（动物遗传育种与繁殖专业论文）中心体复制调控相关蛋白亚细胞结构定位的研究.pdf

甘肃农业大学2 0 0 8 届硕上学位论文 摘要 采用现代胚胎生物工程技术是使畜牧业向高产、高效、优质、集约化发展的 有效途径。但是，体外受精胚胎和克隆胚胎发育率低是制约这两项技术走向生产 实践的最大障碍。 本研究借助免疫荧光染色的方法，从中心体复制的关键调控基因c d k 2 和p 5 3 入手，研究c d k 2 和p 5 3 在经体外成熟1 8 - 2 6 小时的牛成熟卵母细胞中的亚细胞 定位，揭示它们在中心体复制过程中位置，分析c d k 2 和p 5 3 在牛成熟卵母细胞 中的表达情况，从中心体异常复制的角度阐明体外受精胚胎和克隆胚胎染色体的 不稳定性。研究结果如下： 研究哺乳动物胚胎的免疫荧光染色条件和步骤。通过对小鼠受精卵中c d k 2 、 p 5 3 和y t u b u li n 蛋白的免疫荧光染色研究，对免疫荧光染色的条件和步骤不断 优化，修改、简化和发展，摸索出一套完善的针对卵母细胞的免疫荧光染色步骤。 在小鼠受精卵1 细胞g 1 期，通过固定、封闭、染色、在荧光显微镜下观察，发 现c d k 2 、p 5 3 和y - t u b u l i n 蛋白均出现染色阳性。c d k 2 和p 5 3 在细胞有丝分裂 g 1 期定位于中心体，分布于细胞核区。 分别培养1 8 h ，2 2 h ，2 6 h 后的牛成熟卵母细胞，通过与试验一相同的固定、 封闭、染色，在荧光显微镜下观察发现，( 1 ) 培养1 8 h 后的牛成熟卵母细胞，c d k 2 、 p 5 3 和y - t u b u l i n 蛋白均出现染色阴性。( 2 ) 培养2 2 h 后的牛成熟卵母细胞，大 多数卵母细胞c d k 2 、p 5 3 和y - t u b u l i n 蛋白出现染色阴性，仅有少数卵母细胞 c d k 2 、p 5 3 和y - t u b u l i n 蛋白出现染色阳性。( 3 ) 培养2 6 h 后的牛成熟卵母细胞， 大多数卵母细胞c d k 2 、p 5 3 和y - t u b u l i n 蛋白出现染色阴性，仅有少数卵母细 胞c d k 2 、p 5 3 和y - t u b u l i n 蛋白出现染色阳性。( 4 ) 在出现染色阳性的牛成熟 卵母细胞中，c d k 2 和p 5 3 蛋白定位于中心体，分布于细胞核区。 c d k 2 和p 5 3 蛋白是与细胞中心体复制密切相关的两个蛋白，其功能和细胞 的正常分裂发育有关。在用于牛体外胚胎生产的牛卵母细胞中，c d k 2 和p 5 3 蛋 白的正常表达与否，是直接影响牛体外胚胎生产效率的原因之一。 关键词：c d k 2 ；p 5 3 ；免疫荧光；亚细胞定位；中心体 甘肃农业大学2 0 0 8 届硕上学位论文 s u m m a r y e m b r y oa d o p t i o no fm o d e mb i o - e n g i n e e r i n gt e c h n o l o g yi st oe n a b l el i v e s t o c kt o t h eh i g h - y i e l d ，h i g he f f i c i e n c y ，h i g h - q u a l i t y ，i n t e n s i v ed e v e l o p m e n to fa ne f f e c t i v e w a y h o w e v e r ，i nv i t r of e r t i l i z a t i o na n de m b r y oc l o n i n ga n de m b r y od e v e l o p m e n t c o n s t r a i n t si st h el o wr a t eo ft h e s et w ot e c h n i q u e st op r o d u c et h eg r e a t e s to b s t a c l et o p r a c t i c e t h i ss t u d yb yi m m u n es t a i n i n gm e t h o d s ，f r o mt h ec e n t r ec o p yo ft h ek e y r e g u l a t o r yg e n e ss t a r tc d k 2a n dp 5 3 ，a n dp 5 3o nc d k 2 i nt h e1 8 2 6h o u r so fi n v i t r om a t u r ec a t t l em a t u r eo o c y t e si nt h es u b c c l l u l a rl o c a l i z a t i o n ，a n dr e v e a lt h e mi n t h ec e n t r ec o p yo ft h ep r o c e s so fl o c a t i o n ，o fc d k 2a n dp 5 3i nc a t t l em a t u r eo o c y t e s o fe x p r e s s i o n ，f r o mt h ec e n t r eo fa b n o r m a lc o p yc l a r i f yt h ep e r s p e c t i v eo fi nv i t r o f e r t i l i z a t i o na n de m b r y oc l o n i n ga n de m b r y oc h r o m o s o m ei n s t a b i l i t y t h er e s u l t sa r e 舔f o l l o w s ： s t u d yo ft h em a m m a l i a ne m b r y oi m m u n es t a i n i n gc o n d i t i o n sa n ds t e p s t h r o u g h t h ef e r t i l i z e de g g so fm i c ec d k 2 ，p 5 3a n d 丫- t u b u l i np r o t e i nt h ei m m u n es t a i n i n go n t h ei m m u n es t a i n i n gt h ec o n d i t i o n sa n ds t e p st oc o n t i n u o u s l yo p t i m i z e ，m o d i f y ， s i m p l i f ya n dd e v e l o p m e n t ，w o r k e d o u tac o m p r e h e n s i v ev i e wo ft h ei m m u n eo o c y t e s s t a i n i n gs t e p s 1c e i l si nm o u s ee m b r y o sg 1p h a s e ，t h r o u g haf i 】【e 也c l o s e d ，d y e i n g ，i n t h ef l u o r e s c e n tm i c r o s c o p eo b s e r v a t i o n ，f o u n dt h a tc d k 2 ，p 5 3a n dy - t u b u l i np r o t e i n w e r ef o u n dp o s i t i v e c d k 2a n dp 5 3i nc e i lm i t o s i sg 1p h a s eo fp o s i t i o n i n ga tt h e c e n t r e ，l o c a t e di nt h en u c l e u sa r e a t r a i n i n gw e r e1 8h ，2 2 h ，2 6 ha f t e rt h ec a t t l em a t u r eo o c y t e s , w i t ht h es a m et e s ta f i x e d ，c l o s e d ，d y e i n g , i nt h ef l u o r e s c e n tm i c r o s c o p eo b s e r v e dt h a t ( 1 ) 1 8ha f t e rt h e t r a i nc a t t l em a t u r eo o c y t e s ，c d k 2 ，p 5 3a n dy - t u b u l i np r o t e i nw e r ef o u n dn e g a t i v e ( 2 ) 2 2ha f t e rt h et r a i nc a t t l em a t u r eo o c y t e s ，t h em a j o r i t yo fo o c y t e sc d k 2 ，p 5 3a n d y - t u b u l i np r o t e i nw e r en e g a t i v ei no n l ya s m a l ln u m b e ro fo o c y t e sc d k 2 ，p 5 3a n d y - t u b u l i np r o t e i na p p e a r sp o s i t i v es t a i n i n g ( 3 ) 2 6h a f t e rt h et r a i nc a t t l em a t u r e o o c y t e s ，t h em a j o r i t yo fo o c y t e sc d k 2 ，p 5 3a n d1 - t u b u l i np r o t e i nw e r en e g a t i v ei n o n l yas m a l ln u m b e ro fo o c y t e sc d k 2 ，p 5 3a n dy - t u b u l i np r o t e i na p p e a r sp o s i t i v e s t a i n i n g ( 4 ) w e r ep o s i t i v ei nt h ee v e n to ft h ec a t t l em a t u r eo o c y t e s ，c d k 2a n dp 5 3 p r o t e i nl o c a t i o na tt h ec e n t r eo fd i s t r i b u t i o ni nt h e n u c l e a ra r e a c d k 2a n dp 5 3p r o t e i ni st h ec e n t r a lb o d ya n dc e l lr e p r o d u c t i o no ft h et w o c l o s e l yr e l a t e dp r o t e i n s ，t h e i rf u n c t i o na n da n o r m a lc e l ld e v e l o p m e n to ft h es p l i t i n 甘肃农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 v i t r oe m b r y o sf o rc a t t l ep r o d u c t i o ni nc a t t l eo o e y t e s ，c d k 2a n dp 5 3p r o t e i n e x p r e s s i o no ft h en o r m a lo rn o t ，i sad i r e c ti m p a c to nt h ee f f i c i e n c yo fc a t t l e p r o d u c t i o ni nv i t r oe m b r y o n i co n eo ft h er e a s o n s k e yw o r d s ：c d k 2 ；p 5 3 ：i m m u n o f l u o r e s c e n c e ：s u b c e l l u l a rl o c a l i z a t i o mc e n t r o s o m e m 甘肃农业人学2 0 0 8 届硕士学位论文 英文缩写 b s a c o c f b s f n f s h i v c 册 i v m l h m m n p b p v p z p 英文缩略表 英文全称 b o v i n es e r u ma l b u m i n c u m u l u so o c y t ec o m p l e x f e t a lb o v i n es e r u m f e m a l ep r o n u c l e u s f o l l i c l es t i m u l a t i n gh o r m o n e i nv i t r oc u l t u r e i nv i t r of e r t i l i z a t i o n i nv i t r om a t u r a t i o n l u t e i n i z i n gh o r m o n e s e c o n dm e t a p h a s e m a l ep r o n u d e u s p o l a rb o d y p o l y v i n y l p y r r o l i d o n e z o n ap e l l u c i d a v i 中文名称 牛血清白蛋白 卵丘一卵母细胞复合 体 胎牛血清 雌原核 促卵泡激素 体外培养 体外受精 体外成熟 促黄体素 第二次减数分裂中期 雄原核 极体 聚乙烯吡咯烷酮 透明带 甘肃农业大学2 0 0 8 届硕十学位论文 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得甘肃农业大学或其他教育机构的学位 或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名： 夏昊 签字日期：加口p 年f 月z 。日 4 1 甘肃农业大学2 0 0 8 届硕上学位论文 第一章文献综述 采用现代胚胎生物工程技术是使畜牧业向高产、高效、优质、集约化发展的有 效途径。我国胚胎生物工程技术已有2 0 多年的历史，主要胚胎生物工程技术水平已 接近或达到世界先进水平，体外受精技术和体细胞克隆技术已在包括牛等多种哺乳 动物成功获得后代。但是，体外受精胚胎和克隆胚胎发育率低是制约这两项技术走 向生产实践的最大障碍。 ， l 牛的体细胞克隆技术研究进展 克隆( c l o n i n g ) 就是无性系或无性繁殖系，也就是由一个细胞或个体以无性方式 重复分裂或繁殖所形成的一群细胞或一群个体。在不发生突变的情况下，一个克隆 内的所有成员具有完全相同的遗传结构( w i l m u t ，1 9 9 7 ) 。随著现代科学技术的进 步，克隆的概念有了很大的扩展，包括基因克隆，细胞克隆和个体克隆。在高等动 物中，由于不能由体细胞经体外培养来获得个体，而必须将体细胞或胚胎细胞的细 胞核移入或融合于已去核的卵细胞，才能发育成完整新个体，因此一些胚胎动物学 家将克隆一词引入到动物的核移植或细胞融合的领域，对克隆的概念进行了扩展， 这样就出现了现代的克隆概念。现代克隆概念是指不经过受精过程而获得新个体的 方法，而用核移植技术产生的动物叫克隆动物。 动物克隆技术( c l o n i n g ) ，又称核移植技术，它的基本操作是将一种高度分化的 细胞或细胞的核作为供体移植给完全去除了核的未受精的卵细胞，构建重组胚，通 过体内或体外培养、胚胎移植，产生与供体细胞基因型相同的后代。 与胚胎克隆技术相比，体细胞克隆技术有较多的优点，主要表现在繁殖数量不 受限制，遗传性征不会改变，便于采用转基因技术培育新的优良品种，不受父辈年 龄的影响等( 杨叔培，2 0 0 0 ) 。但同时也存在一些缺点，即未受精卵在经过剥离和 植入等一系列操作后，能够发育为克隆胚胎的比率不高，植入受体子宫内的着床率 低、流产率高。 1 9 9 7 年，位于美国威斯康辛州的a b s 环球公司宣布，以胚胎种系细胞为核供体 成功地克隆出一头荷斯坦公牛，名叫“基因 。1 9 9 7 年，位于美国渡士顿附近的a c t 公司采用胚胎期的成纤维细胞作为核供体，获得2 头克隆牛，分别取名“乔治打和 “查理。1 9 9 8 年2 月，法国农业研究中心的科学家利用胎儿肌肉细胞为核供体，克 甘肃农业大学2 0 0 8 届硕上学位论文 隆出一头小母牛，取名“玛格丽特 ，后由于碰伤感染细菌而死亡l9 9 8 年7 月5 日，在日本石川畜牧研究中心以青年母牛的辅卵管细胞为核供体，成功地克隆出2 头小牛，分别取名为“都能 和“加贺 。1 9 9 9 年，美国德克萨斯农业和机械大学 的乔纳坦一希尔等研究人员用一头老年( 2 l 岁) 公牛的体细胞克隆出一头小公牛，取 名“第二次机会 。2 0 0 0 年1 月，日本科学家利用克隆牛的体细胞克隆的第二代克 隆牛通过剖腹而降生，这在世界上尚属首次。这头克隆牛所使用的体细胞来自1 9 9 9 年2 月初出生的第一代雄性克隆牛的耳细胞。2 0 0 0 年4 月2 6 日，日本雪印乳业公司 通过从荷斯坦母牛初乳中提取出乳腺细胞加以培养并把细胞核移植到未受精卵中， 而后再把这些卵子移植到数头母牛子宫中发育而成的乳腺细胞克隆牛降生，得到2 头克隆牛，都为雌性。 近几年来，通过努力，国内各个实验室在克隆技术方面正不断取得进步，但各 个实验室得到的实验数据又都有很大的差异。中国农业大学农业生物技术国家重点 实验室在将体细胞转染后，尝试生产转基因克隆。囊胚率为3 0 一5 0 。胚胎移植后 初期妊娠率在3 0 - 5 0 ( g o n ggc 等，2 0 0 4 ) ；而获得克隆后代的效率仅在1 0 - 2 0 左右。陈大元等克隆成年牛的耳皮肤成纤维细胞，得至u 2 6 1 、9 8 0 ( 2 6 6 3 ) 的囊胚 率，在总共获得的1 4 头胎儿中，有5 头存活，克隆效率为5 2 3 0 ( 2 1 7 ) ( c h e ndy 等， 2 0 0 3 ) 。 对于体细胞克隆牛，胚胎的囊胚率仅为2 卜5 ( w i l m u ti 等，2 0 0 2 ) 。到目前 为止，克隆牛出生率最高的研究是u r a k a w a 等用优化的方法挑选g 2 期早期的胎儿成纤 维细胞作供体，得到了2 8 7 桑椹胚囊胚率，移植了1 0 枚克隆胚胎，1 0 个受体全 部怀孕，并产下9 头牛犊( u r a k a w a 等，2 0 0 4 ) 。总之，虽然各个实验室之间克隆牛的 效率都不大一致，但能获得后代并存活到断奶期的效率都不高。 虽然体细胞克隆牛在生理和行为等方面也健康( l a n z ar p 等，2 0 0 1 ) ，但依然 存在以下几个方面的问题( 程金华，朱化彬等2 0 0 6 ) g ( 1 ) 生产效率低。国际体细 胞克隆牛培育的总体效率仅为1 0 左右。( 2 ) 流产率高。国际体细胞克隆牛流产率为 4 0 - 5 0 ，且妊娠全过程均会发生流产。( 3 ) 出生死亡和畸形率高。平均只有5 0 新生克隆牛犊能够成活，且大多需通过剖腹产出生。所以，研究胚胎发育率成为了 研究胚胎生物工程的热点问题。 研究胚胎的效率必须针对胚胎发育停滞的原因。对于体细胞克隆胚胎，近年来 国内外学者主要从以下两个方面探讨其发育率低的原因：( 1 ) 从供体细胞和受体细 2 甘肃农业大学2 0 0 8 届硕十学位论文 胞的协调性方面。表明将供体细胞同期于g o g 1 期能使克隆胚胎有较高的发育率 ( w i l m u ta 等，1 9 9 7 ) ； ( 2 ) 从供体核的重编机制方面。表明对供体细胞和胚胎 进行去甲基化试剂和促乙酰化试剂的处理有利于供体核的重编程( k i s h i g a m is 等， 2 0 0 7 ) 。 2 牛的体外受精技术研究进展 随着哺乳动物胚胎工程技术的深入研究和商业性胚胎移植技术的迅猛发展，对 卵母细胞和胚胎需求量日益增加。单纯依靠超数排卵获得卵母细胞和胚胎的方法， 不但费用高，而且获得的数量有限，远远不能满足科学研究和生产的需求。因此， 研究和开发卵母细胞体外成熟( i nv i t r om a t u r a t i o n ，i ) 、体外受精( i nv i t r o f e r t i l i z a t i o n ，i v f ) 和受精卵的体外培养( i nv i t r oc u l t u r e ，i v c ) 及冷冻保存 ( f r e e z i n gc o n s e r v a t i o n ，f c ) 技术，建立一套完全在体外培养条件下快速生产和保 存大量优质廉价卵母细胞和胚胎的技术十分必要。其不仅有利于充分挖掘优良母畜 的繁殖潜力，加速良种家畜的繁殖和育种进程，为胚胎工程的其它研究如胚胎细胞 移植、胚胎干细胞系的建立、基因转移、胚胎性别鉴定、胚胎嵌合等提供合适的研 究材料，促进胚胎工厂化生产进程；而且有利于揭示雌、雄配子在成熟、获能过程 中的形态、生理变化及受精机理与早期胚胎的发育本质，评定精子质量并建立适合 于进行体外受精的优良精予库，为受精生物学、发育生物学及低温生物学等学科提 供重要的理论依据。此外，该技术在拯救濒危动物和开发利用珍稀动物等方面也具 有重要的意义。 哺乳动物体外受精的研究已经有1 2 0 多年的历史。自张明觉利用获能处理的精 子进行体外受精试验，并于1 9 5 9 年获得世界上首例“试管动物 试管兔( c h a n gm c ， 1 9 5 9 ) 体外受精先后在人( s t e p o epc 等，1 9 7 8 ) 、牛( b r a c k e t tbg 等，1 9 8 2 ) 、 绵羊( h a n a d aa 等，1 9 8 5 ) 、猪( c h e n gwtk 等，1 9 8 6 ) 上获得成功。 在牛上，二十世纪七十年代以前虽然已经在光镜下进行卵子及受精卵的形态学 研究。但是直到八十年代才取得了牛体外受精的重大突破。f l b r a c k e t t 获得第一头 试管牛以来，日本、美国、英国、丹麦、新西兰、意大利的许多学者都先后致力于 牛体外受精的研究，生产出大量的牛胚胎，并开始向产业化方向迈进。日本1 9 8 8 年 生产试管牛1 6 0 头。从1 9 8 9 年就开始利用体外受精技术大批量生产肉牛胚胎用于胚胎 移植，以生产日本本地黑牛( 和占星等，1 9 9 9 ) 。至1 1 j 1 9 9 5 年，日本牛的体外受精技 3 甘肃农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 术实施单位达1 0 2 个，共移植4 6 4 2 头，产犊1 2 1 6 头，囊胚率达8 左右。 我国哺乳动物体外受精研究起步较晚，但二十世纪末期发展很快。特别是在牛 的体外受精方面有重大突破，1 9 8 9 年以来，旭日干等( 1 9 8 9 ) 、范必勤( 1 9 8 9 ) 、朱裕 鼎( 1 9 8 9 ) 、卢克焕等( 1 9 9 0 ) 、秦鹏春( 1 9 9 0 ) 、石德顺( 1 9 9 2 ) 等相继获得了试管牛。 随着商业性牛胚胎移植的迅速发展，牛胚胎的需求量日益增加，极大地促进了 对牛体外受精技术的研究。1 9 8 6 年，c r i s t e r 等和h a n a d a 等分别获得了牛卵母细胞 i v m - i v f 、异体培养、非手术移植试管犊牛( c r o z e tn 等，1 9 8 6 ；h a n a d aa 等，1 9 8 6 ) ； 同年，p a r r i s h 等首次采用精子上游法( s w i m - u p ) 分离活精子，大大改进了牛精子体 外获能的方法( p a r r i s hjj 等，1 9 8 6 ) 。1 9 8 7 年，卢克焕等用肝素( 1 0 0 u g m l ) 处 理上浮的牛精子进行精子体外获能，对体外成熟的牛卵母细胞进行体外受精，将受 精卵移到中间受体一绵羊的输卵管内发育，再移植到1 9 头牛受体牛子宫角，结果1 4 头牛妊娠( l ukh 等，1 9 8 7 ) 。1 9 8 8 年，g o t o 等和卢克焕等分别获得牛卵泡卵母细胞 i v m - i v f i v c 试管犊牛( g o t o 等，1 9 8 8 ) 。1 9 8 9 年，l u 等将3 8 枚i i v f 胚胎( 其中2 枚 为i y c 胚胎，3 6 枚为绵羊异体发育胚胎) 移植给2 0 头受体牛，结果1 5 头牛妊娠，其中 1 3 头妊娠期满，产下2 1 头活犊( l u 等，1 9 8 9 ) 。在我国广西，石德顺利用i v m - i v f i v c f c 路线，生产了大批牛胚胎，并经过胚胎移植，获得了2 0 0 余头试管黄牛犊( 蒙少宁， 1 9 9 8 ) 。在内蒙，旭日干课题组在澳大利亚和加拿大的胚胎生产基地上，利用体外 受精技术，生产了近4 万枚胚胎，并在国内进行胚胎移植，获得了良种试管牛犊3 5 0 余头( 旭日于等，1 9 9 3 ) 。 由于牛的体外受精技术具有很大的商业价值，其研究的深度、广度和实用化程 度不断增加，主要集中在提高卵母细胞的体外成熟率、体外受精率、体外发育率( 包 括卵裂率、桑椹胚发育率和囊胚发育率) 、移植受胎率等几项指标。经过近1 0 年的研 究，人们逐渐揭示出影响卵母细胞体外成熟率的各种因素，并从中探索出提高体外 成熟率的途径。在继续探索扩大卵母细胞来源、提高卵母细胞成熟率和体外受精率 的同时，许多学者重点研究了如何提高体外受精胚胎的体外发育率。其中，我国的 卢克焕等在1 9 8 7 至1 9 8 9 年间，利用绵羊输卵管作为中间受体，进行了大量的体外受 精卵发育研究，并获得高达6 0 的桑椹胚一囊胚发育率( l ukh 等，1 9 8 7 ；g o t ok 等， 1 9 8 8 ) 。花田章等( 1 9 8 6 - 一1 9 8 9 ) 以兔输卵管为中间受体也获得了4 9 3 的囊胚发育 率( 花田章，1 9 8 5 ) 。但这种中间受体培养法费用高，技术过程复杂，胚胎回收率也较 低，不适合大批量生产牛胚胎。在完全体外培养条件下，体外成熟卵母细胞的卵裂 4 甘肃农业大学2 0 0 8 届硕上学位论文 率最高为9 1 4 ( 7 4 8 1 ) ( l i n gz j 和l uk h ，1 9 9 0 ) ：体外受精卵至桑椹胚和囊胚 阶段的发育率为4 5 1 ( 6 0 1 3 3 ) ( y a n g 和l u ，1 9 9 0 ) 。我国广西农业大学卢晟盛( 1 9 9 4 ) 利用t c m l 9 9 + 1 0 a o c s 与颗粒细胞单层( g c m ) 共培养，囊胚发育率为4 7 1 。刘建民等 ( 1 9 9 3 ) 利用输卵管上皮细胞和颗粒细胞两种共培养系统，桑囊率为6 6 ( 8 5 1 2 9 ) ，胚 胎最终产值为3 5 ( 以受精时卵母细胞数目为基数) ( 刘建民等，1 9 9 3 ) 。尽管国内外 在试管牛的研究方面做了大量工作，所采用的培养系统能使9 0 以上的卵母细胞发育 成熟，8 0 9 6 的卵子完成正常受精和卵裂，但其中能在体外发育为可供移植的囊胚仅占 2 0 3 0 ，而且影响体外生产牛胚胎的因素非常多，不同实验室、生产厂家的生产 条件又很不一致，导致体外受精卵的卵裂率和囊胚体外发育率结果不稳定，因而其 体外受精的总成功率仍偏低，一般仅为3 5 左右。因此，目前对牛卵母细胞体外成熟、 体外受精和受精卵的体外发育培养的系列研究仍然在继续。 国内外在体外受精牛的研究方面做了大量工作，所采用的培养系统能使9 0 以上 的卵母细胞发育成熟，8 0 的卵子完成正常受精和卵裂，但其中能在体外发育为可供 胚胎移植的囊胚仅为2 0 - 3 0 。体外受精的总成功率仍偏低，一般仅为3 5 左右( 马 平等，2 0 0 6 ) 。 从胚胎细胞分子生物学方面来看，胚胎细胞中染色体的稳定遗传可保证胚胎的 正常发育。而体外受精胚胎和克隆胚胎中纺锤体是否正常装配、中心体能否正常复 制随即成为值得探讨的问题。中心体的异常伴随着细胞分裂的异常。目前，有关中 心体复制调控的研究多见于体细胞有丝分裂和肿瘤的研究，而对于体外受精胚胎和 克隆胚胎中心体的重编程以及调控的研究则是少之又少。 对于体外受精胚胎，染色体异常可导致发育停滞、妊娠失败、附植阶段的胚胎 丢失、围产期胎儿死亡和先天性畸形( w i l m u ta 等1 9 9 7 ；k i s h i g a m is 等2 0 0 7 ) 。 然而对克隆胚胎核型的研究表明：4 7 的胚胎中染色体没有排列在中极板或分散于中 心板( d a iy p 等，2 0 0 6 ) 。因此可以推断，与体外受精胚胎相似，克隆胚胎的染色 体异常也能导致胚胎发育异常。 3 中心体概述 3 1 中心体的结构 中心体是真核生物细胞内的一种小的非膜性细胞器。在电镜下观察，中心体由 两个互相垂直的中心粒( c e n t r i o l e ) 与周围透明的、电子密度高的中心粒周围物质 5 甘肃农业大学2 0 0 8 届硕十学位论文 ( p e r i c e n t r i o l a rm a t r i xp c m ) 构成。中心粒呈中空的圆筒状，筒壁由9 组三联微 管组成。在正常间期细胞，中心体只有1 个，位于细胞中部的细胞核附近；在有丝分 裂期细胞则为2 个，位于纺锤体的两极( d o x s e ys ，1 9 9 8 ) 。 3 2 中心体的功能 中心体在细胞分裂间期和分裂期的细胞中的功能是作为主要的微管组织中心 ( m i c r o t u b u l eo r g a n i z i n gc e n t e r ，m t o c ) 参与维持细胞的形态和细胞运动，它在 间期细胞中调节微管的数量、稳定性、极性和空间分布，在有丝分裂过程中建立两 极纺锤体。随着细胞分裂的进展，染色体在纺锤体微管的牵引下向两极移动，将复 制后的染色体分配到两个子细胞中( s c h u y l e rs c 等，2 0 0 1 ) ，以维持基因组的稳 定。在细胞有丝分裂中，染色体的分离和核的重新组装均需要有功能的中心体( d a i y p 等，2 0 0 6 ) 。在有丝分裂期只存在两个中心体是确保姐妹染色质均等分配到两个 子细胞的关键。如果中心体发生异常，将会导致细胞不能分裂或异常分裂。 3 3 中心体的复制过程 细胞中有两种物质成分需要精确复制，一个是染色体，另一个就是中心体。中 心体是半保留复制，与d n a 复制相耦联，也开始于g 1 s 。正常情况下，在每个细胞周 期中，中心体复制一次( s a l i s b u r yjl 等，2 0 0 4 ) ，产生2 个中心体，并被分配到 2 个子细胞中。从形态学看中心体复制分为四个步骤：中心粒的开裂、子中心粒的复 制和延长、中心体的断裂、新中心体的成熟及分离( b o m e n sm ，2 0 0 2 ) 。 在g l 晚期或s 早期，成对的两个中心粒移动并彼此分开，失去典型的互相垂直的 排列，中心粒周围物质也随两个中心粒的分离而移动。在s 期每个亲本中心粒的末端 开始萌发前体中心粒并逐渐延长。在g 2 期，前体中心粒继续延长到与母中心粒相同 的长度，复制过程完成，这时每个新形成的中心体包括一个亲本中心粒和一个新生 成的中心粒。在g 2 晚期或m 早期，中心体体积增大，中心粒周围物质体积也增大，纺 锤体微管开始生成，接着纺锤体微管相互之间产生滑动，并与中心粒周围物质蛋白 相互作用使两个姊妹中心体分离，直至形成有丝分裂的两极纺锤体。 4c d k 2 在细胞中心体复制调控中的作用 4 1 细胞周期蛋白依赖性激酶( c y c l i nd e p e n d e n tk i n a s e ，c d k s ) 中心体复制的精细调控可发生在细胞周期的每一个阶段。已发现的与细胞周期 6 甘肃农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 调控有关的分子很多，可分为三大类：细胞周期蛋白( c y c l i n ) 、细胞周期蛋白依赖 性激酶( c y c l i nd e p e n d e n tk i n a s e ，c d k s ) 、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子 ( c y c l i nd e p e n d e n tk i n a s ei n h i b i t o r ，c k i ) ，其中，c d k s 是细胞周期调控网络的 核心分子，处于中心地位( e v a ng i 等，2 0 0 1 ) 。c y c l i n 对c d k 具有正调控作用， c k i 有负调控作用，它们共同构成了细胞周期调控的分子基础( g o a t ss 等，1 9 9 6 ) 。 c d k s 是一类依赖细胞周期蛋白( c y c l i n ) 的蛋白激酶，以与c y c l i n 结合的复合 形式出现，驱动细胞周期各时相进程，引起细胞的生长和增殖，在哺乳动物中已发 现7 个成员：c d k i ( c d c 2 ) 、c d k 2 c d k 7 。它们彼此在d n a 序列上的同源性超过4 0 ， 其蛋白产物相对分子质量为3 0 - - 4 0 k d a ，有一个催化核心，均属丝氨酸和苏氨酸激酶。 c d k s 在整个细胞周期中的含量是平稳的，但在细胞周期不同时相中，不同c y c l i n 的 集聚与相应c d k s 结合并被激活。 b a i l l y 等通过研究c y c l i nb s n c d k i 在中心体的定位及c y c l i na 、c y c l i nb 对微 管的作用，证实c d k 具有调控中心体复制及分裂的作用( b a i l l ye 等，1 9 8 9 ) 。 4 2 细胞周期蛋白依赖性激酶2 ( c d k 2 ) h i n c h c l i f f e 和s l u d e r 等研究发现细胞中心体的复制需要c d k 2 ，并且c d k 2 可以使 细胞通过细胞分裂周期，有助于确保中心体在正确的时间内仅复制一次 ( h i n c h c l i f f ee h 等，2 0 0 1 ) 。c d k 2 与c y c l i ne 或c y c l i na 结合，分别在g 1 s 期和 m 期一直发挥作用。c d k 2 在整个细胞周期中表达水平保持不变。c d k 2 是启动d n a 复制 的关键激酶，也是g 2 期运行的必要因子。研究表明细胞由g 1 期进入s 期需要c d k 2 及 c y c l i ne 的共同参与，c d k 2 周期蛋白e 激酶复合物在驱动细胞周期从g 1 期向s 期进展 过程中起决定性作用。此复合物也为中心体复制所必需。c d k 2 的活性与中心粒的开 裂直接相关( s t e a r n st ，2 0 0 1 ) 。当细胞进入s 期后，c y c l i ne 降解，c d k 2 转而与 c y c l i na 结合，推进细胞由s 期越过限制点进入g 2 期。c d k 2 是g l 期向s 期转变的主要 限速因子，其过表达能加速s 期进程，使细胞过度增殖。 c d k 2 是中心体复制周期的关键调节因子，因为中心体复制可以被c d k 2 的蛋白抑 制因子p 2 1 以及c d k 2 的抗体所阻断，而过量纯化的c d k 2 可以恢复中心体复制 ( t a r a p o r ep 等，2 0 0 2 ) 。o k u d a 等研究认为核磷蛋白( n u c l e o p h o s m i n ，n p m ) 可 能是c d k 2 的靶点，在g 1 期，这种蛋白特异性地与未复制的中心体结合，并且在s 期和 g 2 期被c d k 2 磷酸化后与中心体分离。用抗核磷蛋白的抗体显微注射入3 t 3 成纤维细 7 甘肃农业大学2 0 0 8 届硕上学位论文 胞，可以阻断核磷蛋白的磷酸化，从而抑制中心体复制( o k u d am 等，2 0 0 0 ) 。 c d k 2 有两个与中心体复制相关的底物。一个是m p s - l p 激酶，另一个 n u c l e o p h o s m i n b 2 3 蛋白。 4 2 1t l p s 一1 p 激酶 作为c d k 2 周期蛋白e 调控中心体复制的途径之一，m p s 一1 p 为一细胞周期依赖性 性激酶，在g 2 m 达到高峰，是细胞增殖性激酶。中心体复制与细胞周期的协调由 m p s i p 在多水平控制。m p s - l p 定位于中心体和着丝点蛋白复合体上，受c d k 2 的调节 参与中心体的复制和有丝分裂纺锤体检验点( s p i n d l ec h e c k p o i n t ) ( a b e i e ua 等， 2 0 0 1 ) 。纺锤体检验点是一个重要的细胞分裂化调节通路，监督染色体正确分离和 传代，m p s - l p 激酶是纺锤体检验点信号通路的组成成分之一( 王建英等，2 0 0 6 ) 。 研究发现m p s - l p 突变可抑制中心体复制，而过表达m p s i p 将导致s 期停滞的细胞 多次复制中心粒和中心体。然而，m p s - l p 激酶作为c d k 2 周期蛋白e 的底物，其活性 受c d k 2 的调节，使其具有稳定性。 4 2 2n u c l e o p h o s m i n b 2 3 蛋白 n u c l e o p h o s m i n 8 2 3 蛋白位于细胞核仁内，也称作n u c l e o p h o s m i n ( n p m ) 、 n u m a t r i n 或n 0 3 8 蛋白，是一种多功能的细胞磷酸化蛋白。它参与r n a 装配与合成 ( i t a h a n ak 等，2 0 0 3 ) 、染色体复制( o k u d am 等，2 0 0 2 ) ，在细胞生长和增殖 中发挥重要的作用。此外，研究表明，b 2 3 是细胞核基质蛋白( f e u e r s t e i nn 等， 1 9 8 7 ) 和银染核仁组织者区域蛋白( l i s c h w em a 等，1 9 7 9 ) ，参与监控核仁活性及 细胞增生( d e r e n z i n im 等，1 9 9 5 ) 。 n u c l e o p h o s m i n b 2 3 蛋白是c d k 2 周期蛋白e 调控中心体复制的另一个途径。它 是一个原癌基因表达产物，也是c d k 2 周期蛋白e 的底物，为核内磷酸化蛋白，其非 磷酸化形式可以与中心体结合( o k u d am 等，2 0 0 0 ) 。通过抑制两个中心粒的分离而 阻止中心体的复制。细胞进入g 1 s 期边界时，n p m b 2 3 被c d k 2 周期蛋白e 磷酸化从中 心体上解离下来，中心体复制开始进行：在s 和g 2 期，n p m b 2 3 被c d k l 周期蛋白b 去 磷酸化后重新结合于成熟的中心体上阻止其再复制，直到胞质分裂完成。子细胞各 获得一个中心体并进入g 1 s 期边界时，激活状态的c d k 2 周期蛋白e 再度使其磷酸化 而从中心体上解离下来，启始新一轮的中心体复制周期。因此n p m b 2 3 是中心体复 制的关卡分子，它保证了中心体和d n a 的协同复制( o k u d am ，2 0 0 2 ) 。 8 甘肃农业大学2 0 0 8 届硕上学位论文 n p m 剔除的纯合子小鼠体细胞分裂异常，出现中心体复制失控和纺锤丝结构缺 陷，形成四倍体，说明n p m 是维持基因组稳定性所必需的( g r i s e n d is 等，2 0 0 5 ) 。 5p 5 3 蛋白在细胞中心体复制调控中的作用 0 5 3 基因，位于染色体1 7 p 1 3 1 ，基因全长1 6 2 0 k b ，含1 1 个外显子，2 1 1 外 显子编码分子量为5 3 k d 的p 5 3 核内磷酸化蛋白。正常野生型p 5 3 活化后可诱导多种 细胞生物学行为，如调控细胞周期、诱导细胞凋亡、细胞分化、细胞衰老、d n a 修复， 以及抑制血管生成等。在细胞周期中，p 5 3 蛋白通过阻止g 。期细胞进入s 期，使受损 的d n a 或染色体有时间得以修复；若d n a 或染色体损伤过于严重时，p 5 3 能触发凋亡 机制清除受损的细胞。近来，p 5 3 研究的热点集中在自身表达、细胞周期调控和诱导 细胞凋亡。 棚于抑癌基因家族，也和中心体复制调控有关。斌因在细胞周期的各个 时期都定位于中心体上。野生型燃称为“基因组卫士，它通过对包括d n a 损伤、 核糖核苷酸缺失、微管断裂、调控点错误以及由癌基因激活产生的遗传压力进行反 应，在保持基因组稳定性中具有关键作用( c h e ns s 等，2 0 0 2 ；m u r p h yk l 等，2 0 0 0 ) 。 大多数p 蹶变是等位基因丢失，而非点突变。在蒯失的细胞中，染色体不稳定、 染色体倍性异常、基因扩增、重组增多等现象都有发现( m u r p h yk l 等，2 0 0 0 ；o u y a n g x 等，2 0 0 1 ) 。通过基因敲除使臌失，可引起中心体复制的失调，从而导致有丝 分裂异常( t a r a p o r ep 等，2 0 0 2 ；k r a m e rh 等，2 0 0 4 ) 。研究者将野生型p 5 3 - 弓1 入 施失细胞或将野生型面鳄i 入人卵巢癌细胞，都能导致细胞生长率降低，g 2 m 停 滞和中心体异常发生减少( l a n g eb m