（动物遗传育种与繁殖专业论文）小鼠胚胎类干细胞分离、培养的研究.pdf

摘要 本实验对昆明白小鼠胚胎干细胞分离、培养、传代以及鉴定进行了研究。 胚胎培养使用了两种方法，其一：以小鼠胎儿成纤维细胞为饲养层，t c m 1 9 9 + 1 0 f b s 为胚胎培养基，在3 7 ，5 c 0 2 ，1 0 0 湿度条件下，培养胚胎 4 - 6 天后，发育至孵化囊胚阶段。其二：将小鼠胚胎培养在t c m1 9 9 + 1 0 f b s + 0 i n g m l l i f 胚胎培养基中，于相同的培养条件下，无饲养层培养卜2 天， 发育到孵化囊胚阶段。两种方法获得的囊胚贴壁率分别为4 3 4 8 和3 1 2 5 ， 差异不显著( p 0 0 5 ) 。 孵化囊胚贴壁增殖，内细胞团呈圆柱状生长。将圆柱状内细胞团用0 1 2 5 t r y p s i n + 0 0 2 e d t a 消化液反复消化，分离获得3 - 4 个细胞的小团块，将其培 养在有饲养层和无饲养层培养体系中。均获得了类胚胎干细胞集落。 从培养的囊胚中分离获得的类胚胎干细胞集落，经传代培养获得了5 株胚 胎干细胞株，在体外可传代培养到7 代，冷冻保存复苏后，干细胞仍能存活、 增殖。干细胞集落呈克隆状生长，边缘光滑，细胞致密地聚集在一起，类似鸟巢状， 细胞间界限不清。经碱性磷酸酶染色，呈现强阳性。证明为类胚胎干细胞集落。 关键词：成纤维细胞；内细胞团：类胚胎干细胞；碱性磷酸酶染色 a b s t r a c t t h e a i mo ft h i sp a p e rw a st os t u d yt h ei s o l a t i o n ，c u l t u r ea n dc h a r a c t e r i z a t i o no f e m b r y o n i cs t e mc e l lo f k u n m i n gw h i t em o u s e t w om e t h o d sw e r eu s e dt oc u l t u r ee m b r y o ：m e t h o d1 ：t h ee m b r y oa r e i n c u b a t e dt ob l a s t u l as t a t ei nt c m l 9 9b a s a lc u l t u r em e d i u ma d d e d1 0 f b su n d e r 5 c o2a n d10 0 h u m i d i t yc o n d i t i o na t3 7 o f ft h ef e e d e rl a y e rm a d eb ym o u s e e m b r y o n i cf i b r o b l a s t s ( m e f ) f o r4 - 6d a y s m e t h o d2 ：t h ee m b r y oa r ei n c u b a t e dt ob l a s t u l as t a t ei nt c m l 9 9b a s a lc u l t u r e m e d i u ma d d e d1 0 f b sa n d0 1 l i fu n d e rt h es a m ec u l t u r ec o n d i t i o nw i t h o u t u s i n gf e e d e rl a y e rf o r1 - 2d a y s ，t h er a t eo fb l a s t u l aa d h e r e n c ew e r e4 3 4 8 a n d 31 2 5 r e s p e c t i v e l yb yt w om e t h o d s ，a n dt h ed i f f e r e n c eo f t h e mw a si n s i g n i f i c a n t t h eb l a s t u l ac e l la t t a c h e da n d p r o l i f e r a t e d ，i n n e rc e l lm a s sp r e s e n t e dc o l u m n e d g r o w t ht h ec o l u m n e di n n e rc e l lm a s sw e r ed i g e s t e dm a n yt i m e sw i t h01 2 5 t y p s i n a n do 0 2 e d t a ，t h e nt h ec e l lm a s sc o m p r i s e d3 - 4c e l l sw e r es e p a r a t e dt oc u r u r eo n f e e d e rl a y e rt h ec o l o n yo fe m b r y o n i cs t e mc e l lw e r eo b t a i n e dw i t ho rw i t h o u tf e e d e r l a y e rs y s t e m t h ec o l o n yo fe m b r y o n i cs t e mc e l l s e p a r a t e df r o mb l a s t u l ac o u l dg a i nf i v e s t r a i n so fe m b r y o n i cs t e mc e l la n dg od o w nt op o s t e r i t yf 7i nv i t r o t h es t e mc e l l s u r v i v e da n dp r o l i f e r a t e da f t e ra n a b i o s i sf r o mf r e e z ep r e s e r v i n gs t a t e t h ec o l o n yo f s t e mc e l lp r e s e n t e dc l o n e dg r o w t h ，t h ec e l le d g ew a ss l i p p e r ya n dm a s s e dc o m p a c t e d b i r d sn e s t l i k e ，t h el i m i ta m o n gc e l l sw e r em i s t y ，t h ee m b r y o n i cs t e mc e l lw e r e p r o v e db ya k pa c t i v i t ys t a i n i n gb e c a u s eo f p r e s e n t i n gs t r o n gm a s c u l i n e k e y w o r d s ：f i b r o b l a s t ；i n n e rc e l lm a s s ；e m b r y o n i cs t e mc e l l l i k e ；a k pa c t i v i t y s t a i n i n g d ir e c t e db y ：p r o f z h o uh u a n m i n a p p i ic a n tf o rm a s t e rd e g r e e ：l ia n gy a n( a n i m a lg e n e t i c sb r e e d i n g r e p r o d u c t i o n ) ( c o l l e g eo f a n i m a ls c i e n c ea n d m e d i c i n e ，i n n e r m o n g o l i a a g r i c u l t u r a l u m v e r s i t y ，h u h h o t0 1 0 0 1 s ，c h i n a ) 内蒙古农业大学硕士学位论文 1 1 引言 干细胞( s t e mc e l l ，s c ) 是一类具自我更新和高度分化潜能的细胞，它能够无 限的增殖分裂，也可在较长时间内处于静止状态。自然条件下干细胞是用来控制 和维持细胞再生的。一般来说，在干细胞和其终末分化的子代细胞之间存在着中 间祖细胞群，被称为“定向祖细胞”，它们具有一定的扩增能力和分化潜能“1 。这 些细胞群能够使干细胞每次分裂后产生分化细胞的数量增多。干细胞可以通过两 种分裂方式生长，一种是非对称性分裂，另一种是对称性分裂0 1 。在其发育期间， 干细胞能够通过对称性分裂扩增它们的数量，或者通过非对称性分裂进行自我更 新并产生更多不同分化类型的祖细胞。 干细胞的研究与应用是2 0 世纪末和本世纪初自然科学发展最为迅猛的领域 之一。“干细胞研究的新发现”在美国( ( s c i e n c e ) ) 杂志公布的1 9 9 9 年的十大科学 成果中名列榜首，并于2 0 0 0 年再度入选世界十大科学成果。 我国从8 0 年代后期开始了胚胎干细胞的研究工作。研究早期，尚克刚( 1 9 8 9 、 1 9 9 3 、1 9 9 4 ) 、丛笑倩等( 1 9 9 0 ) 分别成功建立昆明白、c 5 7 b l 6 j 、1 2 9 等品系小 鼠胚胎干细胞。先后选用小鼠作为胚胎干细胞研究材料，是由于小鼠具有取材方 便，繁殖周期短，产仔数量多，操作方便等特点，是研究哺乳动物胚胎干细胞的 理想材料。 本实验的目的在于，采用昆明白品系小鼠作为材料，进行胚胎干细胞分离、 培养、传代及鉴定的基础性研究。并且通过本研究获得成熟的实验方法。 1 1 干细胞的研究进展 “干细胞”一词最早出现于1 9 世纪。1 8 9 6 年，eb w i l s o n 在一篇论述细胞生 物学的文献中第一次使用这个词，用来描述存在于寄生虫生殖系统的祖细胞。随 着科学的发展，人们对干细胞的认识也逐渐深入。1 9 6 1 年t i l l 和m c c u l l o c h 首先 描述了造血干细胞的特性：将骨髓细胞悬液静脉注射入受致死剂量x 射线照射的 小鼠体内，注入的细胞在脾中形成集落( 脾结节) 。t i l l 和m c c u l l o c h 认为“这种 来自集落的细胞，同时具有多向分化和自我更新的能力，就具有了造血干细胞的 特点”。1 9 8 1 年，英国剑桥大学的e v a n s 和k a u f m a n 从1 2 9 s v 小鼠延迟着床的 囊胚中分离获得了小鼠内细胞团细胞并建立了胚胎干细胞系，称为e k 细胞。同 年，美国华盛顿大学的m a r t i n 从用畸胎瘤细胞条件培养基培养的i c r 小鼠早期 胚胎中也分离出了胚胎性的干细胞，称为e s 细胞。1 。e k 细胞和e s 细胞是同 一类型的细胞“1 ，这两种细胞现在均被称为e s 细胞( e m b r y o n i cs t e mc e l l s ) 。从 此以后，胚胎干细胞的研究不断的扩展和深入。1 9 8 3 年，k a u f m a n 和r o b e r t s o n 等人利用孤雌生殖的胚胎建立了e s 细胞系。1 9 8 4 年，a x e l r o d 从培养的完整 囊胚中直接分离得到了e s 细胞系o “1 ：b r a d l e y 等人证明e s 细胞系能够参与 2 小鼠胚胎干细胞分离、培养的研究 种系的嵌合”1 。1 9 8 9 年，e i s t e r e r 通过离散小鼠的桑椹胚，分离得到e s 细胞。 1 9 9 0 年，m a n n 等人从孤雄生殖的胚胎中获得了e s 细胞系“。w a k a y a m a 等人 “”从经过核移植的成年体细胞中分离、建立了e s 细胞系，而且该细胞系能够在 嵌合体形成中参与种系发育o “。 上世纪9 0 年代以来，研究人员相继对猪、牛、绵羊、山羊、水貂等其它哺乳 动物的e s 细胞进行了深入研究。如n o t a r i a n n i ( 1 9 9 0 ) 、p i e d r a h i t a ( 1 9 9 0 ) 、 s t r o f e k k ( 1 9 9 0 ) 、a n d e r s o n ( 1 9 9 0 ) 和w h e e l e r ( 1 9 9 4 ) 各自建立了猪的类e s 细胞 系。s a i t o ( 1 9 9 2 ) 、s t r e l c h e n k o ( 1 9 9 4 ) 和s t i e e ( 1 9 9 3 ) 建立了牛的类e s 细胞系“”。 c r a v e s ( 1 9 9 3 ) 、n i e 2 m a n n ( 1 9 9 4 ) 建立了兔的类e s 细胞系。t s u c h i y a ( 1 9 9 4 ) 、 m e i n e c k e 、t i l l m a n n ( 1 9 9 6 ) 建立了绵羊e s 细胞系。b o n g s o ( 1 9 9 4 ) 、m e i n e k e ( 1 9 9 6 ) 和t i l l m a n n ( 1 9 9 6 ) 建立了山羊的类e s 细胞系。t i l l h o m o s o n 等( 1 9 9 8 ) 建立了人 的类e s 细胞系并进行了鉴定。研究结果表明“”，这些动物e s 细胞具有类似于 小鼠e s 细胞的特性。但是按照传统概念，只有确切证明这些动物的e s 细胞具 有形成嵌合体的能力才能称为干细胞，在这之前这些e s 细胞目前只能称作类 e s 细胞m 1 。 我国在e s 细胞方面的综合性研究起步较晚，但发展迅速。首先，在e s 细胞的 基础研究方面很有成效。尚克刚( 1 9 8 9 ，1 9 9 3 ，1 9 9 4 ) 、丛笑倩等( 1 9 9 0 ) 分别建立了 小鼠的e s 细胞系。赖学良( 1 9 9 5 1 建立了兔的e s 细胞系。西北农林科技大学家畜 生殖内分泌与胚胎工程农业部重点开放实验室，从1 9 9 4 年开始用早期胚胎相继分 离克隆出猪类e s 细胞，传代可达第5 代，牛类e s 细胞，传代可达第6 代：小鼠类 e s 细胞，传代可达第9 代。1 9 9 7 年，用分离流产儿原始生殖细胞克隆出人类e s 细胞，传4 代，最多传代可达第6 代。1 9 9 9 年，用该方法分离克隆出牛类e s 细胞， 并传代可达第1 5 代，冷冻保存。以上分离克隆得到的小鼠、猪、牛、羊和人的类 e s 细胞，除细胞和细胞集落形态具有e s 细胞特征外，分别经过a k p 染色，体内、 体外分化实验等将鉴定，有些作了核型分析，证明该细胞的多能性。其次，在e s 细 胞的应用方面也做出了显著的成果，中国军事医科学院的研究人员发现了“人胚胎 干细胞素”，并经过内地和台湾地区两万病例的临床应用后，发现了人胚胎干细胞 分泌素能刺激骨髓造血；刺激细胞增生，可用于再生障碍贫血的治疗；刺激白细胞 的再生，提高人免疫力，可望用于艾滋病的治疗；可以改善脑组织代谢功能，加快脑 血管意外后遗症的恢复等。 小鼠e s 细胞的分离与培养技术为人类e s 细胞的分离和培养奠定了坚实 的基础。1 9 9 8 年，美国威斯康星大学t h o m s o n 等分离人的内细胞团细胞，并成 功建立了人的胚胎干细胞系“。与此同时，g e a r h a r t 等从人的原始生殖细胞中建 立了胚胎生殖细胞系，随后以色列、澳大利亚、日本、新加坡、韩国等也先后从 体外受精卵分离获得人的胚胎干细胞系，并诱导胚胎干细胞生成神经细胞、造血 内蒙古农业大学硕士学位论文3 细胞、肌肉细胞、胰岛细胞”“、脂肪细胞e s l 软骨细胞池1 、平滑肌细胞啪1 骨细胞4 1 等。这使胚胎干细胞的研究更加令人关注，并在全世界范围内引起了干 细胞研究的热潮。 1 2 胚胎干细胞的培养及发育调控机制 与哺乳动物的受精卵( f e r t i l i z e do o c y t e ) 相比，胚胎干细胞虽然可以发育成三 个胚层内的任何细胞，但不能发育成完整的个体。因此胚胎干细胞是一种多能干 细胞。在合适的条件下不需要进行永生化处理，胚胎干细胞就具有无限增殖的能 力。胚胎干细胞是一种多潜能细胞，可以从早期胚胎的内细胞团( i n n e rc e l l m a s s ，i c m ) 或原生殖细胞( p r i m o r i d i a lg e r mc e l l s ，p g c s ) 分离出来，也可以通过体 细胞核移植获得。 1 2 1 胚胎来源干细胞的培养程序 饲养层的制备：目前，体外培养胚胎干细胞的方法归纳起来有两大类：有饲 养层培养法和无饲养层培养法。有饲养层培养法主要应用小鼠胚胎成纤维细胞 ( m o u s ee m b r y o n i cf i b r o b l a s t s ，m e f ) 和s i m 小鼠成纤维细胞耐硫代鸟嘌呤和耐乌 苯苷亚系s t o 细胞作为饲养层细胞，经丝裂霉素c 或y 射线处理终止其分裂后制 备成饲养单层( f e e d e rl a y e r ) ，将胚胎干细胞种植在这样的单层上。 获取早期胚胎：不同动物获取早期胚胎的时间不同，主要考虑以下方面因素： 在条件允许的情况下所取胚胎细胞尽可能的多；在体外易于培养增殖，并能 保持多能性。小鼠一般取2 5 3 5 d 桑椹胚或囊胚、2 ”；猪取9 1 0 d 囊胚】； 绵羊取7 8 d 囊胚或孵化胚。“；牛取6 7 d 桑椹胚。1 ；水貂取6 7 d 桑椹 胚或囊胚。“；人取7 8 d 囊胚1 。除从动物体内直接获取新鲜胚胎外，体外受 精所得胚胎与核移植所得的重构胚，亦可作为e s 细胞分离克隆的原材料。 早期胚胎培养及i c m 的获取：目前，早期胚胎培养多采用d m e m 培养基， 此培养基是m e m ( m i n i m u m e s s e n t i a lm e d i u m ) 培养基的改良品，适用于生长较快、 附着性较差的细胞培养。”。在早期胚胎培养和以后e s 细胞的培养中，培养液都 常添加1 3 - m e ( 1 3 m e r c a p t oe t h a n o l ，2 一巯基乙醇) ，它能使血清中含硫化合物还原成 谷胱甘肽，诱导细胞增殖，延缓细胞衰老，发挥非特异性激活作用，避免了过氧 化物对细胞的损害，对促进细胞生长有重要作用。此外，1 3 m e 还能促进分裂原 反应和d n a 合成，这一点对在体外难以培养的细胞来说尤其重要。 早期胚胎按照分离e s 细胞的传统方法0 1 ，是将胚胎从子宫中取出后，在饲 养层上培养至附植阶段。此时，胚胎的透明带脱去，以滋养层细胞贴于饲养层之 上，待i c m 增殖到一定程度，在实体镜下，用玻璃针剥离挑取i c m 然后把i c m 消化离散成小细胞团，接种于新鲜饲养层上。以后根据情况进行克隆传代、冷冻 4小鼠胚胎干细胞分离、培养的研究 保存等其它细胞操作。培养胚胎干细胞所用饲养层，一般为s t o 、p m e f 等。后 者因其材料易得、价格低廉且效果良好，而被更广泛采用。 除以上传统处理胚胎方式外，许多学者还尝试用其它处理方式，也取得了一 定的成绩。常见的有：免疫外科法o ”、热休克法“等。前者方法是将完整囊胚用 酸性台氏液处理，除去透明带，用h a n k s 液冲洗后将胚胎移入i c r 小鼠脾细胞 抗血清中，作用一段时间后，再移到含新鲜豚鼠血清的h a n k s 液中，从而破坏 了胚泡的滋养层，将剩下的i c m 离散即可获得e s 细胞克隆。后者是将体内发 育至2 细胞或桑椹胚阶段的胚胎，从输卵管或子宫中冲出，在高温下处理一定时 间。据报道，以此能增加e s 细胞的克隆率，原因是在胚胎分裂活跃期用热应激 处理，能阻滞胚胎分化，从而扩大了e s 细胞分离的时间范围。同时还有研究表 明臼5 1 ，热休克蛋白2 5 ( h s p 2 5 ) 与胚胎分化有关，可作为胚胎分化的标记。 e s 细胞培养传代：离散后的i c m 在饲养层上生长，营养满足其增殖需要的 情况下，小鼠e s 细胞集落一般2 3 天就会形成。必须定时传代，以防止e s 细 胞分化、变异。传代时，要挑取充分增殖而又未分化的集落，用消化液同时可以 辅以玻璃针剥离，使其二次离散，按种于新鲜饲养层上。e s 细胞具有无限增殖传 代的特性。但由于培养条件不完善或其它可能原因，目前，多数动物的e s 细胞 都很难无限传代下去。p i e d r a h i t a 发现e s 细胞各代之间随代数的增加1 ，克隆 数存在一定的递减规律( 见图1 ) 这一现象值得研究，这也是极大限制e s 细胞真 正走向生产实践的巨大障碍。 裁 登 蓄 雷 l23455789 恬代砍数 蚰 ” 0 内蒙古农业大学硕士学位论文 ：来扫鼠完整胚腧的鹪细胞系 口：来扫鼠内细胞团的船细胞系 ：来翻猪究整胚胎的b 细胞系 o ：采弱猿内细胞团的腊细胞系 ：素自羊究照胚艏的殿细胞系 ：来翔羊内细胞团的腾细胞系 图1e s 细胞传代数与克隆数的关系图 1 22 胚胎干细胞的生长特性 e s 细胞的体外培养，既要维持细胞的未分化状态和多潜能性，又要使其无限 增殖，一般e s 细胞的生长依赖于饲养层细胞。只有在饲养层细胞上或在含条件培 养基时，呈未分化状态。在不含条件培养基或饲养层细胞时，或在单层细胞培养条 件下，能分化成多种细胞。而且单层培养与聚集培养的e s 细胞在同等诱导条件下， 其分化方向各不相同。在悬浮培养条件下，形成类胚体，象早期胚胎那样发生有时 序的分化。同样，e s 细胞在聚集状态或高密度生长与低密度生长的单层培养状态 下，其生长不一样。聚集或高密度生长时e s 细胞分化成各种不同类型的细胞，而 低密度生长时仅分化成少数几种细胞。饲养层细胞的作用是提供e s 细胞贴壁生长 的环境和信号，分泌多种细胞因子抑 | 目j e s 细胞分化并促进其增殖。s m i t h 等以及 k o o p m a n 等认为，饲养层细胞对e s 细胞分化的抑制作用可能源自所用饲养细胞 的条件培养基。b r l 、h b c 5 6 3 7 、大鼠心肌细胞条件培养液等能有效地抑制e s 细 胞分化“”。目前采用的饲养层细胞有三种：s t o ( 一种已建系的小鼠胚胎成纤维细 胞) ，m e f ( 小鼠胚胎成纤维细胞) ，h e f ( 同源胚胎成纤维细胞) 。原代小鼠胚胎 成纤维细胞比s t o 等细胞系更有利于e s 细胞生长“”，这可能与细胞系因长期培 养和反复冻存等使其分泌细胞因子的能力下降有关。目前，采用人类成纤维细胞 或无饲养层也能成功培养传代人类e s 细胞o o 。这为人类e s 细胞的临床应用排除 了异源蛋白污染的屏障。a m i t 等用f o r e s k i n 作饲养层的无血清培养基，成功培养 人类e s 细胞，传至7 0 代并保持其多能性和未分化状态“”。l i n z h a oc h e n g 等研 究发现连续培养3 0d 传5 代以内的人类间充质干细胞无血清培养基能使人类e s 细胞保持未分化状态，最高传至1 3 代，而且这种培养体系有助于认识人类e s 细胞 自我更新过程中的细胞因子和粘附分子o “。1 9 9 0 年发现，只需饲养层细胞的细胞 外基质即可抑n e s 细胞分化，并证实是由于其胞外基质中存在大量锚定的l i f 活 性”。之后相继发现了几种分化抑制因子，女i i d i a ( 分化抑制因子) 、l i f 、h i l d a ( 人 白细胞介素) ，并证明了它们在体外同样具有抑n e s 细胞分化的作用“”。其中 6 小鼠胚胎干细胞分离、培养的研究 l i f 是一种多向性的细胞因子。许多实验证明，l i f 是维持小鼠e s 细胞体外增殖 和多能性的关键因子。小鼠e s 细胞克隆数依赖于l i f 的浓度，当l i f 浓度为l 0 0 0 50 0 01 l t m l 时，9 5 以上的细胞表现为e s 细胞表型，当l i f 浓度下降为 5 0 1 0 0i u p m l 时，e s 细胞克隆数也相应下降至5 0 6 0 嘣。外源l i f 可使 e s 细胞在未分化状态下长期培养，将l i f 基因转入e s 细胞，可使e s 细胞不依赖 外源性l 长期增殖且不分化，不影响e s 细胞的多向分化潜能”。撤除饲养层细 胞和分化抑制因子后继续培养，e s 细胞可分化发育为含外、中、内三个胚层细胞 的拟胚胎体，可检测到心肌细胞，造血细胞，血管内皮细胞，腺体细胞和骨骼肌细胞 等细胞的特异性抗原，培养介质中可检测到a2 甲胎蛋白，绒毛促性腺激素等n 刀。 1 2 3 胚胎干细胞的内源性调控 不对称分裂对e s 细胞自我复制非常重要，通过细胞质内活性物质的不对称分 布，个子代干细胞保留了于细胞所必需的信息，实现e s 细胞的自我复制：另外 一个子细胞因为不包含作为干细胞的必须成分，而从此走向分化。然而，在大多 数哺乳动物细胞中，不是每一个e s 细胞的每一次分裂都遵循不对称分裂的规律， 自我复制和细胞分化的平衡是在群体意义上实现的“”。e s 细胞可选择全部分化， 半数分化或全部自我复制，而选择的根据是e s 细胞内外环境协同作用的结果。 e s 细胞的不对称分裂是通过e s 细胞内的一些结构蛋白调控的，细胞的结构蛋白 则往往是通过纺锤体的位置来调节e s 细胞的不对称分裂。有一种叫做血影小体 ( s p e c t r o s o m e ) 的细胞器，它包括各种膜骨架蛋白，血影蛋白和a 型周期素 ( c y c l i n e a ) 等，血影小体与纺锤体的一级相连，通过固定纺锤体的位置而决定 e s 细胞的分裂方向，从而把维持e s 细胞形状所必需的成分保留在一个子代干细 胞中，实现干细胞的自我复制，另一个干细胞则走向分化”。周期素很可能也参 与了干细胞的不对称分裂的调控。在生殖干细胞的发育中，g 1 周期素d 1 、d 2 、 d 3 、a 2 只在干细胞中表达，而其他一些周期素在精子发育后期才表达。，因此，推 测周期素的选择性表达和生殖干细胞的不对称分裂有关o ”。 c h a m b e r si 等m 1 将敲除掉l i f 受体基因的e s 细胞放入小鼠胚胎成纤维饲养层 细胞中培养，发现了很多小而未分化的细胞群。所以除了m e f 饲养层分泌的因子 l i f 经过l i f 受体( l i f r ) 作用从而维持e s 细胞多潜能性外，肯定存在其他机制维 持未分化状态。于是他们从e s 细胞和m e f 共培养物中制备e d n a 文库，将文库 e d n a 来转染敲除掉l i f r 的l r k i 细胞并在无细胞因子的培养基内培养，发现有 两个池存在形状类似未分化状态的细胞。将其纯化的质粒d n a 再次转染l r k l 形成了表达o c t 4 的具有自我更新能力的e s 细胞。其e d n a 经测序发现是新基因， 为纪念凯而特( c e l t i c ) 传说中的地名，t i rn a no g ，将该基因命名为n a n o g 。”。 g e n b a n k 序列号为a y 2 7 8 9 5 1 。m i t s u i k 等利用另外一种方法也同样发现了n a n o g ， 内蒙古农业大学硕士学位论文 7 w a n gsh 等研究发现和n a n o g 具有同样表达特性的基因e n k “。之后很多实验 室通过不同手段验证了n a n o g 的特异性表达啪1 “。为防止混淆，统一命名为n a n o g 。 1 2 4 胚胎干细胞的增殖调控机制 在合适的培养条件下，不需预先永生化处理，e s 细胞就具有无限增殖能力。 长期培养的e s 细胞仍保持完整核型。e s 细胞内的调控分子和细胞外信号协同作 用，维持了e s 细胞的这种干细胞生物学特性。 在发育早期的胚胎、生殖细胞、未分化的e s 细胞中都有一种转录调节因子： o c t 3 4 ，它是p o u 转录因子家族成员之一。在体内，o c t 一3 4 的表达对于受精卵 最初阶段的发育和e s c 多向分化潜能的维持是必须的“”。如果o c t 一3 4 的表达过 少，e s 细胞就会失去自我更新能力，发生非正常分化，分化成滋养层细胞而非正 常分化的内胚层和中胚层。在干细胞增殖中o c t 一3 4 起到关键作用，但单是o c t 一3 4 不足以维持细胞的多能性表型，还需要一些外部信号参与。 1 2 5 端粒体的长度和干细胞的增殖和分化的关系 敲除端粒体( t e l o m e r e ) 基因的小鼠造血干细胞的自我复制能力下降；雄性鼠 的精细胞发育也受到障碍。因为端粒的长度和染色体的功能状态有关，因此，染 色体的功能状态可能决定了干细胞的增殖和分化。”。 1 2 6 胚胎干细胞的外源性调控 除了内源性调控外，胚胎干细胞的分化还受到周围组织及细胞外基质等外源 性因素的影响。 体外培养胚胎干细胞分化成为各种终末分化的细胞，所使用的调控方式就是 外源性调控。如：利用外源性调控细胞因子转化生长因子b ( t r a n s f o r m i n gg r o w t h f a c t o r1 3 ，t g f 一1 3 ) 、骨形态蛋白2 ( b o n em i r p h g e n e t i cp r o t e i n ，b m p 2 ) 、成纤维生 长因子( f i b r o b l a s tg r o w t hf a c t o r , f g f ) 2 、f g f l 、血小板源性生长因子b b ( p l a t e l e t d e r i v e dg r o w t hf a c t o rb b ，p d g f b b ) 、胰岛素样生长因子( i n s u l i n l i k e g r o w t hf a c t o l i g f ) 和促红细胞生长素( e r y t h r o p o i e t i n ，e p o ) ，使其与e s 细胞表面 受体结合，调控n k x 2 5 、g a t a 4 、a t f 一2 和m e f 2 a 等早期心肌形成转录因子的表 达，诱导胚胎干细胞向心肌细胞定向分化“。 1 2 7 自我更新中细胞因子的作用 在体外进行扩增培养的e s 细胞，可以保持正常二倍体核型和未分化状态但 必须依赖于白血病抑制因子l i f ( 1 e u k e m i ai n h i b i t o r y f a c t o r , l i f ) 。如果缺少l i f ， 体外培养的e s 细胞就会停止自我复制，从而发生分化。另外，其它一些细胞因 小鼠胚胎干细胞分离、培养的研究 子可以替代l i f ，如人的o s m ( o n c o s t a t i nm ，o s m ) 和大鼠c n t f ( c i l i a r y n e u r o t r o p h i cf a c t o r , c n t f ) ，这些细胞因子与l i f 共用同一个细胞膜受体g p l 3 0 乜0 1 。 如果在体外长期培养e s 细胞，最好的方法是将e s 细胞培养在滋养层细胞上， 这些滋养层细胞可以合成并分泌e s 细胞所需要l i f ；另一种方法是将l i f 添加 到细胞外基质中来培养e s 细胞。l 对e s 细胞作用并不是诱导o c t 一3 4 的表达， 实验证明，通过转基因方法在细胞内表达o c t 3 4 并不能改变细胞对l i f 的需要“”。 如果e s 细胞培养中，不加入l i f 或没用饲养层细胞，e s 细胞可以继续增殖，但 几天后就会出现分化现象，细胞自我更新能力因分化而受到抑制”。e s 细胞的增 殖是自主进行的，它似乎不存在g 。期的细胞周期检查点。在缺乏l i f 、血清、 生长因子而e s 细胞自主增殖达到一定密度时，e s 细胞也可维持存活，表明其存 活也可依赖细胞产生的自分泌信号。干细胞中，l i f 是通过j a k s t a t ( 1 a n u s k i n a s e s i g n a lt r a n s d u c e r sa n da c t i v a t o r so t t r a n s c r i p t i o n ，j a k s t a t ) 信号转导通路来 维持自我复制以及未分化状态的【“。l i f 的受体是一类细胞因子超家族受体，这 类受体与酪氨酸激酶相连，当l i f 与受体结合活化了j a k 的激酶活性后，s t a t 以及核转录因子被激活，它们共同调节基因表达。 1 3 胚胎干细胞的定向诱导分化 1 3 1 胚胎干细胞分化的分子调控机制 胚胎干细胞在适宜的环境下具有定向分化为各种细胞的潜能。h e i s s i g 等。” 认为微环境对于干细胞的自我更新和其细胞命运的抉择是非常重要的，此外细胞 和细胞的接触对于细胞分化也同样重要。有人认为，多种诱导剂作用可使干细胞 分化形成多种细胞，如造血细胞、血管内皮细胞和神经细胞等。胚胎干细胞定向 分化常用策略有以下几种：撤去培养液内的白血病抑制因子或饲养层细胞，e s 将进行分化，并可表达内、中胚层的标记物。n i s h i k a w a 等。”研究证实，单层培 养的细胞可分化产生各种中胚层亚群，用荧光激活细胞分选法( f l u o r e s c e n c e a c t i v a t e dc e l ls o r t i n g ，f a c s ) 可分离到内皮细胞和造血祖细胞。y a m a s h i t a 等阻9 1 将 这些祖细胞培养后，发育形成了脉管：触发e s 细胞分化需要在悬浮培养时进行 细胞聚集。这可导致类胚体( e m b r y o i db o d i e s ，e b s ) 多分化结构的形成。e b s 是一 种细胞结构团块，不属于正常的胚胎发育，其内部含有3 个胚层的组织，仅在体外 条件下产生；利用生物可降解的三维框架，使人胚胎干细胞( h u m a ne m b r y o n i c s t e mc e l l ，h e s c ) 在其表面生长，并分化为类组织结构，生物框架是用5 0 多聚乳 糖羟基乙酸( p o l y l a c t i c c o g l y c o l i ca c i d ，p l g a ) 和5 0 多聚左旋乳糖酸( p o l y l 1 a c t i ca c i d ，p l g a ) 混合制成。前者降解迅速常用于细胞生长，后者为细胞生长提 供坚固的支架。将已分化的h e s ( e b s 形成的第8 天) 接种到三维框架表面，并在 其中加入诱导细胞进一步分化的因子：维甲酸( r e t i n o i ca c i d ，r a ) 、t g f 一1 3 、胰 内蒙古农业大学硕士学位论文 9 岛素样生长因子1 ( i n s u l i n l i k eg r o w t hf a c t o r ，i g f 一1 ) 。i g f 的作用是诱导大的 开放的管状结构形成。t g f b 的作用是诱导分泌类软骨黏多糖组织的生成， a c t - a 和i g f 一1 能诱导内胚层分化为类肝细胞，r a 能诱导外胚层的分化和三维的 类神经外胚层结构的形成。使用框架方法的优点是在框架中与分化有关的蛋白， 如细胞角蛋白( c y t o k e r m i n ) 、甲胎蛋白( 一f e t o p r o t e i n ，d f p ) 和巢蛋白( n e s t i n ) 可呈现更高表达。因此在促进细胞分化和同质性方面聚合框架要比单纯使用e b s 更合适，而且体积相对小的e b s 和e b s 间的高程度异同性使得在移植应用方面创 造功能组织有着一定的局限性“；分别将8 种生长因子用于人e s 细胞的分化 诱导，得到的结果是：转化生长因子( t r a n s f o r m i n gg r o w t h f a c t o l t g f 2 1 ) 和激活 素2 a ( a c t i v i n ，a c t - 2 a ) 可抑制内、外胚层的细胞发生，但可允许中胚层，如肌细 胞的分化。维甲酸、碱性成纤维细胞生长因子( b a s i cf i b r o b l a s tg r o w t hf a c t o r ，b f g f ) 、成骨蛋白( b o n em o r p h o g e n i cp r o t e i n ，b m p 2 4 ) 和表皮生长因子( e p i d e r m a l g r o w t h f a c t o r , e g f ) 可诱导内胚层和中胚层的细胞分化。神经生长因子( n e r v e g r o w t hf a c t o l n g f ) 和肝细胞生长因子( h e p a t o c y t eg r o w t hf a c t o f , h g f ) 非特异性 地可促使3 个胚层细胞的发育。 保持e s 细胞多能性的主要信号路径是l i f l i f r g p 一1 3 0 一j a k s t a t 3 。而占优势 的少量的s t a t 3 ( g p 一1 3 0 介导的信号传导途径中的下游效应分子之一) 的表达诱导 了e s 细胞的分化，但雌激素受体和s t a t 3 组成的融合蛋白能被它莫西芬激活， 从而抑制e s 细胞的分化和促进e s 的再生。另一个在e s 细胞内有活性的转录系统是 p o u 结构域的o c t 一4 转录因子。n i w a 等“”1 认为o c t 一4 的过度表达与l i f 撤退有相似 作用，即导致分化。 1 3 2 胚胎千细胞的诱导分化 胚胎干细胞是多能性干细胞。从理论上讲，它能分化为体内任何类型的细胞。 关于e s 细胞诱导分化的实验多集中在小鼠实验中，并已定向诱导形成了多种细胞。 正常的小鼠e s 细胞在体外分化都需一个最初的聚集步骤，即形成e b s 结构，再由 此分化为各类细胞。t i e s 细胞和小鼠e s 既有相似特征也有其独特的特征，它需要 胚胎成纤维细胞饲养层，增殖则需要小鼠饲养层细胞制备的条件培养液“1 。h e s 细胞在撤去饲养层细胞并且悬浮培养时可形成e b s ，并可表达神经、造血和心肌起 源的标志物”1 ，它的这种分化保持着自发性和无控制性。将h e s 注a b e i g e d x 鼠 体内，可形成3 个胚层的畸胎瘤。具体影响e b s 分化过程的生长因子有可诱导中胚 层的a c t - a t g f b1 ：可激活外胚层和中胚层分化的r a 、e g f 、b m p 4 和b f g f ； 可促进干细胞向内、中、外3 个胚层分化的n g f 和h g f 。 1 3 2 1 诱导分化为神经原 1 0 小鼠胚胎干细胞分离、培养的研究 e s 细胞可自发分化为神经元，但分化几率很小。主要是通过诱导进行分化， 其诱导方法有两种，一种是向形成的e b s 中加入r a 、b 龟f - 2 “”“；另一种方法是 在饲养层细胞上培养e s 细胞“。1 9 8 9 年，有人首先发现h g f 作为肝细胞的有 效的有丝分裂原。此后，在1 9 9 5 年、1 9 9 7 年和1 9 9 9 年又有人分别提出h g f 对神 经细胞也有作用。k a t o 等“在生长培养基和分化培养基中分别加入不同浓度的 h g f ，经免疫组织化学染色法显示添j 1 h h g f 后，有更多神经元出现的倾向，并认 为这一结果可能是由于促进了神经前体细胞的分化。 1 3 2 2 诱导分化为胰岛细胞 k i m 等“”1 应用e s 诱导分化形成成熟的类胰岛细胞团，在这些分化细胞的胞质 中有许多成熟的多晶型的胰岛素分泌颗粒，将该细胞移入用链脲霉素诱导的糖尿 病小鼠后能将血糖降至正常水平。m i y a z a k i 等“1 认为p d x 一1 ( 一种含同源结构域 的转录因子) 是胰腺发育的重要调控因子。在体外分化形成e b s 的过程中，同时 检澳o p d x 1 的表达对分化的影响，结果显示p d x 1 的表达明显地加强了分化细胞中 胰岛素2 、生长激素抑制素和葡萄糖激酶等基因的表达。免疫组织化学测试也显示 了胰岛素在分化的e s 细胞也呈现高度分泌的现象。因此应用外源性p d x 1 表达的 方法，对于e s 有效分化为有功能胰岛素样细胞开辟了广阔的前景。b e r n a t 等“1 用基因转染技术分化出了胰岛素分泌细胞。首先用细胞捕获系统( c e l l t r a p p i n g s y s t e m ) 从e s 细胞获得分泌胰岛素细胞的克隆，然后将新霉素基因选择系统嵌合 入人胰岛素基因调控区并允许其基因的表达，从而形成嵌合体，同时这种嵌合体 含有潮霉素抑制基因( h y r o m y c i nr e s i s t a n c eg e n e ，p 啦- h y g r o ) ，目的是用来选择转 染的细胞。含有1 65ug 总胰岛素蛋白的细胞克隆( i b 3 x 一9 9 ) 说明在各种促分泌 素存在的情况下具有体外调节激素的可控性。获得的这些细胞克隆以1 1 0 6 的密 度移植入链脲霉素诱导的糖尿病动物，移植动物在一个星期内纠正了高血糖症， 并在4 周内恢复了体重。而且腹膜内葡萄糖耐量实验说明，与对照组的小鼠相比， 移植小鼠有着更慢的恢复。这种方法开辟了i 型和i i 型糖尿病组织移植治疗的可 能性，并提供了基因治疗可供选择的方法。 近年来，关于诱导胚胎干细胞分化的报道陆续被发表，以上两种细胞以外， 胚胎干细胞还成功地诱导为肝细胞、心肌细胞等其它细胞。 1 4 胚胎干细胞的特点及鉴定 1 4 1 胚胎干细胞的生物学特性 胚胎干细胞具有多向分化潜能和自我更新能力。具体来说，有以下几方面干 细胞的基本生物学特性：属非终末分化细胞，终生保持未分化或低分化的特征， 缺乏分化标记：在机体的数目、位置相对恒定；具有自我更新能力：能无限分裂、 内蒙古农业大学硕士学位论文 l l 增殖。干细胞可分裂几代，也可在较长