a t i v et r a i tl o c u s ； b u l k e ds e g r e g a n ta n a l y s i s ；a d v a n c e db a c k c r o s sp o p u l a t i o n v 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 爱。如需保密，解密时间z 。7 年6 月2 _ 0 日 是否保密 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 研究生签名：谭葭斌 时间：z 。6 年6 月z 。日 学位论文使用授权书 本入完全了解“华中农业大学关于保存，使用学位论文的规定”，即学生必须按 照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电 子版，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇 编学位论文。本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论 文的全部或部分内容。 注：保密学位论文在解密后适用于本授权书。 学位论文作者张谭友娥 导师张奔眠 签名日期：7 - 0 06 年6 月2 0 日签名日期：护年多月加日 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间 华中农业大学2 0 0 6 年硕士学位论文 1 文献综述 水稻是世界上主要的粮食作物。近年来全世界水稻播种面积约占世界谷物播种 总面积的2 2 7 ，稻谷总产量约占世界谷物总产量2 8 8 。全世界约有1 2 2 个国家种 植水稻，其中绝大多数是发展中国家，发展中国家所产的稻谷占全世界稻谷总产量 的9 5 ( d e l s e n ye ta 1 ，2 0 0 1 ) 。然而，世界人口特别是发展中国家人口的急速膨胀严 重威胁着粮食供求关系，这对世界上所有的作物育种工作者来讲无疑是一个严峻的 挑战和机遇。在过去的几十年内，依靠增加耕地面积和科学栽培对粮食的增产起了 重要的作用，但是科学栽培的增产潜力和土地资源毕竟有限，因此，选育高产作物 品种具有更大的潜力，高产育种自然成为主要的育种目标。过去5 0 多年，我国水稻 育种从地方品种到改良品种，从改良品种到6 0 年代以矮化育种为标志的“第一次绿 色革命”，再n 7 0 年代的以三系配套和杂交稻大面积推广应用为标志的所谓“第二次 绿色革命”，使水稻产量成倍增长，为我国乃至全世界的粮食增产做出了巨大贡献。 但伴随杂交稻的发展，也出现了组合单一、米质不佳、抗性下降、产量徘徊不前等 诸多问题。近年来，随着数量性状作图研究的兴起和分子标记技术的发展，为人们 搞清重要农艺性状的遗传基础提供了强有力的手段，为生产上广泛利用各种品种资 源提供了可能，为培育优质高产水稻新品种提供了希望。 1 1 稻米品质研究 1 1 1 稻米品质的评价 稻米品质一般包括加工品质、外观品质、蒸煮食味品质和营养品质等四个主要 方面( g b t 1 7 8 9 1 1 9 9 9 ) 。而外观品质和蒸煮食味品质则直接影响消费者的消费 行为。加工品质是稻谷在加工过程中所表现出来的特性，衡量指标主要有糙米率、 精米率和整精米率。国标中加工品质的定级指标为整精米率，提高整精米率是水稻 品质改良的重要目标之一。外观品质决定于粒型、垩白和透明度。粒型通常以粒长、 粒宽和长宽比表示。在评价粒型时，可用谷粒、糙米或精米的粒型来表示，因而粒 型类型的划分标准各不相同。不同的国家和地区对粒型的喜好各不相同，在东南地 区或国家，籼稻一般以长粒型比较受欢迎。在我国，国标中对籼稻的粒型作了具体 规定，认为长宽比至少达到2 8 以上才是优质的。垩白有腹白、心白和背白之分， 可用垩白率、垩白面积和垩白度来衡量，其中垩白度是外观品质的定级指标。透明， 度指整米在电光透射下的晶亮程度。蒸煮食味品质通常用直链淀粉含量( a c ) 、糊 化温度( g t ) 和胶稠度( g c ) 来表示，直链淀粉含量是稻米蒸煮食味品质的定级 指标。由于直接测定糊化温度较为困难，通常用稻米的碱消值( a s v ) 来间接评价。 营养品质主要决定于精米中的粗蛋白( p c ) 、赖氨酸以及部分维生素含量的高低。 利用高世代回交群体对水稻粒型q 1 r i 二的研究 1 1 2 水稻外观品质性状的遗传研究。 经典遗传学研究认为，稻米品质性状的遗传表达比较复杂，可能受控子母体基 因型或胚乳基因型或兼而有之，还可能存在细胞质效应( 莫惠栋，1 9 9 3 ) ；粒长、 粒宽、长宽比属多基因控制的数量性状。 稻谷长宽比与米形呈极显著正相关。米长与米宽和出米率呈极显著和显著的负 相关，与长宽比和直链淀粉含量( ac ) 值呈极显著和显著正相关。在籽粒长度和 宽度的遗传效应上，加性基因效应比非加性基因效应更重要，多数情况是短粒基因 的遗传具有部分显性，未发现籽粒宽度有明显的显性效应，籽粒长和宽受控于不同 的遗传体系( 朱智伟等，1 9 9 9 ) 。利用5 个细长粒品种进行不完全双列杂交，采用 加一显遗传模型，对早籼稻谷粒性状进行了遗传分析，发现谷粒性状属于多基因控 制的数量遗传。粒长、粒宽、粒厚、长宽比、粒重和穗重等性状主要受制于基因的 加性效应，其狭义遗传率为5 0 9 9 5 0 ，均达极显著水平。相对遗传进度表明， 长宽比的选择效果好于其它性状。亲本和杂交组合遗传效应预测值表明，在长粒品 种中容易选出谷粒长宽比大和宽度小的亲本，而在谷粒厚度大的品种中则易选出粒 重和穗重高的亲本( 石春海等，1 9 9 4 ) 。 1 1 3 水稻品质性状的非遗传因素 影响稻米品质的非遗传因素主要包括环境生态条件、肥水管理、储藏加工等因 素。环境生态条件对稻米品质的影响是通过影响谷粒胚乳细胞发育、内部生理生化 过程和籽粒灌浆动态变化等发挥作用的。 大。多施氮肥可导致稻米品质显著下降； 灌浆结实期的气温对稻米品质的影响最 镁、锌、硅、植酸和氯离子等元素或化学 物质会通过影响淀粉合成相关酶的活性而影响稻米品质( 李晓鸣，2 0 0 2 ) 。长期储 藏还会引起蛋白质氧化，脂肪、游离氨基酸、维生素b ，等大量减少，稻米品质显 著下降( 莫惠栋，1 9 9 3 ) 。 1 2 植物数量性状的q t l 研究及进展 1 2 1 数量性状的特点 遗传学上根据性状在生物群体内个体间的差异可以分为两大类：一类是质量 性状( q u a l i t i v ec h a r a c t e r ) ，一般表现为不连续变异，主要受单个或少数几个主基因 控制，受环境影响较小。另一类是数量性状( q u a n t i t a t i v ec h a r a c t e r ) ，它在分离群体 中表现出连续不断的变异，其各种变异表现的频率分布常常接近于正态分布，而 不象质量性状那样可以进行明确而简单的分组，又称为计量性状( m e t r i c c h a r a c t e r ) 。数量性状一般由多基因控制，单个基因的效应较小，易受环境影响。 传统的数量遗传学采用反映群体特征的平均数、方差等数理统计学方法，把控制 华中农业大学2 0 0 6 年硕士学位论文 某一性状的多个基因作为一个整体进行研究。但这种方法只能大体估计其遗传效 应，单个数量性状位点( q u a n t i t a t i v et r a i tl o c u s ，q t l ) 在染色体的位置及与其它基 因的关系，无法准确获得，用基因分离克隆等方法对数量性状进行遗传操纵更无 从谈起( 徐云碧，1 9 9 2 ) 。随着分子生物学的发展，各种分子标记逐步被人们开发 利用，为人们实现对q t l 的遗传操纵提供了强有力的手段。到目前为止，q t l 定位作图，q t l 克隆，q t l 序列分析已取得了一定的成果，随着未来基因组研究 特别是d n a 序列的完成，数量性状的遗传改良将发生极为深刻的变革。 由于作物中绝大多数的经济性状或农艺性状，如品质性状、株高、生育期、 穗数、籽粒化学成分及产量性状等都属于数量性状( 朱军，2 0 0 2 ) 。因此，对数量 性状的遗传基础以及q t l s 进行研究对作物的遗传改良具有重要的理论意义和实 际价值。 1 2 2 数量性状基因位点( q t l ) 研究中利用的分子标记 分子标记大致可分为三大类，第一类是以分子杂交为核心的分子标记技术， 包括限制性片段长度多态性r f l p ( r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ) 、d n a 指纹技术( d n af i n g e r p r i n t i n g ) 等；第二类是以聚合酶链式反应p c r ( p o l y m e r a s e c h a i nr e a c t i o n ) 为核心的分子标记技术，包括随机扩增多态性d n a 标记r a p d ( r a n d o ma m p l i f i c a t i o np o l y m o r p h i s md n a ) 、简单序列重复标记s s r ( s i m p l e s e q u e n c er e p e a t ) 。扩增片段长度多态性a f l p ( a m p l i f i e df r a g m e n tl e n g t h p o l y m o r p h i s m ) 、序标位s t s ( s e q u e n c et a g g e ds i t e s ) 、序列特征化扩增区域s c a r ( s e q u e n c ec h a r a c t e r i z e da m p l i f i e dr e g i o n ) 等；第三类是一些新型分子标记，如单 核苷多态性s n p ( s i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m ) 、表达序列标签e s t ( e x p r e s s e d s e q u e n c e st a g s ) 、定向诱导基因组局部突变技术t i l l i n g ( t a r g e t i n gi n d u c e dl o c a l l e s i o n si ng e n o m e s ) 等。 s s r ( s i m p l es e q u e n c er e p e a t ) ：即微卫星d n a ，是由2 - 6b p 的重复单位串联 重复而成，一个微卫星长度一般为几十个核苷酸。微卫星位点的两侧序列多是相对 保守的单拷贝序列，因而s s r 技术是根据两侧序列设计一对特异引物，扩增每个 位点的微卫星序列，再经聚丙烯酰胺凝胶电泳，比较扩增产物的长度大小，就可显 示不同基因型的个体在每个微卫星d n a 位点的多态性。s s r 在染色体上的分布均 匀，数量比小卫星多，具有高度特异性，多态性的信息非常丰富，它具有r f l p 的 遗传学优点，比r a p d 重复性可信度高，因此是遗传标记中的研究热点。s s r 广 泛分布在整个水稻基因组中，初步的估计认为水稻全基因组中约有5 ，7 0 0 - 1 0 ，0 0 0 个s s r 。与其它分子标记相比s s r 标记的优点在于：( 1 ) 数量丰富，广泛分布于 整个基因组；( 2 ) 具有较多的等位性变异，多态性高；( 3 ) 微卫星以孟德尔方式遗 传，呈共显性，可鉴别杂合子和纯合子；( 4 ) 实验重复性好，结果可靠；( 5 ) 所需 3 利用高世代回交群体对水稻粒型0 t i s 的研究 d n a 量小；( 6 ) 一般检测到的是单一的复等位基因位点，提供的信息量较高。2 0 0 2 年，i r m i ( t h ei n t e r n a t i o n a lr i c em i c r o s a t e l l i t ei n i t i a t i v e ) 公布了具有2 4 1 4 个s s r 标记的连锁遗传图，也就是在基因组上大约每1 5 7k b 就有一个s s r 标记位点，这 是其它植物无法比拟的。2 0 0 5 年国际水稻基因组测序计划在n a t u r e 上发表文章， 报道水稻基因组总共含有1 8 ，8 2 8s s r 位点，平均每m b 有5 1 个s s r 位点，其中第 三染色体s s r 位点密度最高，第四染色体s s r 位点密度最低( m g s p ，2 0 0 5 ) 。因 此，s s r 标记在植物遗传育种，特别是在水稻的遗传育种研究中的应用具有很大的 潜力。 1 2 3 数量性状基因位点( q t l ) 的定位 在基因组中以一定密度均匀分布着许多标记，通过各种作图软件处理分离群 体的基因型数据和性状表现型数据，可以把这些标记绘制成连锁遗传图。如果一 些标记与特定性状的q t l 连锁，就会出现群体遗传平衡上的差异，利用基因定位 软件统计这种差异，从而找到与某一特定q t l 连锁的分子标记，就可实现该q t l 的定位( k e a r s e y , 1 9 9 8 ) 。构建特定的作图群体，并获得该群体的标记基因数据和 表型数据是开展q t l 研究工作的前提。 1 2 3 1 遗传作图群体 构建遗传连锁图谱，必须要有一个分离群体。目前，有多种群体可用于遗传 作图。根据分离群体的遗传稳定性特点，可把作图群体分为临时性分离群体和永 久性分离群体。 临时性分离群体主要包括两亲本杂交产生的后代f 2 及其自交衍生的f 3 等家 系，以及b c 和三交群体。临时性分离群体中杂合型的个体处于非稳定状态，如 果发生自交，其基因型就会改变，也就是说群体中的每一个个体其后代均可发生 分离。所以这类群体使用一次后就自动淘汰，不能连续重复使用。如f 2 提供的遗 传信息最为丰富，可以对加性效应和显性效应进行估计，但是f 2 提供的种子有限， 很难进行连续性研究( b e a u m o n te ta 1 ，1 9 9 6 ；l ie ta 1 ，1 9 9 7 ；k h a i r a l l a he ta 1 ，1 9 9 8 ； l i ne ta 1 ，1 9 9 8 ) 。对于自交不亲合材料，或在研究某种特殊问题( 如雌雄配子交换 率的差别等) ，就需要利用回交、三交( 复交) 后代。与单交组合所产生的f 2 代 群体一样，回交和三交所能提供的材料也是有限的。 永久性分离群体主要包括重组自交系群体( r e c o m b i n a t i o ni n b r e dl i n e s ，r i l s ) 、 双单倍体群体( d o u b l eh a p l o i dl i n e s ，d h s ) 、近等基因系( n e a ri s o g e n i cl i n e s ，n i l s ) 、 导入系( i b ) 。重组自交系群体也可称为随机近交系( r a n d o mi n b r e dl i n e s ) ，是将 f 2 个体连续自交或同胞交配，或群体内随机交配直到完全纯合所产生的一系列品 系。由于经过连续多代自交或姊妹交，染色体间重组机会增加，因而可以用来更 4 华中农业大学2 0 0 6 年硕士学位论文 精确地定位那些紧密连锁的位点( b u r r , 1 9 9 1 ) 。双单倍体群体( d o u b l eh a p l o i dl i n e s ， d h s ) 主要通过花粉培养等手段培育，将得到的单倍体材料加倍，就可以得到稳 定遗传的材料，每个材料都可象一般品种多代繁殖，提供大量种子。由于不同基 因型对花药培养的反应差异，可能会造成某些基因型材料的丢失，因此有人怀疑 用这种经过组织培养选择的群体所构建的连锁图谱的可信度。永久性分离群体内 的每一个体及其后代基因型相对稳定，不发生分离，可以连续不断地提供家系内 遗传上一致的种子，因此可以进行重复区组试验，把区组效应( b l o c ke f f e c t ) 、重 复效应和随机误差最小化或分解开来，增加检测q t l 的准确性。其缺点是，构建 这样的群体需要很长的时间，而且不能估计显性效应。 1 2 。3 2 q t l 定位方法 q t l 定位主要有三种方法：单标记分析法，区间定位分析和复合区间定位分 析。简单介绍如下： 单标记分析法( o n em a r k e ra n a l y s i s ) ：就是检测性状与单标记关联。它利用每 个标记位点不同基因型间的性状均值差异，以常规的单因素方差分析法测验被研 究的数量性状在标记基因型间的差异显著性。基于所采用的统计分析手段的不同， 又可分为回归分析、单向分组方差分析、均值和方差比较等方法( s o l l e re ta l 1 9 7 6 ；w e l l e re ta 1 ，1 9 8 6 ) 。 区间作图法( i n t e r v a lm a p p i n g ) ：它以饱和连锁图谱为基础，用正态混合分布 的极大似然函数和线形回归模型对目标性状作全基因组扫描，对任意两个相邻标 记位点及其间任一位点上是否存在对该性状有效应的位点进行判断。各位点对性 状的效应大小由似然值指示，根据似然值描绘的曲线图确定q t l 可能的染色体位 置( l a n d e r & b o t s t e i n ，1 9 8 9 ) 。一般地，在水稻中，似然比( l o d ) 值大于2 4 ，就认 为该位点存在q t l 。 复合区间作图法( c o m p o s i t ei n t e r v a lm a p p i n g ，c i m ) ：它利用多元回归模型和 极大似然分析，使定义的区间内任一点的检测统计都不受定义区间之外的其它标 记和q t l 影响，并直接以似然比( l i k e l i h o o dr a t i o ，l r ) 作为测验统计量。它可以减 少剩余方差，增加q t l 作图的准确性和可靠性，但也可能使测验统计量的显著水 平降低，影响检测效率( z e n g ，1 9 9 3 ，1 9 9 4 ；j a n s e n ，1 9 9 3 ) 。 1 2 3 3 近等基因系( n e a ri s o g e n i cl i n e s 。n i l s ) 由于数量性状的复杂性以及初级作图群体( f 2 ，f 3 ，b c l ，r i l ，d h ) 内个 体间不同遗传背景的复杂性会造成q t l 定位的偏差( p a t e r s o ne ta 1 ，1 9 9 8 ；h y n ee t a 1 ，1 9 9 5 ) ，无论怎样改进统计分析方法，也无法使初级定位的分辨率和精度达到 最高，估计出的q t l 置信区间一般都在1 0c m 以上，不能确定检测到的一个q t l 5 利用高世代回交群体对水稻粒型q t i a 的研究 位点中到底是只包含一个效应较大的基因还是包含数个效应较小的基因。而 n i l s 、i l s 群体中整个染色体组的绝大部分区域完全相同，只在少数几个甚至一 个区域存在差异，因此它能使基因组中只存在一个或几个q t l 分离，消除其他背 景干扰和消去主效q 1 1 l 对微效q t l 效应的掩盖作用，达到q t l 的精确定位。目 前，近等基因系构建一般有以下几种方法。 1 ) 基于性状选择的连续回交 回交是双亲的f 1 杂种或其它后代与亲本之一进行杂交。用于多次回交的亲本 称为轮回亲本( r e c u r r e n tp a r e n t ) ，记为r p 。只在第一次杂交时应用的亲本称为 供体亲本( d o n o rp a r e n t ) ，记为d p 。回交的遗传效应是将不断提高回交后代中 轮回亲本的基因组比例，而不断减少供体亲本的基因组比例。回交过程可以一直 持续到新培育的目标品系在理论上除了含有目标基因的染色体片段外，与r p 几 乎等基因时为止。由此得到的回交后代再自交一次即得到回交近交系( b a c k c r o s s i n b r e dl i n e s ，b i l ) 。b i l 又称为r p 的近等基因系。从理论上说，要从近等基因系 中消除来自亲本供体的染色体位点需要多次回交，但实际上经过5 6 次回交即可 育出近等基因系。 2 ) 基于性状选择的连续自交 其基本方法是利用带有目标性状的品系与另一遗传背景优异的其它品系杂 交，在自交后代中对目标性状和其它性状进行选择，在选择过程中始终使目标性 状处于杂合状态，当自交到较高世代后，对目标性状处于杂合状态的个体再进行 一次自交，由此分离出目标性状纯合的和对应的不带有目标性状的两类个体组成 近等基因系。 3 ) 突变和人工诱变 通过突变和人工诱变的途径可能获得与原始亲本只在突变性状上存在差异的 一系列突变品系，突变品系与对应的原始品系就构成了一对n i l 。凡是可产生单 基因突变或单一性状多基因突变的方法，都可以用来获得n i l 。不过，这类方法 一般难以根据需要定向地产生具有目标性状差异的成对n i l 。在物理、化学诱变 育种，t - d n a 、转座子插入突变过程中，都可以创造一系列目标性状的近等基因 系。 4 ) 基于分子标记的选择 无论是针对某一性状的选择还是全基因组随机选择，传统的性状考察由于受 环境变异和实验者主观的影响，在判断植株基因型时往往容易出现误差，降低了 近等基因系的真实性，同时，传统的性状观察耗费时间太长。t a n k s l e y e ta 1 ( 1 9 8 9 ) 研究表明，利用回交程序结合分子标记辅助选择，可以加速外源基因向供体亲本 的导入，大大缩短育种年限。另外，分子标记显示的是分子水平上的差异，鉴定 出目标单株的基因型结果可靠，在一定程度上保证了近等基因系的真实性。李建 6 华中农业大学2 0 0 6 年硕士学位论文 雄等以珍汕9 7 明恢6 3 的一个含2 3 4 个重组自交系的f 6 ：7 群体为材料，依靠分子 标记从群体中分离了每穗实粒数和千粒种这两个性状的近等基因系及对这两个性 状有效应的q t l 标记位点和两两互作标记位点的近等基因系，这些近等基因系可 进一步用来精确定位性状的o t l 位点和分离q t l 位点及用于互作位点( 上位性) 的效应分析( 李建雄等，1 9 9 8 ) 。m o n f o r t e 等利用9 5 个r f l p 标记，在栽培番茄 ( l y c o p e r s i c o ne s c u l e n t u m c ve 6 2 0 6 ) 的遗传背景上构建了野生番茄( l y c o p e r s i c o n p e n n e l l i il a l 7 7 7 ) 的n i l s 和b c r i l s 群体，用于研究野生番茄( l y c o p e r s i c o n p e n n e l l i il a l 7 7 7 ) 的遗传资源和基因效应( m o r t f o r t ee ta 1 ，2 0 0 0 ) 。s h e n 等依据早 代d h 群体对水稻根部性状的q t l 定位的结果，通过标记辅助选择和回交跟踪4 个目标区段，构建了水稻根部性状的2 9 个n i l ( s h e ne ta 1 ，2 0 0 1 ) 。 1 2 3 4 利用q t l n i l 定位克隆基因 作物q t l 图位克隆的基本程序可概括如下：首先利用初级作图群体对所研究 的数量性状进行q t l 初步定位，然后构建目标q t l 的近等基因系( n i l s ) 、染色 体片段替换系( c h r o m o s o m es e g m e n t s u b s t i t u t e l i n e s ，c s s l s ) 或导入系 ( i n t r o g r e s s i o nl i n e s ，i t s ) ，再利用这些材料构建较大的次级分离群体，在目标区域 加密标记，对q t l 进行精细定位，从而将目标q 1 1 l 范围缩小到一个很小的基因 组区域。在此基础上，利用已公开的数据库，结合生物信息学知识鉴定出该区域上 的候选基因，并对候选基因序列特性和编码产物进行分析和预测；最后通过表达分 析和互补测验等进行功能验证。 目前，已有许多关于利用n i l 精细定位目标性状基因或q t l 的报道。 y a m a m o t o 等在前期f 2 群体定位的基础上，借助r f l p 标记进行选择，培育了 与生育期相关位点的近等基因系，由此精确定位了h d l 、h d 2 和h d 3 三个抽穗期 o t l s ( y a m a m o t o e ta 1 ，1 9 9 8 ) 。y a m a m o t o 等还用n i l s 精细定位了抽穗期 q t l - h d 6 ；用q t l - h d 6 的n i l s - qq t i ，删2 的n i l s 进行杂交，揭示了h d 2 对 h d 6 有上位性互作效应( y a m a m o t oe ta 1 ，2 0 0 0 ) 。t a k a h a s h i 等则利用n i l s 群体对 q t i ，删6 进行了图位克隆( t a k a h a s h ie ta 1 ，2 0 0 0 ) 。m o n n a 等利用n i l s 群体将先 前定位的一个q t l - h d 3 分解为效应不同的两个q t l ，h d 3 a 和h d 3 b ，并对它们 进行了精细定位( m o n n ae ta 1 ，2 0 0 0 ) 。l i 等利用n i l s 群体精细定位了栽培稻f 1 花粉不育基因座位娶6 ( l ie ta 1 ，2 0 0 0 ) 。t a k e u c h i 等利用n i l s 群体精细定位了 水稻中2 个紧密连锁的q t l ，一个，毛种子休眠的s d r l ，另一个是抽穗期的h d 8 ( t a k e u c he ta 1 ，2 0 0 0 ) 。g u 利用n i l s 群体对水稻白叶枯病基因x a 2 7 ( t ) 进行了精 细定位和图位克隆( g ue ta 1 ，2 0 0 0 ) 。h i t t a l m a n i 等( 2 0 0 2 ) 、b e r r u y e r ( 2 0 0 3 ) 等利用 n i l s 群体精细定位了4 个抗稻瘟病基因a j 、p f z 5 、p i t a 和p i 3 3 。m u r a i 等利用 n i l s 群体精细定位了水稻褐飞虱抗性基因b p h 2 ( m u r a ie ta 1 ，2 0 0 1 ) 。y a n o 等利 7 利用高世代回交群体对水稻粒型q t l s 的研究 用n i l s 群体对q t l 刷j 进行了图位克隆( y a n oe ta 1 ，2 0 0 1 ) 。最近，f a n 等利用 n i l s 组配的分离群体对q t l - g s 3 进行了图位克隆( f a nc ta 1 ，2 0 0 6 ) 。 1 2 3 5 水稻外观品质q t l s 定位的概况 我们把国内外研究发表的与水稻粒型性状相关的有代表性的q t l 列于表1 1 ， 1 2 ，1 3 ，1 4 ，1 5 。总体来看：控制粒型相关性状的q t l 几乎分布于全基因组； 所检测到的q t l 因利用的群体的不同而有变化，且由于所用标记的不同，导致其 位置及遗传效应的直接比较存在困难。尽管如此，大多研究显示在第3 ，5 染色体 上存在控制粒型性状如粒长和粒宽等主效q t l 。 表1 1 定位的水稻粒长q t l t a b l e1 1q t ld e t e c t e df o rg r a i nl e n g t hi nr i c e 8 华中农业大学2 0 0 6 年硕士学位论文 3r m 2 0 0 r m 2 2 7z h e n s h a n 9 7 m i n g h u i 6 3t r i e s ) x i n y z e ta 1 ，2 0 0 1 3r d 3 5 r d 3 7l e m o n t 特青( r i l s ) x uj le ta 1 ，2 0 0 2 4r z 6 5 6 r g 4 4 9 l a b e l l e b l a c kg o r ai f 2 ) e d r e d o f l ac ta 1 ，1 9 9 8 4r g 4 7 6 r g 6 2 0l a b e l l e b l a c kg o r ai f 2 ) e d r e d o f i ae ta 1 ，1 9 9 8 5r m 4 3 7 r m 2 8 9 d o m s e p h i d g e r d e hi f 2 ) b r a b i e ie ta 1 ，2 0 0 4 5y 1 0 6 0 l - r 5 6 9a s o m i n o r i i r 2 4 ( r i l ) w a nx y e ta 1 ，2 0 0 6 5r 1 4 3 6 r 2 2 8 9 n i p p o n b a