（农药学专业论文）黄色链霉菌t111发酵产物性质及其对黄瓜菌核病菌作用方式初探.pdf

符号说明 c i ：c o n f i d e n c ei n t e r v a l ，置信区间 d ：d a y ，天 d n t p ：2 - d e o x y n u c l e o s i d e 一5 - t r i p h o s p h a t e ，三磷酸脱氧核苷 l b ：l u r i ab e r t a n ic u l t u r em e d i u m ，l b 培养基 m o l ：m o l e ，摩尔 o d ：o p t i c a ld e n s i t y ，光密度 p c r ：p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n , 聚合酶联反应 p d a ：p o t a t od e x t r o s ea g a r , 马铃薯葡萄糖琼脂 r ：c o r r e l a t i o n ，相关系数 r d n a ：r i b o s o m a ld n a ，核糖体d n a r 。m i d 1 ：r o t a t i o np e rm i n u t e ，转分 u v ：u l t r a - v i o l e t , 紫外 1 3 3 重寄生作用1 2 1 3 4 促进作物生长1 2 1 4 放线菌应用存在的问题及解决途径1 2 1 4 1 开发生防制剂的限制因素1 3 1 4 2 解决途径1 4 1 5 本研究的目的及意义15 2 材料与方法16 2 1 材料1 6 2 1 1 供试菌株1 6 2 1 2 供试培养基16 2 1 3 主要仪器与试剂16 2 2 拮抗放线菌发酵液抑茵活性测定方法1 7 2 2 1 平板对峙法l7 2 2 2 生长速率法17 2 2 3 琼脂孔扩散对峙法17 2 3 放线菌t 1 1 1 菌株鉴定1 7 2 3 1 形态观察1 7 2 3 2 生理生化测定1 8 2 3 31 6 sr d n a 序列测定及分析2 1 2 4t 1 11 发酵液性质2 5 2 4 1 抗菌谱2 5 2 4 2 抗茵效果的稳定性。2 5 2 4 3 热稳定性2 5 2 4 4p h 稳定性2 5 2 4 5 紫外光稳定性2 6 2 5 发酵培养基和发酵条件的优化2 6 2 5 1 供试发酵液的制备2 6 2 5 2 发酵培养基组分的优化2 6 2 5 3 发酵条件的优化。2 6 2 6 放线菌t l l l 发酵产物对黄瓜菌核病菌的作用方式研究2 7 2 6 1t l l l 发酵产物的制备2 7 2 6 2 t l l l 发酵产物对黄瓜菌核病菌菌丝生长的影响2 7 2 6 3t 1 l1 发酵产物对黄瓜菌核病菌菌丝形态的影响2 7 2 6 4t lll 发酵产物对黄瓜菌核病菌菌核形成及单重的影响2 7 2 6 5t 111 发酵产物对黄瓜菌核病菌菌核萌发的影响2 7 2 6 6t l l l 发酵产物对黄瓜菌核病菌菌丝体细胞膜渗透势的影响2 8 3 结果与分析2 9 3 1t ll1 菌株的生物学特性与1 6 sr d n a 鉴定2 9 3 1 1 形态观察结果2 9 3 1 2 生理生化特征2 9 3 2t l l l 发酵液的理化性质3 0 3 2 1 发酵液抗菌谱3 0 3 2 2 贮存稳定性3 1 3 2 3 热稳定性3 2 3 2 4 酸碱稳定性，3 2 3 2 5 紫外光稳定性3 3 3 3 培养基组分的优化3 3 3 3 1 碳源、氮源、无机盐对t l l l 发酵液活性的影响3 3 3 3 2 碳源、氮源和无机盐的正交优化3 5 3 4 发酵条件的优化3 7 3 4 1 不同发酵时间对t l l l 发酵液活性的影响3 7 3 4 2 不同发酵温度对t l l l 发酵液活性的影响3 7 3 4 3 不同初始p h 对t l l l 发酵液活性的影响3 8 3 4 4 不同接种量对t lll 发酵液活性的影响3 8 3 4 5 不同装液量对t 1 1 1 发酵液活性的影响3 9 3 4 6 不同转速对t l l l 发酵液活性的影响一4 0 3 5t lll 发酵产物对黄瓜菌核病菌的作用方式结果4 0 3 5 1t 1 11 发酵产物对黄瓜菌核病菌菌丝生长的影响结果4 0 3 5 2t 11 l 发酵产物对黄瓜菌核病菌菌丝形态的影响结果4 1 3 5 3t lll 发酵产物对黄瓜菌核病菌茵核形成及单重的影响结果4 1 3 5 4t lll 发酵产物对黄瓜菌核病菌菌核萌发的影响结果4 4 。3 5 5t 1ll 发酵产物对黄瓜菌核病菌菌丝体细胞膜渗透势的影响结果4 4 4 讨论4 6 4 1 放线菌t l l l 菌株鉴定的意义。4 6 4 2t 1 1l 菌株发酵优化的目的意义4 6 4 3t 1 1 l 菌株的生防应用前景4 7 4 4 发酵产物对黄瓜菌核病菌的作用方式4 7 5 结论。4 9 5 1 放线菌t l l l 菌株为黄色链霉菌。4 9 5 2t l l1 发酵液理化性质较为稳定，环境适应力强4 9 5 3 本研究获得了t ll1 的优化培养基及发酵条件4 9 5 4 t l l l 发酵产物对核盘茵的作用方式与常规杀菌剂不同4 9 6 参考文献51 7 致谢5 9 8 攻读学位期间发表论文。6 0 山东农业大学硕士学位论文 中文摘要 为进一步了解放线菌t i l l 菌株的拮抗作用方式，以黄瓜菌核病菌 s c l e r o t i n i a s c l e r o t i o r u m 为指示菌测定了该菌株发酵液的抑菌活性，优化了 发酵条件，并对发酵液进行了抗菌谱测定、理化性质分析，从而为进一步 生防应用打下基础。 l 、通过形态观察、生理生化测定结合1 6 sr d n a 序列分析确定了其 分类地位，结果表明，t l l l 与黄色链霉菌s t r e p t o m y c e st l a v u ss t r a i n n b r c 3 3 5 9 ( a b l 8 4 7 4 9 ) 序列的同源性最高，初步鉴定为黄色链霉菌 ( s t r e p t o m y c e s f l a v u s ) 。 2 、为明确放线菌t 1 1 1 的理化性质，研究了其抗菌谱，及贮存时间、 温度、酸碱条件、紫外光照射等对其发酵液稳定性的影响。结果表明，t i l l 发酵液对黄瓜菌核、黄瓜蔓枯、棉花红腐病菌等有较高的抑制活性；贮存 稳定性和热稳定性良好，4 c 贮存6 0 d 抑菌活性为对照的8 8 3 ，8 0 处 理6 0 m i n 抑菌活性为对照的9 0 9 ；对p h 值较敏感，在p h5 - 7 时活性 较高；对紫外线稳定，紫外光照射1 2 h ，其活性基本不受影响。 3 、为提高t i l l 发酵液的抑菌能力，采用单因素和正交试验设计法对 t i l l 发酵培养基的组成及发酵条件进行了优化。结果表明，最佳发酵培 养基组成为：可溶性淀粉5 9 ，大豆蛋白胨5 9 ，n a n 0 32 0 9 ，f e s 0 42 5 9 ， 去离子水1 0 0 0 m l ；最佳发酵条件为：发酵温度2 7 ，发酵时间5 d ，初始 p h6 0 ，接种量5 ，装液量7 5 m l 2 5 0 m l ，摇床转速1 5 0 r m i n 1 。采用优 化培养基及上述优化条件培养的t ill 发酵液，其抑菌率稳定在8 3 以上。 4 、初步研究了t 1 1 1 发酵产物对黄瓜菌核病菌的作用方式，采用菌丝 生长速率法测定了其对黄瓜菌核病菌s c l e r o t i n i as c l e r o t i o r u m 菌丝生长的 毒力，及其对菌丝形态、菌核形成、菌核萌发和菌体细胞膜透性的影响。 结果表明，t i l l 发酵产物对黄瓜菌核病菌菌丝生长的e c 5 0 值为 1 2 5 肛g m l ，低于对照药剂乙霉威及嘧霉胺；经发酵产物处理后，菌丝形 态出现黄化、畸形等现象，但尚未发现细胞质外渗；菌核形成的时间有所 延长，数量有所减少，且重量略有降低；在发酵产物浓度为2 5 0 i t g m l 时 黄色链霉菌t i ll 发酵产物性质及其对黄瓜菌核病菌作用方式初探 不能完全抑制菌核萌发；对菌体细胞膜渗透势的影响不大。 关键词：黄色链霉菌；黄瓜菌核病菌；发酵液；鉴定；性质；优化； 作用方式 2 山东农业大学硕士学位论文 a b s t r a c t t h ea n t i f u n g a la c t i v i t y , f e r m e n t a t i o nm e d i u m ，f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s a n d i n h i b i t o r y m e c h a n i s m s a g a i n s tc u c u m b e rs c l e r o t i u mp a t h o g e n o f f e r m e n t a t i o ne x t r a c to f s t r e p t o m y c e s f l a v u ss t r a i nt lllw e r ep r i m a r i l ys t u d i e d n l et a x o n o m i ci d e n t i f i c a t i o no ft h es t r a i nw a sc a r r i e do u tw i t ht h er e s u l t s o fm o r p h o l o g y , c u l t u r a la n db i o c h e m i c a lp r o p e r t yd e t e r m i n a t i o na n d16 s r d n as e q u e n c e sa n a l y s i s ，t h er e s u l t ss h o w e dt h a ttlllh a dt h en e a r e s t e v o l u t i o n a ld i s t a n c ew i t hs t r e p t o m y c e s f l a v u s 触n b r c 3 3 5 9 ( a b l8 4 7 4 9 ) ， a n di tw a si n i t i a l l yi d e n t i f i e da ss t r e p t o m y c e s f l a v u s ，玎1 e p h y s i c a la n dc h e m i c a lp r o p e r t i e so ft h ef e r m e n t a t i o ne x t r a c tw e r e s t u d i e db yu s i n ga g a r - w e l ld i f f u s i o nm e t h o d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h e f e r m e n t a t i o ne x t r a c t sh a dh i 曲i n h i b i t o r ya c t i v i t i e so ns c l e r o t i n i as c l e r o t i o r u m , a s c o c h y t ac i t r u l l i n aa n df u s a r i u mm o n i l i f o r m ev a r i n t e r m e d i u m a n di tw a s w e l l s t o r e da n dt h e r m a l s t a b l e ，8 8 3 o ft h ei n i t i a la c t i v i t i e sr e m a i n e da f t e r s t o r e d6 0 da t4 c ，9 0 9 o ft h ei n i t i a la c t i v i t i e sr e m a i n e da f t e rh e a t i n ga t8 0 ( 2 f o r6 0 r a i n mf e r m e n t a t i o ne x t r a c tw a ss e n s i t i v et ot h ec h a n g e so fp h ，o u l y i nt h ep hr a n g eo f5 - 7w a ss t a b l e ；t h ea n t i f u n g a la c t i v i t i e sw e r ea l m o s tn o t d e s t r o y e dw h e n i tw a su n d e ru vi r r a d i a t i o nf o r12 h i no r d e rt oi m p r o v et h ea c t i v 时o ftll1t op r o d u c ea n t i f u n g a ls u b s t a n c e ， t h ef e r m e n t a t i o nm e d i u ma n dc o n d i t i o n so ft h es t r a i nw e r es t u d i e dv i as i n g l e f a c t o rt e s ta n do r t h o g o n a ld e s i g n t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h eo p t i m a lm e d i u m w a sc o m p o s e do fs o l u b l es t a r c h5 9 ，s o y b e a nt r y p t o n e5 9 ，n a n 0 32 0 9 ，f e s 0 4 2 5 9 ，d e i o n i z e dw a t e ru pt ol0 0 0 m l ；t h eo p t i m a lc u l t u r a lc o n d i t i o n sw e r ea t 2 7 cw i t ht h ef e r m e n t a t i o nt i m e5d a y s ，i n i t i a lp h6 0 ，i n o c u l u mv o l u m e5 ， m e d i u mv o l u m e7 5 m l 2 5 0 m la n dr o t a t i o ns p e e d15 0 r m i n 一u n d e rs u c h c o n d i t i o n s ，t h ei n h i b i t o r yr a t eo ft h ef e r m e n t a t i o ne x t r a c to ftlllw a sk e p tu p t 08 3 t oa s c e r t a i nt h ea n t a g o n i s t i cm e c h a n i s m so ft h ea n t i f u n g a ls u b s t a n c et o & s c l e r o t i o r u m ，t h ei n h i b i t i o na c t i v i t i e so nm y c e l i u mg r o w t ha g a i n s t & s c l e r o t i o r u mw e r ed e t e r m i n e db ym y e e l i u mg r o w t hr a t em e t h o di nl a b a n di t s 3 黄色链霉菌t l li 发酵产物性质及其对黄瓜茵核病菌作用方式初探 e f f e c to nt h i sp a t h o g e n sb i o l o g yc h a r a c t e r i s t i c s ，s u c ha sm y c e l i u ms h a p e ， s c l e r o t i u mf o r m a t i o n ，s c l e r o t i u mg e r m i n a t i o na n dm e m b r a n eo s m o t i cp o t e n t i a l w e r ea l s os t u d i e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a ti t se c s ov a l u ew a s1 2 5 i t g m l ， w h i c hw a sl o w e rt h a nd i e t h o f e n c a r ba n dp y r i m e t h a n i l a f t e rt r e a t e d 、析t l lt h e a n t i f u n g a ls u b s t a n c e ，t h em y c e l i ab e c a m ee t i o l a t i o na n dm a l f o r m a t i o n , b u th a d n o ty e tf o u n di nt h ec y t o p l a s me x t r a v a s a t i o n t h i sa n t i f u n g a ls u b s t a n c ec o u l d d e l a yt h ef o r m a t i o no fs c l e r o t i u m ，t h es c l e r o t i u mn u m b e r sd e c r e a s e d c o n t r a s t e dt h a to ft h ew a t e rc o n t r o l ，a n dt h ew e i g h tr e d u c e ds l i g h t l y a tt h e c o n c e n t r a t i o no f2 5 0 i t g m lo ft h i sa n t i f u n g a ls u b s t a n c e ，i tc o u l dn o tr e s t r a i n t h es c l e r o t i u mg e r m i n a t i o nc o m p l e t e l y a n di th a dn os i g n i f i c a n te f f e c to nt h e m e m b r a n eo s m o t i cp o t e n t i a l k e yw o r d s ：s t r e p t o m y c e sf l a v u s ；s c l e r o t i n i as c l e r o t i o r u m ( l i b ) d eb a r y ； f e r m e n t a t i o ne x t r a c t ；i d e n t i f i c a t i o n ；p r o p e r t i e s ；o p t i m i z a t i o n ；a n t a g o n i s t i c m e c h a n i s m s 4 山东农业大学硕士学位论文 1 引言 植物土传病害，其病原菌一般为多寄主微生物，通常侵染植物根部， 引起植物根部乃至全株性病害。土传病害的发生和流行通常属于积年流行 病害，年度间波动不大。在防治方面，化学防治和抗病育种目前只对部分 病害有效，对大多数病害防效不甚理想( 王玉菊，1 9 9 5 ) 。黄瓜菌核病就 是近几年来严重为害温室黄瓜产量的一种重要土传病害，该菌以菌核的状 态在自然条件下可以长期存活，防治非常困难。目前生产上主要依靠化学 防治，但由于抗药性的发生，使得菌核病菌对多种杀菌剂存在着较高的抗 性。目前正在寻找一种简单、有效、安全的植物病害防治方法，即生物防 治。 生物防治是指通过除人以外的一种或多种生物来降低病原微生物数 量或减弱病原菌的致病能力，从而减少病原微生物所致病害的发生 ( b a c k e rk f ，1 9 8 7 ) 。它是通过植物、病原物、生防菌、植物表面及其 周围微生物群落和自然环境等因素的互作关系，来达到促生防病的作用 ( h a n d e l s m a nj ，e ta l ，1 9 9 6 ；涂玉琴，1 9 9 8 ) 。 拮抗微生物具有不易使病原菌产生抗性、对环境安全、生产工艺相对 简单以及不少微生物同时具有促进作物生长等优点而受到人们的关注和 重视( 裴炎等，1 9 9 9 ) 。利用拮抗微生物产生的抗菌物质进行生物防治已 成为研究的热点，已开发的有灭瘟素、放线菌酮、井冈霉素、多抗霉素、 农抗1 2 0 等。近年来，随着研究的深入和生防要求的提高，人们开始将更 多的注意力转移到一些新型抗茵物质上，如新型抗生素、抗真菌蛋白等， 因而需要不断地发掘和利用新的拮抗微生物资源。 1 1 黄瓜菌核病的研究现状 由病原菌s c l e r o t i n i a s c l e r o t i o r u m ( l i b ) d eb a r y 引起的黄瓜菌核病( 朱 建兰，2 0 0 1 ) ，是近年来我国北方保护地黄瓜产区经常发生的土传病害， 严重影响黄瓜的产量和品质，目前尚无高抗性品种和特效药剂问世，致使 该病的防治成为一个难题。黄瓜菌核病菌寄主范围广，除为害黄瓜外，还 可为害马铃薯、胡萝卜、菠菜、油菜、番茄、甜( 辣) 椒、茄子、蚕豆、 豌豆、芹菜及多种十字花科蔬菜，主要发生在连栋大棚保护地栽培黄瓜上。 ， 黄瓜菌核病菌菌丝体由茵核或子囊孢子萌发产生，可以相互纠集在一 5 黄色链霉菌t i l l 发酵产物性质及其对黄瓜菌核病菌作用方式初探 起形成鼠粪状菌核，菌核呈圆形或不规则形。菌核由皮层、拟薄壁细胞和 疏丝组织组成，具有抵抗不良环境的能力，可以越冬越夏。菌核萌发产生 子囊盘，子囊盘下有柄，子囊盘柄顶部伸出土表后，展开为子囊盘。子囊 盘上着生子囊。子囊之间有侧丝将子囊隔开。子囊内生8 个子囊孢子，子 囊孢子萌发产生菌丝。田间接种子囊孢子在适宜的条件下萌发可以引起严 重侵染( d a v i e sj ，1 9 8 6 ) ，且子囊孢子作为花期侵染源可以长距离传播 引起相邻地的植物受害( v e n e t t ej ，1 9 9 8 ) 。 黄瓜菌核病菌以菌核在土壤和病株残余组织内及混杂在种子中越冬 或越夏。菌核一般可存活两年左右。在环境条件适宜时，菌核萌发产生子 囊盘，子囊盘散放出的子囊孢子借气流传播蔓延，浸染衰老叶片或未脱落 的花瓣，穿过角质层直接侵入，引起初次浸染。侵入后病菌破坏寄主的细 胞和组织，扩散和破坏邻近未被病原物浸染的组织，并通过病、健株间的 接触，进行重复浸染。病叶与健叶或茎秆接触，带病花瓣落在健叶上，病 菌就可以扩展而使健全的茎叶发病。 由于核盘菌的病原及发生规律，短期轮作及化学药剂土壤处理均难以 获得理想的防治效果( 潘金菊等，2 0 0 6 ) 。目前生产上以化学防治为主， 但国内目前尚没有专门登记用于防治黄瓜菌核病的药剂。多年来该类病害 的防治药剂一直以苯并咪唑类杀菌剂多菌灵为主( f r a m i n ge ，e ta l ，1 9 8 4 ； s h a r m arc ，e ta l ，1 9 8 4 ) ，其作用机理是与茵体的微管蛋白结合，影响 与微管蛋白有关的代谢和功能，阻止菌丝的正常形成( y a r d e no ，e ta l ， 1 9 9 3 ；李红霞等，2 0 0 3 ) ，由于其作用位点单一，加上长期连续单一使用， 加速了病菌抗药性的产生，而且抗药性菌株分布范围逐年扩大，抗性比例 上升，导致多菌灵田间防效下降，并对类似作用方式的苯菌灵、甲基硫菌 灵、噻菌灵等产生了交互抗性( 石志琦等，2 0 0 0 ) ，致使该类药剂使用逐 渐减少，目前防治油菜菌核病的杀菌剂主要有菌核净、腐霉利、异菌脲等， 不过病菌对该类药剂仍存在较高的抗性风险( 张夕林等，1 9 9 9 ，2 0 0 3 ) 。 生物防治主要包括利用天敌、利用作物对病虫害的抗性防治，利用耕 作方法防治，利用昆虫不育和遗传、利用微生物防治。其中筛选拮抗微生 物是目前黄瓜菌核病生物防治的一个重要途径( 李国庆等，1 9 9 1 ； s h i m o s a k am ，e ta l ，1 9 9 5 ；廖晓兰等，2 0 0 0 ；b e n n e t ta ，e ta l ，2 0 0 6 ； 6 山东农业大学硕士学位论文 杨水英等，2 0 0 3 ) 。利用拮抗菌防治一些黄瓜植物病害的研究已取得一定 的进展( 张震等，2 0 0 4 ：l i ul ，1 9 9 5 ：陈士云，2 0 0 5 ) ，如抗生真菌盾壳 霉( w h i p p sj m ，e ta l ，1 9 9 2 ) 、细顶棍孢霉( u e c k e r ，e ta l ，1 9 7 8 ) 、抗 生细菌枯草芽孢杆菌( h u a n gh c ，e ta l ，1 9 9 3 ) 、紫附球菌( m e r c i e rj ， 1 9 8 7 ：z h o ut ，1 9 8 9 ) 和解淀粉芽孢杆菌等。叶片接种拮抗菌可以有效的 控制萌发的子囊孢子侵染衰老的花瓣( t u r k i n g t o nt - k ，e ta l ，1 9 9 3 ) 。 1 2 生物防治的研究概况 1 2 1 生防菌应用的种类 生防菌的种类繁多，生产上广泛应用的有真菌、细菌、放线菌等。真 菌主要有木霉菌、毛壳菌、酵母菌、淡紫拟青霉菌、厚壁孢子轮枝菌及菌 根真菌等；细菌主要有芽孢杆菌、假单胞杆菌等促进植物生长菌( p g p r ) 、 放射性土壤农杆菌和巴氏杆菌等；放线菌主要有链霉菌及其变种。 对生防真菌研究最广泛的是木霉菌( zr i c h o d e r m a ) ，常见的木霉菌有 哈茨木霉、绿色木霉、钩状木霉、长枝木霉、康氏木霉和绿粘帚霉等( 郭 润芳，2 0 0 1 ，2 0 0 2 ) 。它广泛存在于土壤及植物表面，经常可从植物病残 体、种子、球茎表面分离到。如文成敬等( 2 0 0 1 ) 将油菜菌核作为诱饵埋 入土壤中2 个月后从菌核表面和内部分离到5 2 株木霉，分别为黄绿木霉、 钩状木霉、哈茨木霉、康化木霉、拟康化木霉。 目前国际上用于防治土传病害的拮抗细菌常见的有以下属：产碱菌属 ( a s s i ss m p e ta l ，1 9 9 8 ) 、无定形孢囊菌属、节杆菌属、固氮菌属、芽 孢杆菌属、肠杆菌属、欧文氏菌属、黄杆菌属、哈夫尼菌属、小单孢菌属、 假单孢菌属、巴斯德氏芽菌属、根瘤菌属、沙雷氏菌属和黄单胞菌属 ( c h a n w a yc p ，1 9 9 7 ：h a n d e l s m a nj ，1 9 9 6 ：w e l l e r ，d m ，1 9 8 8 ) 。 已开发为生防农药的生防细菌主要有芽孢杆菌属、链霉菌属、假单胞菌属 和土壤杆菌属等。目前国内外( 范青等，2 0 0 0 ：崔林等，2 0 0 3 ：w a l k e r r ， e ta l ，1 9 9 8 ：谢关林等，2 0 0 6 ) 应用芽孢杆菌防治植物病害非常广泛，据报 道，芽孢杆菌对马铃薯环腐病菌( 田宏先等，2 0 0 1 ) 、梨灰霉病菌( m a dm ， e t a l ，1 9 9 6 ) 、油菜菌核病菌( 廖晓兰等，2 0 0 1 ) 、水稻白叶枯病菌( 林东 等，2 0 0 1 ) 、稻瘟病菌( 游春平，2 0 0 1 ) 和小麦赤霉病菌( 余桂容等，1 9 9 8 ) 、 西瓜枯萎病菌( 黎起秦，2 0 0 0 ) 等具有潜在的生防利用价值。张学君等 7 黄色链霉菌t i 1l 发酵产物性质及其对黄瓜菌核病菌作用方式初探 ( 1 9 9 5 ) 表明芽孢杆菌对棉花枯萎病菌、立枯病菌、黄萎病菌、炭疽病菌、 棉铃疫霉病菌和棉叶斑病菌均有强烈的抑菌作用。魏春妹等( 2 0 0 0 ) 制得 的生防制剂青枯散，不仅对青枯病菌的拮抗率为8 3 5 ，而且能促进番茄、 花生、黄瓜、烟草、油菜等作物生长。目前用于生防细菌的种类有：枯草 芽孢杆菌( 丑s u b t i l i s ) ( 黄海婵等，2 0 0 5 ) 、多粘芽孢杆菌( 丑p o l v m v x a ) 、 蜡状芽孢杆菌( 丑c e r e u s ) 、巨大芽孢杆菌( 丑m e g a t e r i u m ) 和短小芽孢杆 菌( 丑p u m i l i s ) 等( 程亮，2 0 0 3 ) 。 放线菌由于菌落呈放射状而得名。从c o h n ( 1 8 7 2 ) 发现放线菌至今， 已经报道了6 9 个属，1 6 8 7 个种( 阮继生等，1 9 9 0 ) 。应用于生物防治的 放线菌主要是链霉菌属( s t r e p t o m y c e s ) ，其次有诺卡茵属( n o e a r d i a ) 、游 动放线菌( a c t i n o p l a n e s ) 、小单孢菌属( m i c r o m o n o s p o r a ) 等( 方羽生， 2 0 0 1 ；魏艳敏，2 0 0 0 ) 。据统计，已发现的抗生素，6 1 7 是放线菌产生的 ( 朱宏建，2 0 0 7 ) 。而目前广泛应用的许多重要农用抗生素是从链霉 菌属中分离得到的放线菌所产生的。如井冈霉素用于防治水稻纹枯病， 在蔬菜上应用防治苗期立枯病和白绢病；春雷霉素用于防治黄瓜的炭疽 病、细菌性角斑病、枯萎病，番茄叶霉病；农抗1 2 0 主要用于防治蔬菜、 果树、花卉等作物的白粉病，对瓜果的炭疽病、番茄疫病也有一定防效； 多抗霉素防治瓜类、番茄白粉病、灰霉病，丝核菌引起的叶菜和其他蔬菜 的糜烂、猝倒病，以及黄瓜霜霉病和番茄晚疫病；农用链霉素主要用于防 治黄瓜角斑病等细菌性病害。 1 2 2 放线菌在植物病害防治中的应用现状 1 2 2 1 拮抗放线菌的直接利用 用放线菌制成的活细胞制剂，具有无毒、无残留、不伤害非靶标微生 物、与环境兼容性好、防病持效期长等优点。世界上已有许多利用抗生菌 防治土传病害的成功事例，如1 9 5 3 年从我国陕西省泾阳县的苜蓿根土中 分离获得的细黄链霉菌( & m i c r o f l a v u s ) ，用其制成的“5 4 0 6 ”抗生菌推 广的面积最大( 尹莘耘，1 9 8 4 ) 。它在生长过程中能分泌数种不同的抗生 素，抑制多种植物病原菌的生长，并能分泌激素促使植物细胞的分裂和伸 长。通过拌种将“5 4 0 6 抗生菌施于田间，具有防病、保苗和增产的效果。 世界上已广泛应用的另一种放线菌的活体制剂m y c o s t o p ( k o r t e m a a 8 放线菌的拮抗作用主要还在于其能产生抗生物质( 抗生素) 。抗生素 ( a n t i b i o t i c s ) 是微生物产生的、在低浓度下对其他微生物的生长有抑制 或杀灭作用的一类非酶类化学物质。放线菌是产生抗生素种类最多的一类 微生物，人类从放线菌中分离到的抗生素已达4 0 0 0 余种，仅只链霉菌属 而言就能产生1 0 0 0 多种( h a t s um ，e ta l ，1 9 9 0 ；1 w a m im ，e ta l ，1 9 8 5 ： l i g o n ，e ta l ，2 0 0 0 ) 。这些抗生素，不仅广泛应用于工业、医学领域，很 大一部分在农业生物防治中也起着至关重要的作用。防治植物真菌性病害 的农用抗生素： ( 1 ) 防治水稻病害的农用抗生素。使用农用抗生素防治水稻的真菌 性病害，在农用抗生素的应用研究史中起步较早，而且早期就取得了较好 的成绩。灭瘟素( b l a s t i c i d i ns ) 是日本竹内等人从土壤中分离的一株灰色 产色链霉菌( s t r e p t o m y c e sg r i s e o c h r o m o g e n e s ) 产生的一种抗生素，l l x g m l 的使用剂量即可完全抑制稻瘟病菌的孢子萌发，对菌丝的抑制作用比乙酸 苯汞强1 0 倍；春雷霉素( k a s u g a m y c i n ) 是日本梅泽等人分离得到的一株 放线菌( s t r e p t o m y c e sk a s u g a e n g g 西) 产生的抗生素，水稻植株喷洒春雷霉 素水溶液后，具有良好的内吸治疗效果。庆丰霉素是一种胞嘧啶核苷类碱 性水溶性抗生素，8 0 , e d m l 的使用剂量即可防治叶瘟病，效果达到 6 0 0 旷7 0 ：有效霉素( v a l i d a m y c i n ) 用于防治水稻纹枯病的效果很好， 是目前世界上使用面积最大的一种农用抗生素，已成为我国主要农药品种 之一，至今能在全国大面积推广应用( 柴全喜，1 9 9 4 ) 。灭瘟素、春雷霉 9 黄色链霉菌t i1l 发酵产物性质及其对黄瓜菌核病菌作用方式初探 素、有效霉素( 井冈霉素) 等的大面积推广应用逐渐代替了过去的常用的 稻瘟净、西力生、甲基胂酸钙等有机磷、有机汞和有机砷杀菌剂( 尹莘耘， 1 9 8 4 ) 。 ( 2 ) 防治麦类病害的农用抗生素。新农抗p 9 首先在美国研制成功， 3 p g m l 的使用剂量即能较好的防治小麦秆锈病；据报道，由我国研制的 放线菌酮，使用1 5 2 0 舢的剂量对秆锈病的防效达6 6 0 0 , - , 9 5 ，对小 麦赤霉病的防效也较好；抗霉菌素( 农抗1 2 0 ) 对小麦叶锈病也有一定的 防治效果；农抗1 2 0 、农抗1 0 5 n 1 、农抗8 6 1 、农抗1 3 5 4 7 、农抗8 8 6 、农 抗4 0 2 等对小麦赤霉病均有较好的防治效果。此外，庆丰素曾在我国四川 用于防治小麦白粉病取得一定效果；农抗1 1 8 7 a 对小麦根腐病有较好的 防病效果；公主岭霉素是一种高效低毒无残留、对人畜安全、使用方便的 种子消毒剂，该抗生素对种子传染的高粱散黑穗病( s p o i s o r i u mc r u e n t a ) 、 小麦光腥( t i l l e t i af o e t i d t e s a ) 和网腥黑穗病( t i l l e t i ac a r i e s ) 等均有较高 的防效；日本的大岳望分离的r u s t m i c i n 的4 个新型1 4 碳环大环内酯类抗 生素对小麦秆锈病的芽管伸长显示了特殊的抑制作用。 ( 3 ) 防治经济作物病害的农用抗生素。多抗霉素是目前防治经济作 物真菌性病害较好的农用抗生素，已在我国广泛应用，主要用于防治烟草 赤星病、苹果灰斑病和梨黑斑病；放线酮( a c i d i o n e ) 是一种抗真菌抗生 素用于防治菜豆、葡萄、桃树等褐斑病是非常有效的，但由于对植物的毒 性而限制了其广泛应用；灰黄霉素主要用于防治果树、蔬菜真菌性病害； 内疗素是吸水刺孢链霉菌( s t r e p t o m y c e sh y g r o s c o p i c u s ) 分泌产生的抗生 素，对品果树腐烂病，甘薯黑斑病、红麻炭疽病等防效较好；金真菌素 ( a u r e o f u n g i n ) 是多烯类抗生素，t h i r u m a l a c h a r 等人发现，其由肉桂色 链霉菌( s t r e p t o m y c e sc i n n a m o n e u s ) 产生，主要用于防治柑橘流胶病和苹 果白粉病，特别适合用于防治果实收获后的病害( 腐烂病) 及种子处理； 多效霉素是一株不吸水链霉菌白灰变种( & a h y g r o s c o p i c u sv a r h w a n n u s ) 所产生的抗生素，含有的四个组分对苹果和梨的腐烂病、橡胶树条溃疡病 多种炭疽病效果较好，对柑橘青梅、葡萄白腐、棉花立枯病和枯萎病有较 强的抑制作用；农抗1 2 0 是一种广谱性的抗真菌的核苷类抗生素，对花卉 白粉病、大白菜黑斑病辣椒炭疽病的防效很好；农抗s h 6 2 ，由高产突变 1 0 山东农业大学硕士学位论文 株b 2 6 0 9 产生的抗生素能抑制柑橘青霉、指状青霉和黑腐病菌等；中生 菌素属n 唐苷类抗生素，对大白菜软腐病、苹果轮纹病和早期落叶病等 具有很好的防治效果。 1 2 2 3 酶及其代谢物的利用 放线菌是一类比较特殊的微生物，它的生长比一般细菌和真菌慢，常 在天然有机物分解的后期起重要作用，这些特殊的生态习性反映了它们的 酶活性和代谢产物的作用( 徐长伦，1 9 9 4 ；杨石璋，1 9 9 8 ；n a i rm g ，e ta l ， 1 9 9 4 ) 。放线菌的代谢产物除了抗生素外，还有酶、有机酸、甾体化合物、 维生素、核苷酸以及酶抑制剂等。 植物病原高等真菌的细胞壁是以几丁质为骨架，以p 1 ，3 葡聚糖为主 要填充物组成。处于生长过程中的菌丝尖端几丁质多呈裸露状态，易被水 解酶所攻击而导致细胞破裂，生长受阻或者细胞死亡，阻止病害的发生发 展。据报道，7 的放线菌可以产生几丁质酶、p 1 ，3 葡聚糖酶等溶菌酶 ( e l t a r a b i l yk a ，e ta l ，2 0 0 0 ；g d i n g l i s ，e ta l ，2 0 0 2 ；g o o d f e l l o wm ， e ta l ，1 9 8 2 ；k a e 1 一t a r a h i l y ，e ta l ，2 0 0 0 ) ，因此对它的研究已经引起各 国植病生防工作者的高度重视。 放线菌的其他代谢产物在防治病害、促进作物的生长、提高作物产量 等方面也起着重要的作用，正越来越多地被人们开发和应用。 1 3 拮抗放线菌的主要作用方式 放线菌一般通过两种途径对靶标致病菌发挥生防作用：它能够在寄主 体外通过抗生作用、竞争作用、捕食和重寄生作用降低病原菌的致病性、 侵染效率以及接种体密度，导致病原菌群体密度以及致病性下降( 乔宏萍， 2 0 0 2 ) ，人们利用它的这一特性开发一些活体菌制剂。放线菌也可以在寄 主植物组织内，诱发其产生抗性或对寄主产生抑菌物质( 主要是抗生素) ， 影响病原菌的繁殖、生长，最后导致靶标致病菌死亡，在这方面对其产生 的抗生素研究较多。 1 3 1 抗生作用 抗生的发生主要依赖于生防菌抗生素的产生，一般单株生防放线菌可 以合成多种抗生素。抗生素的作用机理主要是：( 1 ) 抑制微生物细胞代谢 的某些环节或代谢中的某些酶系统，微生物重要代谢环节被抑制，生长发 黄色链霉菌t ill 发酵产物性质及其对黄瓜菌核病菌作用方式初探 育出现障碍，甚至死亡。( 2 ) 广谱抗生素的抗菌机制：某些抗生素能抑制 微生物共同的代谢途径，如蛋白质和核酸的合成，则可抑制许多