（动物营养与饲料科学专业论文）法夫酵母发酵生产新科斯糖.pdf

题目：法夫酵母发酵生产新科斯糖 作者：张静娟 导师：徐学明 专业：动物营养与饲料科学 摘要 本论文以法夫酵母( x a n t h o p h y l l o m y c e sd e n d r o r h o u s ) 为出发菌株发酵生产新科斯糖 ( n e o k e s t o s e ) ，主要研究内容包括：摇瓶发酵优化新科斯糖的生产方法和基本培养条件；补 料发酵优化生产新科斯糖的发酵工艺；新科斯糖的部分生理功能的研究。 以法夫酵母2 6 9 为出发菌株，进行了对摇瓶发酵条件优化的一系列单因素试验以及正交 试验，确定最佳发酵条件：蔗糖1 1 0 9 l ，尿素9 9 ，l ，p h 6 5 ( 磷酸氢二钠一柠檬酸缓冲体系) ， 接种量6 9 几，1 8 ，2 4 h 。在此条件下发酵得的新科斯糖含量为7 0 蟾l ，蔗糖转化率为 0 6 4 4 比优化前发酵效率提高了8 4 1 。 接种指数期酵母菌体比稳定期的酵母菌体能获得更高的新科斯糖产量，但差异并不显 著。细胞的循环利用虽然可以减少菌体的浪费，但是随着循环次数的增多，新科斯糖的产量 受到抑制。 通过研究不同通气量，不同补料方式，不同补料时间浓度对发酵的影响，确定补料发酵 可以提高发酵效率和新科斯糖的产率。1 0 l 发酵罐中，在通气量为8 l r a i n ，p h 为6 5 蜘5 的条件下，初始装4 l 培养基，发酵2 4 1 1 后一次性补以3 倍浓度的蔗糖溶液，再经2 4 1 1 发酵 得新科斯糖浓度为11 9 3 9 a _ ，蔗糖的转化率达0 6 6 2 。i 新科斯糖对大肠杆菌和双歧杆菌体外生长影响试验表明。与对照组葡萄糖和普通低聚果 糖比较，大肠杆菌在新科斯糖上的生长相对弱一些，但差异并不显著，而双歧杆菌能很好的 利用新科斯糖在体外生长，是利用普通低聚果糖增殖效果的1 4 倍，葡萄糖的2 倍。 关键词：法夫酵母，新科斯糖，低聚果糖，摇瓶发酵，补料发酵 a b s t r a c t t i t l e ：s t u d yo nt h ep r o d u c t i o no f n c o k e s t o s e ，b y x w l t h o p h y l l o m y e e sd e n d r o r h o u s ( p h 够a r h o d o z y , n a ) a u t h o r ：z h a n gj i n 西u a n s u p e rv i s o r ：x ux u e m i n g m a j o r ：a n i m a li n t u i t i o na n df e e ds c i e n c e a b s t r a c t f r u c t o o l i g o s a c e h a r i d e s ( f o s ) o ft h e1 ft y p eh a v eb e e nm o s te x t e n s i v e l yi n v e s t i g a t e da s p r e b i o t i cc o m p o u n d s 1 1 1 ep r o d u c t i o no fo ft y p eo l i g o s a c e h a r i d e sf r o ms u c r o s eh a sa l s or e c e i v e d s o m ea t t e n t i o nb u ts of a rp r o d u c t i o no f p o t e n t i a lp r c b i o t i co l i g o s a c c h a r i d e so f t h e6 gs e r i e s ，s u c h 鹊 t h et r i s a c c h a r i d en e o k e s t o s e , h a sn o tb e e ni n v e s t i g a t e d i nt h i sw o r k ，t h e p r o d u c t i o no f n e o k e s t o s eb yw a si n v e s t i g a t e d , t h em a i nc o n t e n t si n c l u d e ：t h e o p t i m i z a t i o no fs h a k ef l a s kc u l t u r ec o n d i t i o n so fn e o k e s t o s ep r o d u c t i o n ；t h eo p t i m i z a t i o no f f e d - b a t c hc u l t u r ec o n d i t i o n so fn e o k e s t o s ep r o d u c t i o n ；s t u d i e s0 1 1t h ep h y s i o l o g i c a lf u n c t i o no f n e o k e s t o s e n e o k e s t o s ea c c u m u l a t e d 笛t h em a i np r o d u c ti nt h ec u l t u r eb r o t ho fx a n t h o p h y l l o m y c e s d e n d r o r h o u a ( p h a f z ar h o d o z y m a ) g r o w i n g0 1 1 c n ) t h er e s u l t ss u g g e s tt h a tn e o k s t o s ei s c o m p o s e do f2 - 1 i n k e da n d1 2 - l i n k e d f r u c t o s ea n d1 , 6 - 1 i n k e d g l u c o s e i t san o v e ls y r u p f r u e t o o l i g o s a e c h a r i d e as e r i e so fs i n g l e - f a c t o rt e s ta n do r t h o g n n u lt e s tw e 诧c m i e do i lt od e t e r m i n et h eo p t i m u m s h a k ef l a s kc u l t u r ec o n d i t i o n so f n e o k e s t o s ep r o d u c t i o nb yx a n t h o p h y l l o m y c e sd e n d r o r h o u s2 6 9 ： s u c r o s el1 0 9 l , i h 9 9 i 一，p h6 5 。c e l lc o n c a n l r a t i o n6 9 l ，1 8 ，2 4 1 1 u n d e rt h i sc o n d i t i o n , t h e c o n c e n t r a t i o no fn o e k e s t o s ec o u l dr e a c h7 0 9 9 l s u c r o s ec o n v e r s i o nr a t i or e a c h e do 6 4 4 i ti s i n c r e a s e d1 8 4f o l d , c o m p a r e d w i t h t h e n e o k e s t o s e g r o w i n g u n d e r y m m e d i u m c e l l sh a r v e s t e di nt h ee x p o n e n t i a lg r o w t hp h a s ep r o d u c 划n e o k e s t o s em o l ee f f i c i e n t l yt h a n s t a t i o n a r yp h a s ec e l l s , b u tt h ed i f f i e r e n c ei sn o ts i g n i f i c a n t r e c y c l i n go fc e l l sr e d u c e dt h el e v e lo f n e o k e s t o s ep r o d u c t i o n f e d - b a e t hf e r m e n t a t i o nw a su s e f u lf o rt h el e v e lo f n e o k e s t o s ep r o d u c t i o n d i f f e r e n tv e n t i l a t i o nr a n dd i f f e r e n tf e e d i n gm o d e sw e r es t u d i e d i n1 0 lf e r m e n t e r , w i 也i n i t i a li n s t a l l a t i o no f 4 lm e d i u m v e n t i l a t i o n8 l m i n ，p h6 5 士0 5 ，ao n e - s t a g ef e db a c t hc u l t u r ew a sp e r f o r m e da f t e rf e r m e n t e df o r 2 4h o u r s 1 1 1 ef i n a ln e o k e s t o s ec o n c e n 打a f i o nr e a c h e dl1 9 3 9 l 。s u c r o s ec o n v e r s i o nr a t i or e a c h e d 0 6 6 2 t h ee f f e c to f n e o k s t o s eo ne s c h e r i c h i ac o l ia n db i f i d o b a c t e r i l 】l ni nv i n - ow e r ei n v e s t i g a t e d l e s s b i o m a s sw a sp r o d u c e db ye c o i lf r o mg l u c o s e ，f o s c a r b o ns o l a c ea n dt h a nf r o mn e o k e s t o s e b u tw e r en o ts i g n i f i c a n t l yd i f f e r e n t a n dm o r eb i o m a s sw a sp r o d u c e db yt h eb i f i d o b a c t e r i af r o m g l u c o s e f o st h a nf r o mn e o k e f l o s e b i f i d o b a c t e d au t i l i z e dt h en e o k e s t o s et oag r e a t e re x t e n t ，1 4 t i m e st h a nf o sa n d2t i m e st h a ng l u c o s e k e y w o r d s ：p h a f f i ar h o d o z y m a , x a n t h o p h y l l o m y c e sd e n d r o r h o u s , n e o k e s t o s e ， f r u e t o o l i g o s a e c h a r i d e s ，s h a k ef l a s kc u l t u r e ，f e d - b a t c hc u l t u r e h 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 本人为获得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 签名： 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规 定：江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名：遮巡 厂 f ， 导师签名： v争彬 日期：7 年g 月i 泊 第一章绪论 第一章绪论 1 1 低聚果糖 1 1 概况 低聚果糖( f r u c t o o l i g o s a c c h a r i d e ，f o s ) ，又名寡果耱或蔗果三糖族低聚糖，是存在于 水果、蔬菜、蜂蜜等物质中的天然活性成份，优良韵水溶性膳食纤维。存在于日常食用的水 果、蔬菜中，如牛蒡( 3 6 ) 、洋葱( 2 8 ) 、大蒜( 1 o ) 、黑麦( o 7 ) 和香焦( o 3 ，1 j 等。 低聚果糖的甜度为相应蔗糖的3 0 2 e 右，吸湿性很强，它的含水产品难于在空气中长期 保存，而粘度比同浓度的蔗糖溶液略大，热稳定性也较蔗糖高，它在一般的食品p h 范围 ( 4 o 7 o ) 内非常稳定，可在冷藏温度下保存年以上。低聚果糖的其它一些物化性质如 溶解性、冰点和沸点，结晶点等都与蔗糖非常相似只是在p l - - 1 3 4 的酸性条件下加热易分 解 商业化的低聚果糖产品是葡萄糖、蔗糖、g f 2 、g f 3 、g f 4 的混合物。典型的低聚果糖产 品有g 型( 普通型) 与p 型( 高纯度型) 两种。低聚果糖g 和p 的甜度分别约为蔗糖的6 0 和3 0 n , 4 ，它们均保持了蔗糖良好的甜味特性。 1 1 1 种类 蔗果三糖按照其果糖基与蔗糖分子的连接方式的不同分为三种类型。当果糖与蔗糖分子 中的果糖基i 碳位相连接便形成1 一蔗果三糖( 1 - k e s t o s e ) ，为l f 型1 2 1 ；当果糖与蔗糖分子中果 糖基6 碳位相连接便形成6 - 蔗果三糖( 6 - k e s t o s e ) 为 型。这两种蔗果三糖均含有一个末端葡 萄糖基和一个末端果糖基。当一个果塘基与蔗糖分子中的葡萄糖基6 碳位相连接而形成的一 种新型的蔗果三糖，即为新季萼斯糖( n e o k e s t o s e ) ，此种三籍分子的两个末端组均是果糖基，为 呛型。目前低聚果糖的1 f 型研究已较多，6 f 型的低聚果糖也受到了关注，但是6 g 系列的 低聚果糖生产的研究甚少1 3 1 。 6 _ k e s t o s e 江南大学硕士学位论文 1 1 2 功能和应用 1 1 2 1 低聚果糖的生理功能 低聚果糖作为益生元的代表，具有双相调节微生态平衡的“整肠”生理功能。低聚果糖 优越的生理学功能主要表现在以下几个方面【45 6 1 ： 1 、改善肠道菌群的功能用 低聚果糖能够使双歧杆菌、乳杆菌增殖，使产气荚膜梭菌受到抑制或不增殖，是大肠肝 菌或肠球菌、拟杆菌不增殖或增殖幅度低于双歧杆菌或乳杆菌增殖，可以认为，具有一定的 调节胃肠道菌群的功能。摄取功能性低聚果糖后，肠内双歧杆菌数量可增加数百倍。双歧 杆菌不仅可抑制病菌的繁殖，而且可减少甚至完全消除梭状芽孢杆菌等腐败菌。 2 、低甜度、低热量 低聚果糖的甜度仅为蔗糖的1 b ，在人体内不被n 一淀粉酶、蔗糖转化酶和麦芽糖酶分 解，不能作为能源被人体利用，不会使血糖值升高，每克低聚果糖中仅含6 3 k j 的热量，因 此非常适合于糖尿病患者及肥胖者食用。 3 、降血脂 大量的人体试验已经证实，摄入低聚果糖后可降低血清胆固醇水平。每天摄入6 1 2 9 低聚果糖并持续2 周至3 个月，总血清胆固醇降低2 0 5 0 m g m 。包括双歧杆菌在内的乳酸 菌及其发酵乳制品菌均能降低总血清胆固醇水平，提高女性血清中高密度脂蛋白胆固醇总胆 固酵的比率。血清胆固醇水平的降低，被认为是由于肠道微生物菌群平衡改变的结果。体 外试验也表明，人体肠道内1 2 株固有的嗜酸乳杆菌可吸收胆固醇，嗜酸乳杆菌能抑制小肠 壁对胆固醇的吸收。双歧杆菌代谢产生烟酸的能力与血清胆固醇水平的降低也有一定关系。 双歧杆菌通过抑制人体内活化的t 细胞，控制新形成低密度脂蛋白接受器，起到降低血清 胆固醇含量的作用。对小鼠的试验结果表明，双歧杆菌通过影响b 一羟基一9 一甲基戊二酸 单酰辅酶a 还原酶的活性，控制胆固醇的合成，从而起到降低血清胆固醇含量的作用。 4 、润肠通便 低聚果糖不能在人体内被消化吸收，属于低相对分子质量的水溶性膳食纤维，因此可用 它来使粪便变稀、缓解便秘。它的这种生理功能完全归功于其独有的发酵特征( 双歧杆菌增 殖特性) 。低聚果糖优于膳食纤维的特点是它的日常需求量较小，在推荐量范围内不会引起 腹泻。它具有一定的甜度，甜味特性良好，易溶于水，不增加产品的粘度，物理性质稳定， 并易于添加于加工食品和饮料中。 5 、增强免疫力 大量的动物试验结果表明，双歧杆菌在肠道内大量繁殖能够起抗癌作用。这种抗癌作用 归功于双歧杆菌的细胞、细胞壁成分和胞外分泌物使机体的免疫力提高。例如喂养定殖双歧 杆菌单因子的无菌小鼠，要比未处理的无菌小鼠寿命长。低聚果糖具有整肠通便的功能，它 能使肠道腐败菌受到抑制，腐败产物显著减少并及时排出，因而可减少大肠癌的发生。 6 、抗龋齿 功能性低聚果糖一般对牙齿无不良影响。龋齿主要是由于口腔微生物，特别是突变链 球菌( s t r e p t o c o c c u sm u t a n s ) 利用蔗糖所生成的酸，特别是乳酸及不溶于水的b 一葡聚糖作 2 第一章绪论 用的结果。功能性低聚果糖不能成为上述口腔微生物的作用底物，也没有菌体凝结作用，因 而不会引起牙齿龋变。 7 、促进矿物质的吸收 研究表明，低聚果糖具有截留矿物质元素如c a 、m g 、f e 、z n 的能力低聚果塘不能 被消化酶分解，在到达大肠后，随着低聚果糖被双歧秆蓖发酵分解，释放出矿物质离子。众 所周知，消化道的后半部分如盲肠、结肠等恰是矿物质元素被吸收的重要场所。另外，低聚 果糖经双歧杆菌等发酵，产生的短链脂肪酸降低了肠道p h ，在酸性环境中，许多矿物质溶 解速度增加，因而有利于吸收由于短链脂肪酸能刺激结肠膜细胞生长，因而提高了对矿物 质的吸收能力。成人每天摄取5 - - , 8 9 ，两周后每克粪便中双歧杆菌数可增加l 啦1 0 0 倍。可以 认为低聚果糖是一种水溶性膳食纤维，能降低血清胆固醇和甘油三酯含量，而且摄入后不会 引起体内血糖值的大幅度升高，所以可作为高血压、糖尿病和肥胖症等患者食用的甜味剂。 低聚果糖不能被突变链球菌s m u t a n s 作为发酵底物来生成不溶性葡聚糖，不提供口腔微生 物沉积、产酸、腐蚀的场所( 牙垢) ，是一种低腐蚀性的防龋齿甜味剂。 1 1 2 2 低聚果糖的应用嘲 1 9 9 2 年6 月8 日，日本健康食品协会就对日本明治制糖公司生产的低聚果糖的生理功 能进行了综合评价，1 9 9 5 年9 月2 9 日，日本厚生省正式批准日本明治制糖公司生产的低聚 果糖为特定保健用食品，确认了低聚果糖的“整肠作用，肠内菌群改善，大便性状改善，抑 制肠内有害生成物质”的功能，并颁发了“保健食品的标示许可证书”。 1 9 9 7 年1 0 月，我国卫生部保健食品评审委员会，经过对低聚果糖增殖双歧杆菌的人体 试验后，证明该产品具有“抑制致病菌繁殖，消除肠内有害物质，降低血脂。增强机体免疫 力”的能力。 1 1 3 生产方法 1 9 5 0 年b a r o n 与e d e l m a n l g l 及b l a n c h a r d 与a l b o n i 在研究酵母转化酶( i n v e r t a s e ) 时， 分别独立地发现了该转化酶除了具有水解作用外，还具有转移作用。蔗糖水解时产生了不等 量的葡萄糖和果糖，除此之外，还生成了一些低聚塘，这些低聚糖的结构后来得到了进一步 确定，并被命名为蔗果三糖( k e s t o s e ) 族低聚耱。1 9 5 2 年w 1 a l l e y i ”l 等用酵母转化酶作用于 蔗耱，首先得到蔗果三塘( k e s t o s e ) 。次年b a c o n i l 2 1 和b e l l 用高峰淀粉酶作用于蔗耱，产生 了一系列低聚糖，从中析出异蔗果三糖( i s o k e s t o s e ) 。1 9 5 4 年g r o s s i l 3 j 等从中又析出新蔗果 三糖( n e o k e s t o s e ) 目前低聚果糖的生产主要有以下几种方法： 1 1 3 1酶解法1 1 1 以菊芋为原料，提取菊粉，再经酶水解生产低聚果糖，此法生成的低聚果糖链较长，生 产工艺如下：菊芋一菊粉一水解一过滤一脱色一脱盐一浓缩一低聚果糖。比利时o r a f t i 公司投资2 0 亿比利时法郎；历时数十年大规模开发种植菊苣，生产菊粉与低聚果糖分别作 为油脂与食糖代用品。 1 1 3 2 微生物发酵法【1 4 1 生产所用的原料有蔗糖或淀粉，选用微生物发酵过程中产生的果糖转移酶的催化作用生 成低聚果糖，分子间果糖转移反应分两步进行，第一步生成果糖基一酶复合体，释放出葡萄耱， 3 江南大学硕士学位论文 第二步再由此复合物将果糖基转移给水或蔗糖，生成果糖或三糖。在生成反应中，蔗糖作为供 给体和接受体。在果糖转移酶或呋哺果糖苷酶的作用下分解成果糖基或葡萄糖，果糖基再水 解成果糖，产物为蔗果三糖，蔗果四糖和蔗果五糖的混合物。在低聚果糖生物生成的反应中， 生成低聚果糖的同时也生成了一些葡萄糖副产物，由于副产物的生成，阻碍了蔗糖的转化，使 产物中含有大量的葡萄糖或蔗糖。可以用葡萄糖氧化酶将葡萄糖氧化成葡萄糖酸或用葡萄糖 异构酶转化葡萄糖为果糖，通过对蔗糖转移反应的协同效应来达到生成低聚果糖的目的。 1 1 3 3 固定化酶法生产啁 用载体将产酶细胞进行包埋，得到固定化颗粒。将包埋产物与蔗糖或葡萄糖溶液反应， 得到低聚果糖溶液，固定化酶可重复使用，又便于连续化生产。将黑曲霉孢子与预先灭过菌 的海藻酸钠以一定的体积比混合。然后再在其中滴入氯化钙溶液，固化1h 后收集固定化 增殖细胞颗粒。将颗粒填入反应柱，在5 0 6 0 以下，以一定的速率通入5 0 9 6 蔗糖溶液， 流出液经过脱色、脱盐、浓缩等工艺即可生产出液体低聚果糖。 1 1 3 4 共固定化酶与细胞生产嗍 用酶法或固定化细胞法生产低聚果糖得到的低聚果糖含量并不高，约为5 0 6 0 9 6 。原因 在于酶法生产低聚果糖的同时生成了副产物葡萄糖。阻遏了蔗糖的迸一步转化。因而产品中 含有相当量的葡萄糖和未作用的蔗糖。利用黑曲霉与其他酶( 异构酶、葡萄糖氧化酶) 共包埋 或协同作用的方法，在生产低聚果糖的同时，将副产物葡萄糖异构化或氧化，从而解除了葡萄 糖的抑制作用，得到了含量分别为6 3 和7 1 的低聚果塘。 1 1 3 5 具有能分泌果糖基转移酶的优良菌株 由于植物中果糖转移酶的活性很弱，工业化生产主要使用微生物培养的酶，可用于生产 低聚果糖的酶种很多，有酵母，细菌，霉菌等等，使用酵母菌产生的果糖苷酶水解力较弱，工业 上多使用霉菌，在低聚果糖的生产中，最重要的是优选菌种，这是生产的关键。可用于催化反 应的菌种有a s p l n i g e r a t c c 2 0 6 1 1 ，n r r l 4 3 3 7 ，a t c c 9 6 1 2 ，a s p n i g e r 2 0 0 3 ，a s p o r g e r 2 0 0 3 ， a s p o e y z a e ”等。果糖呋喃糖苷酶和黑曲酶等多种微生物能分泌果糖低聚糖酶，这种酶 可以使一部分蔗糖转化为葡萄塘和果糖，并且能使果糖分子转移到未能分解的蔗糖分子上。 使葡萄糖和残留的蔗糖量少，因此，生产的关键是优选出高产菌种 1 1 3 6 法夫酵母 法夫酵母野生菌生长于落叶树伤口处渗出的黏液上，l u d i g 在十九世纪末讲究对此作了 最早的极为有限的描述，并将之命名为r h o d o m y c e sd e n d r o r h o u s ”“1 。真正对其形态及性 质作初步研究的是h e p , y nj a np l l a f f 及其合作者，他们于1 9 6 7 1 9 6 8 年间分别在日本 h o k k m d o 及h o n s h u 岛及美国阿拉斯加山区落时树的渗出物中分离该酵母，并将其命名为 r h o d o m y c e sm o u t a n a e m 。后来为了纪念p l l a f f ，并使命名符合规则，将其改为p h a f f i a r h o d o z y m a 。目前文献中r h o d o m y c e sd e n d r o r h o u s 与p h a f f i ar h o d o z y m a 互用。法夫酵母的 菌落为红色或橙黄色，它的一大特点就是具有发酵能力，能发酵葡萄糖，麦芽糖，蔗糖， 纤维二糖等。 4 第一章绪论 1 2 国内外发展趋势和现状1 2 3 随着世界经济的发展和人们物质生活水平的不断丰富，食品的营养健康和安全成为人们 关注的焦点，“肠道健康喝道革命噘歧因子等概念不断地被人们提出和接受。作为种 安全高效的双歧因子，低聚果糖更是受到保健食品开发者们的青昧。大量研究资料表明，食 用低聚果糖3 5 克，日，肠道双歧杆菌可增加5 - 1 0 倍低聚果糖的热量较低( 1 5 k a l g ，是葡 萄糖的4 0 + a ) ，并且不会使血糖、胰岛素上升用低聚果糖喂幼猪可减少下痢，降低粪便中 腐败产物，提高饲料利用率。低聚果糖最初由日本研制成功并工业化生产。韩国、台湾也有 厂家生产 目前世界上约3 0 个国家生产并消费低聚果糖，产量大约培万吨左右。其中生产能力最 大的比利时o r a f i 公司产量达6 万吨仅日本年需求量即达到4 5 万吨。在欧、美许多发 达国家对该产品的需求量约为2 0 3 0 万吨。 在低聚果糖生产方面，目前世界领先的低聚果糖及果糖厂商是比利时r t 子公司o r a f t i 和比利时科索克拉公司和日本m e i j i s e i k a ，另外法国( l e r o u ) 、荷兰( s u i k e r u n i n e ) ，美国、 日本、和我国台湾地区都有大量生产，比利时o r a f t i 去年在澳大利亚投资新建一家生产工 厂使得澳大利亚也开始成为低聚果糖的生产国其中比利时的o r a f t i 、法国的l e r o u 、荷兰 的s u i k e ru n i n e 还开发了菊粉或以菊粉为原料生产低聚果糖。 我国对于低聚果糖的研究、开发、生产才刚刚起步，生产技术也相对落后，江波o o 等利 用黑曲霉发酵生产得低聚果糖，此外广西大学”，中国食品发酵研究所等都有进行对低聚果 糖的开发研究。目前我国的低聚果糖市场正处于开发成长期，1 9 9 7 年在云南省昆明市建成 我国最大的低聚果糖生产线，年产低聚果糖糖浆( 含量5 0 ) 约3 0 0 0 t 左右。 目前已有应用于婴儿食品，饮料，医药等多方面，并且随着人们保健意识的逐渐加强， 低聚果糖作为保健食品，将广受欢迎，市场需求量非常大，低聚果糖的市场将会有一个飞速 发展的过程，最终为提高人们的健康水平做出贡献 1 3 研究意义 新科斯糖在龙舌兰属、紫苑科、风铃草科、百合目等植物中发现嘲，但它通常是微生 物中的具有果糖转移酶活性的酶作用时的微小产物 2 7 1 ，但有报道哪l 证明利用法夫酵母在蔗 糖上生长时，新科斯糖却作为是主要的积累产物。新科斯糖有着与一般低聚果糖相类似的生 理功能。国外s 刚i a n 刚的关于新科斯糖的p r e b i o t j c 性质的研究表明，新科斯糖增殖双歧杆 菌的能力要比一般商业用的低聚果糖更为优越。 课题的目的优化新科斯糖的发酵生产的工艺参数，以期实现大规模生产目前采用现代 生物工程技术生产低聚果糖的方法主要有酶水解法，微生物酶法，微生物发酵法。本课题采 用微生物发酵法，因为消除纯化酶的步骤，成本较低，且可以获得较高的新科斯糖产量 1 9 5 0 年b a c o n 等发现了酵母转化酶( i n v e r t a s e ) 除了具有水解作用外，还具有转移作用， 且水解蔗糖得到了蔗果三糖族低聚糖；七十年代，比利时、日本即进行了酶法( 主要为果糖 基转移酶转化法) 生产超低聚果糖该技术开发，成为国际先进生产技术的代表。经过几十年 的发展，低聚果糖的生产技术日益成熟，其产量也在逐年快速增长。采用现代生物工程技术 5 江南大学硕士学位论文 果糖基转移酶转化、并精制、浓缩而成的低聚果糖，以其优越的生理功能成为近十年来国际 食品市场上广泛流行的功能性食品基料，应用范围多达5 0 0 余种食品、保健品和药品，被誉 为二十一世纪健康新糖源。 但是一般我们所生产得到的低聚果糖包括有蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖，且都呈线 性分子，即是1 f 型，对于呛型的低聚果糖研究甚少。日本的h 删p q 曾经用桔青霉 ( p e n i c i l l i u mc i t r i n u m ) 发酵产得1 - k e s t o s e ，n y s t o s e ，n e o k e s t o s e ，产量分别为2 2 ，1 4 和1 1 。h a t i y e h 用s a c c h a r o m y c e 3c e r e v i s i a e 发酵得6 - k e s t o s e ，n e o k e s t o s e ，1 k e s t o s e ， 产量分别为6 1 5 ，2 9 7 和8 8 。台湾生福生技科技所研发的。黄金果寡糖”，其成份含 有1 - k e s t o s e 、6 - k e s t o s e 、n y s t o s e 、n e o k e s t o s e 。而国内对于6 g 系列的低聚果糖的研究基本没 有。 对于新科斯糖开发应用，目前国内外都暂时为空白。新科斯糖既具有与普通低聚果糖相 同优越的生理功能，又有着比它更为强的增殖双歧杆菌的能力。所以针对新科斯糖更为优越 的生理功能，相信它会有更好的应用前景，并可以为蔗耱深加工找到一条很好的出路 1 4 研究任务 本课题以法夫酵母( x a n t h o p h y l l o m y e e sd e n d r o r h o u s ) 为出发菌株，拟进行以下几方面 的研究。 1 摇瓶发酵优化新科斯糖的生产方法和基本培养条件； 2 补料发酵优化生产新科斯糖的发酵工艺； 3 研究新科斯糖的部分生理功能。 6 第二章摇瓶发酵生产新辩斯糖的方法和培养条件的优化 第二章摇瓶发酵生产新科斯糖的方法和培养条件的优化 2 1 前言 法夫酵母已被报道可大量发酵生产虾青素，另有研究嘲表明，法夫酵母菌在高浓度的 蔗藉培养基上的生长时，发生果糖基转移作用生成一种三糖_ 审i 科斯糖 本章以实验室拥有的法夫酵母为出发菌株，优化摇瓶发酵生产新科斯糖的培养基及其 工艺条件，包括发酵的培养基组成、浓度、温度、p h ，培养时间等对发酵影响。 2 2 材料和方法 2 2 1 主要试剂及仪器 超净工作台苏州安泰空气技术有限公司 h y g - 2 迫转恒温摇瓶柜上海新星自动控制设备成套厂 y x q s g 4 l 电热式压力蒸汽消毒器 p h s - 2 5 c 数字式p h 计上海理逵仪器厂 m p i i o o b 型电子称上海第二天平仪器厂 n c l 0 1 - 2 a 电热鼓风干燥箱南京长江电器仪器厂 a n a k et d l - 5 低速台式离心机 w a t e r sp l a t f o r mz m d4 0 0 0l c - m si n s t r u m e n t ：a m e r i c a nw a t e r sc o m p a n y 蔗糖( 分析纯)中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 麦芽汁自制 蛋白胨 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 酵母浸出汁中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 脲( 尿素) ( 分析纯)中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 磷酸二氢钠( 分析纯)中国医药上海化学试剂站 柠檬酸中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 2 2 2 菌种 本实验室保藏的法夫酵母( x a n t h o p h y l l o m y c e sd e n d r o r h o u s ) 2 6 9 。 2 2 - 3 培养基 斜面培养基( y m 培养基，g l ) ：蔗糖l o 。蛋白胨5 ，酵母膏3 ，麦芽汁3 ，琼脂1 7 ，自 然p h ； 种子培养基( g 几) ：蔗糖5 0 ，蛋白胨5 ，酵母膏3 ，麦芽汁3 ，自然p r l ； 发酵培养基( g 几) ：蔗糖7 0 9 ，蛋白胨5 ，酵母膏3 ，麦芽汁3 ，p h 6 5 2 2 4 实验方法 2 2 4 ，1 种子培养方法 从斜面上挑一环菌体于2 5 m l 培养基a 2 5 0 m l 摇瓶中，2 2 c ，2 2 0 r m i n 旋转振荡培养 4 0 h 。 7 江南大学硕士学位论文 2 2 4 2 摇瓶培养方法 离心收集的种子培养后的菌体，以2 9 几的浓度接入发酵培养基，2 2 0 r r a i n ，2 2 c 摇瓶 培养2 4 h 。 2 2 4 3 新科斯糖混合液的制各 发酵得的糖液以3 0 0 0 r r a i n 离心1 0 m i n ，使糖液和菌体分离，上清液用活性碳脱色，0 4 5 1 1m 微孔过滤，滤液作为l c m s 分析用 2 2 4 4l c m s 分析条件 h p l c 色谱条件口2 】： 色谱柱：w a t e r s5 n h 2 - m s4 6 2 5 0 m m ： 柱温 3 5 ； 流动相：乙晴：水= 7 5 ：2 5 ： 流速i m l m i n 质谱条件： 质量范围m z = 1 0 0 8 0 0 ，电喷负离子模式 2 2 4 5 糖的分析阱l 高效液相色谱h p l c 发酵液经预处理，稀释，经o 4 5l jm 的微孔滤膜过滤。 色谱柱：s u g a r p a k , 6 5 t u m i d 3 0 0 r a m 流动相：纯水 检测器：示差折光检测器 流速：0 5 m l m i n 进样体积：1 0 i i l 定量：蔗糖溶液对照 2 3 结果与讨论 2 3 1 新科斯糖的初步判定 根据1 9 9 6 年，k i l i a ns g 【2 8 】等的研究表明，法夫酵母菌在蔗糖培养基上的生长过程中， 会发生果糖基转移作用而生成了一种新型的蔗果三糖一新科斯糖，此种糖的是由果糖基的2 位与蔗糖分子中的葡萄糖6 碳位连接，本文利用法夫酵母在与k i l i a n 得新科斯糖的相同发酵 条件下，进行发酵，图2 - 1 ，2 - 2 是所得糖液的l c m s 分析图。 8 第二章摇瓶发酵生产新辩斯糖的方法和培葬条件的优化 0 7 0 4 2 e 一1 2 1 ：8 i rb r 右c h a n l e 0 7 0 4 2 6 - 12 7 6 ( 3 1 2 9 2 ) 1 图2 - 1 混合糖总离子色谱图 t i c 0 5 e o 2 ：s c a ne 孓 m h 2 p 0 4 陆1 6 6 5 3 i 9 江南大学硕士学位论文 0 7 0 4 2 6 - 115 3 ( 1 7 3 3 0 )2 ：s c a ne s - 印2 1 j 肛h 2 p 0 4 怫1 5 0 3 3 1 1 e 7 2 0 04 0 06 0 08 0 01 0 0 0 图2 - 2 混合糖负离子质谱图 据图2 - 1 ，2 - 2 ，混合糖液中分析得保留时间为1 7 4 l 所对应的物质分子量为5 0 4 ，与k i l i a n 研究一致，为实验所要的蔗果三糖新科斯糖。而对应保留时间3 1 1 4 的物质分子量为6 6 6 ， 为一种未知四糖，与k i l i a n 的发现相同。 2 3 2 蔗糖浓度对发酵生产新科斯糖的影响 碳源是构成菌体和合成新科斯糖的底物来源。通常作为碳源的物质，主要是各种糖类， 淀粉等。根据国外p 3 1 报道，碳源除了蔗糖外，采用葡萄糖、果糖及淀粉等为菌体培养基碳 源的均对果糖转移酶不利。故选择蔗糖为发酵的唯一碳源，它既是酶作用的底物又是一种诱 导物。 以摇瓶发酵培养基为基础，改变蔗糖的质量浓度进行发酵，结果见表2 1 ： 表2 1 蔗糖浓度对发酵的影响 由表看出，随着糖质量浓度的增加，新科斯稽的的浓度呈一定的上升趋势，但糖的利用 率随耱浓度的增加而降低。综合考虑所得新科斯糖的浓度和蔗糖的转化率，选取1 1 0 9 l 作 为摇瓶发酵的蔗糖浓度。 2 3 3 氮源对发酵生产新科斯糖的影响 氮源主要用于构成菌体细胞物质和含氮代谢产物，同时对微生物酶有诱导和抑制作用， 选用常见的有机和无机氮源，分别作为发酵培养基的氮源进行发酵培养，结果见表2 r 2 ： 表2 2 氦源对发酵的影响 由表可见，当利用尿素作为发酵氮源时，新科斯糖的浓度最高。徐学明等在利用法夫酵 母生产虾青素研究也表明，尿素对提高单位发酵液的生物量效果最好。由此证明利用法夫酵 1 0 第二章摇瓶发酵生产新科斯糖的方法和培养条件的优化 母发酵时可以利用无机氮源，大大节约了发酵成本。因此实验选取尿素作为发酵培养基的氮 源。 2 3 4 尿素浓度对发酵生产新科斯糖的影响 以摇瓶发酵培养基为基础，蔗糖浓度为l l o g ，l ，用尿素替代蛋白胨做不同尿素质量浓 度的发酵试验结果见表2 - 3 5 0 4 0 毫3 0 适 羹2 0 1 0 0 24681 0 1 2 尿素浓度( g l ) 图2 - 3 尿素浓度对发酵的影响 由图3 - 1 表明，适当提高尿素浓度可提高新科斯糖产量，但是但尿素浓度超过9 9 儿时， 对新科斯糖产量有抑制作用 2 3 5 接种量对发酵生产新科斯糖的影响 接种量的大小直接影响发酵周期和发酵效率，大量接入培养成熟的菌体可以缩短菌体生 长过程和迟滞期，从而缩短发酵周期，节约发酵培养的动力消耗，并有利于减少染茵的机会 若接种量过大会引起菌体大量繁殖使单位体积内的养料和溶氧供应不足而使得菌体得不到 充分发育，干扰正常代谢。接种量过小时，发酵前期生长缓慢，发酵的整个时间长，菌体浓 度小，发酵效果差。因此，接种量一般要求以适量为原则。 以摇瓶培养基为基础，以不同的细胞浓度接种，考察接种量对发酵的影响 江南大学硕士学位论文 7 0 6 0 5 0 一 之4 0 ? 越 爱3 0 器 2 0 1 0 0 02 46 81 0 细胞浓度( g l ) 图2 _ 4 接种量对发酵的影响 由图2 - 4 可见，接种量为4 妒。的浓度，糖产量最高。过高的接种量，对新科斯糖的生产 表现出抑制作用，由于酵母添加量过高，粘度增加，不利于酵母的呼吸。c h i e n 州等在用固 定化d 胖仳砌m 记生产低聚果糖时也有类似的发现。 2 3 6 口h 对发酵生产新科斯糖的影响 环境怔l 影响细胞膜所带的电荷及培养基中营养物质的离子化作用程度，从而影响微生 物的生长与生产。酵母适宜于酸性环境生长，产酶的最适p h 通常和酶反应的最适p h 接近， 一些作者p 3 】曾报道果糖转移酶活性对p n 要求很严格。 有研究表明，磷酸盐和柠檬酸盐对于法夫酵母生长有促进作用，故实验利用磷酸氢二钠 柠檬酸作为缓冲体系，选取一系列不同p h ，考察p h 对发酵产糖的影响。 024681 0 p h 图2 - 5 p h 对发酵的影响 1 2 m 0 1昱)谜蛏磬 第二章摇瓶发酵生产新科斯糖的方法和培养条件的优化 实验结果表明，p h 范围在扣8 ，产糖量都比较高，变化不是很大，可能果糖转移酶对 中性范围内的p h 要求不是很严格。 2 3 7 温度对发酵生产新科斯糖的影响 温度是影响机体生长与存活的最重要因素之一，这种影响表现为两方面：一方面随着温 度的上升，细胞中的生物化学反应速率加快，生长速率加快；另一方面机体的重要组成如蛋 白质、核酸等都对温度较敏感，随着温度的增高有可能遭受不可逆的破坏。微生物在生长和 产酶时都有其最适温度，适宜于微生物生长的温度不一定是产酶最旺盛的温度 以优化培养基( 蔗糖1 1 0 9 l ，尿素9 9 l ，p h 6 5 5 ) 为基础，选取一系列不同温度，考 察温度对发酵的影响。 表2 3 温度对发酵的影响 由表2 3 可见，法夫酵母发酵产新科斯糖在培养温度为1 8 c 时效果最好，糖产量最高， 此发酵温度比较低，跟徐学明p 5 l 的研究结果类似，法夫酵母的发酵温度较低，在1 6 t 2 c 范 围内生长较好。 2 3 8 时间对发酵生产新科斯糖的影响 以上述的优化培养基为基础，摇瓶培养，定期取样，测定各塘含量随时问的变化。结果 见图3 - 4 。 8 0 7 0 6 0 5 0 芒 34 0 越 薹3 0 2 0 1 0 o o1 02 0 3 04 0 5 0 6 0 7 08 0 发酵时问( h ) 图2 - 6 发酵