（动物营养与饲料科学专业论文）nisin、溶菌酶及蜂胶应用于盐水鹅保鲜效果的研究.pdf

张苗苗：n i s i n 、溶菌酶及蜂胶应用于盐水鹅保鲜效果的研究 1 n i s i n 、溶菌酶及蜂胶应用于盐水鹅保鲜效果的研究 研究生：张苗苗 导师：岑宁 ( 扬州大学动物科学与技术学院，扬州，2 2 5 0 0 9 ) 摘要 盐水鹅作为地方传统特色低温肉制品存在保质期短、携带不便等问题，困扰着 整个盐水鹅产业。生产中往往采用提高杀菌温度、延长杀菌时间以及添加防腐剂 等手段来延长产品的保质期。但是，高温杀菌虽然能在一定程度上杀灭产品中的 微生物，却大大破坏了产品的组织状态和风味，从而使盐水鹅失去原有特色。同 时，随着生活水平的提高以及消费观念的改善，人们对食品的要求已经不仅仅满 足于传统的色、香、味，而是更加注重产品的质量和安全，目前广泛应用的化学 防腐剂不再满足广大消费者的需要，寻找生物保鲜手段迫在眉睫。 本研究首先针对导致盐水鹅腐败变质的细菌进行分离鉴定；而后分别将n i s i n 、 蜂胶以及溶菌酶三生物保鲜剂应用于盐水鹅保鲜，比较其单一应用于盐水鹅保鲜 的效果；最后通过正交试验研究三种生物保鲜剂复合应用在盐水鹅上的最佳配比， 并通过经济成本核算，研究三者应用于盐水鹅生物保鲜的可行性。 研究结果表明： 1 导致盐水鹅腐败变质的细菌菌相主要有：欧文氏菌、假单胞菌属、葡萄球菌 属、芽孢杆菌、霉菌、微球菌、大肠菌群属以及产碱菌群属。 2 n i s i n 、蜂胶以及溶菌酶三者单一应用于盐水鹅进行生物保鲜，对盐水鹅中 细菌生长以及感官指标有影响程度不同。其中，n i s i n 和溶菌酶对感官指标的影响 不明显，而蜂胶对感官指标的影响则较大。三者抑菌效果：蜂胶 溶菌酶 n i s i n 。 3 n i s i n 、蜂胶以及溶菌酶三者复合的高效生物保鲜液在盐水鹅上应用的最佳 扬州大学硕士学位论文 配比是：蜂胶0 4 、溶菌酶5 0 0 i u g 、n i s i n 5 0 0 i u g 。在本试验条件下，该复合保 鲜液对进行盐水鹅生物保鲜使得产品1 5 0 下保质期延长至2 0 d 以上。 4 成本分析结果表明：n i s i n 、溶菌酶、蜂胶三者复合应用于盐水鹅生物保鲜的 成本是0 3 1 元k g 。综合分析，n i s i n 、溶菌酶、蜂胶应用于盐水鹅生物保鲜是可行 的。 关键词：盐水鹅；蜂胶；溶菌酶；n i s i n ；生物保鲜 鲞堕堕三一坐! ! 里：鳖堕鳖墨坚堕堕旦王垫查垫堡壁墼墨的砸窒主 e f f e c t so fp r o p o l i s ，l y s o z y m ea n dn i s i ni nt h e p r e s e r v a t i o no fs a l t e dg o o s e c a n d i d a t e ：z h a n gm i a o m i a o a d v i s o r ：c e nn i n g ( c o l l e g eo f a n i m a ls c i e n c ea n dt e c h n o l o g y , y a n g z l l o uu n i v e r s i t y , y a n g z h o u ， 2 2 5 0 0 9 ) a b s t r a c t m a n yp r o b l e m sw e r ef o u n di ns a l t e dg o o s e a sa t r a d i t i o n a lc h i n e s em e a t p r o d u c t s ， s h o r ts t o r a g ea n dt o o ki n c o n v e n i e n t l yh a v eb e e np u z z l e dt h ep r o p e r t yf o ral o n gt i m e w eo f t e na d v a n c e dt h et e m p e r a t u r ea n dt i m eo fs t e r i l i z a t i o no ra d d e dp r e s e r v a t i v e st o p r o l o n gt h es h e l f - l i f e b u t ，i tw o u l dd e s t r o yt h et i s s u ea n df l a v o rw h i l em o r em i c r o b e s w e r ek i l l e d c o n s e q u e n t l y , t h ec h a r a c t e r i s t i co fs a l t e dg o o s ew a sm i n e d a tt h es a m e t i m e ，t h eh e i g h t e no fs t a n d a r do fl i v i n ga n dt h ea m e n d e do fc o n s u m p t i o ni d e a lh a v e m a d ep e o p l ea p p e a lf o rn o to n l ys a v o r yb u ta l s ot h eq u a l i t ya n ds a f e t yo ff o o d 砀e c h e m i s t r yp r e s e r v a t i v e s ，w h i c hh a v eb e e na p p l i c a t e da b r o a d ，c o u l d n ts a t i s f i e du s ， b i o - p r e s e r v a t i o no fs a l t e dg o o s ew a ss t a r e di nt h ef a c e i no u rs t u d y , w es e p a r a t e da n di d e n t i f i e dt h eb a c t e r i u mo fs a l t e dg o o s ef i r s t l y t h e n , n i s i n ，l y s o z y m ea n dp r o p o l i sw e r ea p p l i c a t e dt os t u d yt h ee f f e c t so ft h e s ep r e s e r v a t i v e s s e p a r a t e l y a tl a s t ，a c c o r d i n gt ot h ec r o s s l i n kt e s t ，w ef o u n dt h eo p t i m u mp e r c e n t a g eo f n i s i n ，l y s o z y m ea n dp r o p o l i s o ft h eb i o - p r e s e r v a t i v e s f u r t h e r m o r e ，t h ec o s tw a s c a l c u l a t e dt os t u d yt h ef e a s i b i l i t yo ft h et h r e ep r e s e r v a t i v e sa p p l i c a t e di ns a l t e dg o o s e t h em a i nr e s u l t sw e r es h o w e da sf o l l o w i n g ： 1 e r w i n i a a m y l o v o r a , p s e u d o m o n a s ， s t a p h y l o c o c c u s , b a c i l l a c e a e ， m o l d s ， m i c r o c o c c a c e a e ，c o l i f o r mg r o u pa n da l c a l i g e n e sw e r ef o u n di ns a l t e dg o o s e 2 t h ee f f e c t so fn i s i n ，l y s o z y m ea n dp r o p o l i sw e r ed i f f e r e n t l y n i s i na n dl y s o z y m e h a d1 1 0s i g n i f i c a n ti n f l u e n c eo ns a v o r yo fs a l t e dg o o s e ，b u tp r o p o l i sh a d t h ei n h i b i t i o n 扬州大学硕士学位论文4 e f f e c to nm i c r o b e sw a s p r o p o l i s l o s o z y m e n i s i n 3 t h eo p t i m u mp e r c e n t a g eo fn i s i n ，l o s o z y m ea n dp r o p o l i si nt h ep r e s e r v a t i o no f s a l t e dg o o s ew a s ：n i s i n 5 0 0 i u g ，l o s o z y m e 5 0 0 i u ga n dp r o p o l i s 0 4 a tc o l r l m o n t e m p e r a t u r e ，t h es h e l f - l i f eo fs a l t e dg o o s ew a se x t e n d e dt oo v e r2 0 du n d e rt h i st r e a t 4 t h ec o s ta n a l y s i ss h o w e dt h a t ：t h ec o s to fn i s i n ，l o s o z y m ea n dp r o p o l i si nt h e p r e s e r v a t i o no f s a l t e dg o o s ew a s0 31y u a ne v e r yk i l o g r a m a c c o r d i n gt ot h ea g g r e g a t e a n a l y s i s ，i tw a sf e a s i b l et oa p p l i c a t et h e s eb i o - p r e s e r v a t i v e si ns a l t e dg o o s e k e y w o r d s ：s a l t e dg o o s e ，p r o p o l i s ，l o s o z y m e ，n i s i n ，b i o p r e s e r v a t i v e s 张苗苗：n i s i n 、溶菌酶及蜂胶应用于盐水鹅保鲜效果的研究4 3 扬州大学学位论文原创性声明和版权使用授权书 学位论文原创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导下独立进行研究工作所取得的研 究成果。除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含其他个人或集体已经发表 的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。 本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名： 降黟矽 签字日期：驴9 年6 月i j 日 f 学位论文版权使用授权书 本人完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向 国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子文档，允许论文被查阅和借阅。 本人授权扬州大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索， 可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权中国科学 技术信息研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并通过网络向 社会公众提供信息服务。 学位论文作者签名： f 弓石万 签字日期舻7 年月西日j 导师签名： 。粝詹 整堕堕! 堕! ! 垫：堕堕堕墨堕堕堕旦至垫坐垫堡壁墼墨的婴窒 一 主 1 1 盐水鹅研究进展 1 上- - j l 刖舌 鹅肉蛋白质含量高，胆固醇含量低，不饱和脂肪酸多，且含有大量的免疫球蛋 白，属于现代健康食品，因而成为绿色食品加工的理想原料【1 捌。盐水鹅作为地方 特色闻名遐迩，早在清代后期就开始生产，并一度曾成为宫廷贡品。盐水鹅自里 透黄、滋润光滑、清香醇厚、油而不腻、鲜嫩可口、形整似活，成为特色卤菜。 2 0 0 5 年扬州已有盐水鹅加工点3 4 0 0 多个，年加工盐水鹅1 0 0 0 多万只，扬州平均 日消费在1 5 万只以上1 3 j 。 盐水鹅作为传统特色肉制品，深受旅扬食客的好评。但是作为低温肉制品，其 口味清淡，肉质细嫩，营养丰富，货架期难以达到令人满意的效果，一直困扰着 整个盐水鹅产业。近年，系列的传统肉制品的保鲜问题受到了科研人员的关注。 但是，盐水鹅保鲜问题的研究却一直未取得显著成效。 扬州大学蒋云升、薛党辰还研究了有机酸类保鲜剂在扬州盐水鹅中应用的效 果，研究结果表明：加入定量的酒石酸和山梨酸钾有明显的抑菌防腐效果，同时 也能使得产品的保质期有一定程度的延长【4 】。另外，浙江大学陈有亮，程义平等人 研究了n i s i n 、乳酸钠和单辛酸甘油酯对延长盐水鹅货架期的影响，结果表明，n i s i n 1 0 0 0 u g ，n a l 2 ，单辛酸甘油酯( c s m g ) 0 0 2 可以取得很理想的效果。优化 试验表明，这种配比盐水鹅的货架期在7 c 达1 1 7 d ，2 5 为2 1 d ，3 7 为9 d ；其 菌相分析显示，各种菌属受到了很好的抑制【5 】。同时，蒋云升对盐水鹅在不同保藏 温度下茵落总数、菌相和p h 值的变化进行了试验。结果表明，当菌落总数达到 1 0 6 c f u g 、腿肌p h 值为6 5 以上时，产品有异味产生。腐败过程中的优势菌种，3 7 为肠球菌属和葡萄球菌属、2 0 为变形杆菌属、4 c 为假单胞菌属。对于当天制作 并于中午出售的盐水鹅，其保藏期限建议值为：3 7 不超过7 h ，2 0 c 不超过2 4 h ， 4 不超过6 天【6 。 但是，随着人们生活水平的提高，生活模式与消费观念的改变，人们对食品 扬州大学硕士学位论文 6 的要求已经不仅仅满足于传统的色、香、味，而更加关注的是食品的安全与环保。 食品的保存、防腐与保鲜成为人们普遍关注的问题。传统的并已经广泛使用的化 学防腐剂或具有一定的毒性或存在一定得安全隐患；而辐射贮藏、低温贮藏等物 理方法又因使用范围、操作技术等限制，很难广泛推广。因此，寻找安全、无毒 的生物保鲜技术成为人们研究的热点。 生物保鲜技术主要指以生物有机体或其组成部分为材料，运用现代生物科学 和其他多学科的知识和技术，按照预先的设计，对其进行控制、改革或者保鲜处 理，用来开发新产品或者新工艺的技术。目前，国内外食品界主要致力于从植物、 动物组织及微生物代谢产物中寻求天然食品防腐剂。研究中广泛采用的生物保鲜 剂的种类主要有：菌体次生代谢产物( 如：木酶发酵液) 、多糖类物质( 如：普鲁 兰多糖、壳聚糖等) 、抗菌肽( 如：n i s i n ) 、生物酶( 如：葡萄糖氧化酶、溶菌酶 等) 、微生物菌体( 如：啤酒酵母菌、链霉菌h 2 等) 、生物体自身天然成分( 如蜂 胶) 等同。 1 2n i s i n 1 2 1n i s i n 的结构以及理化性质 早在1 9 2 8 年，国外学者l a r o g e r s 已注意到乳酸链球菌产生的代谢产物可有 效地抑制某些细菌的生长。1 9 4 7 年，首次制备出乳酸链球菌素，并命名为“n i s i n 。 n i s i n 是由天然存在于牛乳中的乳酸链球菌( l a c t o c o c c u sl a c t i c ) 以牛奶为基质发酵 而成的小肽菌株产生的一种无毒副作用，热稳定的小分子多肽，它的分子式是 c 1 4 h 2 2 8 n 4 2 0 3 7 s 7 ，平均分子量为3 3 4 8 。 纯的n i s i n 是白色易流动粉末，在水中的溶解度为3 m g l ( p h 5 0 ) ，纯n i s i n 的活性约为4 0 x 1 0 6 i u g ，且活性在室温下以及酸性加热条件下均很稳定。n i s i n 能 抵抗各种革兰氏阳性菌的营养细胞及耐热的芽孢，同时，食用后在消化道内很快 被卜胰凝乳蛋白酶消化成氨基酸，不会改变肠道内正常菌群，不产生抗药性， n i s i n 半致死量与食盐相近，使用安全【8 1 。 1 2 2 n i s i n 作用机理 n i s i n 对g + 菌营养细胞和芽孢抗菌机理不同。人们对n i s i n 对营养细胞的抗菌 张苗苗：n i s i n 、溶菌酶及蜂胶应用于盐水鹅保鲜效果的研究7 机理有不同的看法。一种观点认为，n i s i n 吸附于细胞膜上，可以抑制细胞壁中肽 聚糖的生物合成，使细胞膜和磷脂化合物的合成受阻，导致细胞内物质外泄，引 起细胞裂解。另一观点认为n i s i n 的抗菌机理与d h a 和d h b 密切相关，因为n i s i n 中的d h a 和d h b 能够与敏感菌株细胞膜中某些酶的巯基发生作用，释放细胞质， 造成敏感细胞裂解。n i s i n 对芽孢的作用是在其萌发前期及膨胀期破坏其膜，以抑 制其发芽过程【9 1 。 1 2 3 n i s i n 应用于肉制品保鲜的研究进展 1 9 5 3 年，第一批商品化n i s i n 在英国面世，并在全世界范围内用于抑制热加工 食品、中性p h 值食品因细菌引起的腐败。1 9 6 9 年，联合国粮农组织和世界卫生 组织( f a o w h o ) 食品添加剂联合专家委员会确认n i s i n 可作为食品防腐剂。我 国于1 9 9 0 年开始批准使用。到目前为止，全世界约有5 0 多个国家和地区广泛使 用n i s i n ，英国已有4 0 多年的应用历史，并实现了工业化生产。 杨瑞采用正交实验、感官评定、破坏性实验及微生物分析等手段，全面研究 了n i s i n 及相关因素对即食腊肉质量的影响。结果表明：n i s i n 能降低即食腊肉的 杀菌温度，并很好地保持其色泽、风味。用n i s i n 保藏即食腊肉的最佳工艺条件： n i s i n l g l ，加热温度8 0 c ，加热时间8 m i n 1 0 】。2 0 0 1 年，侯革非、何仁研究了n i s i n 的抑菌效果。结果表明：不同菌株、菌量、p h 值变化对n i s i n 的抑菌活性影响不 同。n i s i n 的抑菌活性与p h 值成反比。随着p h 值的升高，n i s i n 的活性降低，同 时还反映了不同菌株对n i s i n 的敏感性也不一样。其中，腊状芽孢杆菌较低。对每 种菌株在一定的p h 条件下，n i s i n 的最低抑制浓度将随原液中菌量的增加而有所 提高【1 l 】。 张洪震等研究表明n i s i n 在猪肉冷却肉保鲜中具有一定的抑菌作用，并且该作 用随n i s i n 浓度的增加而增强。当n i s i n 的浓度为2 0 0 p p m 时，可使猪肉保质期延 长1 倍【1 2 】。李清秀等人研究了不同浓度的n i s i n 和纳他霉素对鸡肉的防腐保鲜效果， 研究人员对冷藏过程中对鸡肉的微生物感官品质和理化指标进行了检测。结果显 示，采用不同浓度的天然保鲜剂处理鸡肉，可起到不同程度的保鲜效果。其中以 质量浓度为0 0 4 9 k g 的n i s i n 和5 0 0 m g l 纳他霉素的保鲜效果更佳【1 3 】。 扬州大学硕士学位论文 1 3 溶菌酶 8 根据来源不同可以将溶菌酶分为：动物源溶菌酶、植物源溶菌酶以及微生物 源溶菌酶三类。根据其作用的微生物的不同又可分为两类，一类是细菌细胞壁溶 菌酶，一类是真菌细胞壁溶菌酶。前者又分为作用于糖苷链的细胞壁溶解酶和作 用于肽和酰胺部分的细胞壁溶菌酶。后者又分为酵母细胞壁溶菌酶和霉菌细胞壁 溶菌酶【1 4 】。 1 3 1 溶菌酶的结构以及理化性质 溶菌酶的化学名称是n - 一乙酰胞壁质聚糖水解酶，其分子由1 2 9 个氨基酸组 成，2 2 0 0 个原子，分子量1 4 3 8 8 1 8 0 0 0 。分子中碱性氨基酸、酰氨残基及芳香族 氨基酸较高，如色氨酸的比例较高。 溶菌酶是一种碱性球蛋白，等电点高达1 0 7 , - , 1 1 0 ，分子内有4 个二硫键交联， 化学性质非常稳定，对热也极为稳定，作用的最适温度为4 5 0 。c 。当p h 值在 1 2 1 1 3 范围内剧烈变化时，其结构几乎不变；在酸性环境中，溶菌酶对热的稳定 性很强，p h 4 7 ，1 0 0 。c 处理l m i n 仍能保持原酶活性；p h 3 时能耐1 0 0 。c 力n 热处理 4 5 m i n 。目前了解最清楚并投入商业化生产的是鸡蛋蛋清溶菌酶，其分子量为 1 4 0 0 0 ，等电点为1 1 。1 ，最适溶菌温度为5 0 。c ，最适p h 为7 ，鸡蛋蛋清溶菌酶化 学性质非常稳定，在p h 4 - - , 1 1 4 的范围内，1 0 0 处理l m i n 仍保持原酶活性，但在 碱性环境中该酶对热稳定性较差。在干燥条件下溶菌酶在室温下可以长期存放， 其纯品为白色或微黄、黄色的结晶体或无定形粉末，无臭、味甜，易溶于水，遇 碱易破坏，不溶于丙酮和乙醚等【1 引。 1 3 2 溶菌酶的作用机制 溶菌酶对革兰氏阳性菌、好气性孢子形成菌、枯草杆菌、耐辐射微球菌均有 良好的分解作用，对大肠杆菌、普通变球菌和副溶血性弧菌等革兰氏阴性菌也有 一定程度的溶解作用【1 6 】。 溶菌酶根据其作用的微生物不同可以分为2 大类：细菌细胞壁溶菌酶和真菌 张苗苗：n i s i n 、溶菌酶及蜂胶应用于盐水鹅保鲜效果的研究 细胞壁溶菌酶。其中，细菌细胞壁溶菌酶具有分解细菌细胞壁中肽聚糖的特殊作 用。细胞壁多糖是n 乙酰胺葡萄糖胺( n a g ) - n 乙酰胞壁质酸( n a m ) 的共聚 物，其中的n a g 及n a m 通过b 1 ，4 糖苷键而交替排列【1 7 1 。溶菌酶是一种葡萄糖 苷酶，其活性中心是天门冬氨酸和谷氨酸，能通过其肽键上的第3 5 位的谷氨酸和 第5 2 位的天门冬氨酸构成的活性部位水解破坏组成微生物细胞壁的n 乙酰葡萄 糖胺和n 乙酰胞壁质酸间的p 1 ，4 糖苷键，使得细胞因渗透压不平衡破裂，使革兰 氏阳性菌体细胞壁溶解而达到杀死细菌( 尤其是球菌) 的目的【1 8 】。另外，真菌细 胞壁溶菌酶是作用于肽链“尾”端和酰胺部分的细胞壁溶解酶。真菌细胞壁溶菌 酶包括酵母菌细胞壁溶菌酶和霉菌细胞壁溶菌酶【1 9 1 。 a b d o u 研究了鸡蛋中提取出来的溶菌酶抗菌肽对芽孢杆菌的抑制作用。溶菌 酶抗菌肽是一种天然食品防腐剂，浓度大于1 0 p , g m l 时，能很好的抑制芽孢杆菌孢 子，并且在9 5 下能保持3 0 m i n 的作用效果【2 0 1 。 1 3 3 溶菌酶在肉制品保鲜中的应用 舒留泉等研究了冷藏条件下用n i s i n 与溶菌酶复合生物保鲜剂对缢蛏的保鲜效 果，研究结果表明：n i s i n 和溶菌酶混合添加具有明显的保鲜效果，保鲜效果更佳， 该研究对于延长缢蛏的冷藏期具有一定的实际意义【2 l 】。 陈舜胜等以对虾、带鱼段、扇贝柱、和柔鱼条为试样，采用浸保鲜液，加保 鲜冰等保鲜方式，并运用正交试验研究了在不同保藏温度下溶菌酶复合保鲜剂的 作用效果，结果表明，以溶茵酶为主的复合保鲜剂作用显著，在其他条件不变的 情况下可以使得保质期延长一倍时间 2 2 】。 马美湖等研究了溶菌酶在冷却猪肉中的保鲜技术，试验结果表明：采用0 2 5 的n i s i n ，0 2 5 的溶菌酶以及0 2 的山梨酸钾，并用乳酸将保鲜液p h 值调到4 5 ， 保鲜效果良好f 2 3 】。 张德权等在n i s i n 、溶菌酶和乳酸钠复合保鲜冷却羊肉的配比优化研究一文中 表明，当采用复合保鲜剂的最佳配比为：n i s i n 0 3 4 ，溶菌酶0 2 4 ，乳酸钠2 2 7 时，三者之间能取得良好的交互效应，产生显著的保鲜效果1 2 4 j 。 为延长红肠货架期，杜琳等【1 8 】等在红肠混合料斩拌时；0 1 , k0 0 4 溶菌酶、 扬州大学硕士学位论文 0 0 5 n i s i n 、o 2 山梨酸钾和4 乳酸钠取得了满意的效果【2 5 】。 顾仁勇【2 6 】等采用0 0 5 溶菌酶和0 0 5 n i s i n 混合液用于保鲜猪肉，有效延长 了猪肉的保鲜期，4 c 条件下猪肉可保鲜1 2 d ，若采用真空包装保鲜期可达2 4 d 。 马美湖等【1 6 , 1 7 1 等研究了溶菌酶、n i s i n 、g n a 液对冷却肉的保鲜效果，研究表明， 溶菌酶单独使用时显著优于g n a ，略优于n i s i n ，且溶菌酶对抑制细菌总数的增殖、 减缓t v b n 值上升具有极其重要的作用【2 7 2 引。 n a t t r e s s 研究了溶菌酶和n i s i n 应用于猪肉保鲜中对其微生物以及感官指标的 影响，结果表明，以1 ：3 比例添加溶菌酶和n i s i n 可以有效抑制噬热双歧杆菌和 肠杆菌科细菌的生长，并且可以使得产品特有香味相对对照而言保持更长时间【2 9 】。 g i l l 将溶菌酶，n i s i n 和e d t a 应用于火腿和腊肠，研究了其对细菌的抑制作 用，结果表明：溶菌酶和n i s i n 比例为1 ：3 ，添加剂量为：5 0 0 m g k g ，e d t a 添加 剂量为：5 0 0 m g k g 时，能明显抑制b t h e r m o s p h a c t a ，l c m e s e n t e r o i d e s 等细菌在 火腿和腊肠上的生长1 3 0 1 。 m a n g a l a s s a r y 研究表明：将n i s i n 和溶菌酶以不同比例和浓度应用于冷藏条件 下真空包装的即食火鸡的保鲜，能显著抑制单核假单胞李斯特菌的生长和繁殖， 使得产品的货架期大大延长，至1 2 周左右【3 l 】。 1 3 4 溶菌酶作为食品保鲜剂的应用前景 应用天然防腐剂溶菌酶一方面卫生上有保证，另一方面具有一定的保健作用， 有抗感染和增强抗生素作用效力，促进血液凝固及止血，有组织再生作用。因此， 可以在保健食品中添加一定量以提高保健效果，以更好地符合消费者的需要，目 前，国内外在这方面的研究十分活跃，天然防腐剂是今后防腐剂发展的趋势。溶 菌酶作为一种天然蛋白质，能在胃肠内作用营养物质被消化和吸收，对人体无毒 性，也不会在体内残留，是一种安全性很高的食品保鲜剂、营养保健品和药品。 因此，在倡导绿色食品消费的今天，溶菌酶这一天然防腐剂必定有广阔的应用前 景，对食品工业的发展起到不可估量的作用。 1 4 蜂胶 张苗苗：n i s i n 、溶菌酶及蜂胶应用于盐水鹅保鲜效果的研究 1 4 1 蜂胶的理化性质 蜂胶是工蜂采集杨、柳、桦、栗和桉树等植物的幼芽或树皮等处采集的树脂， 并混入蜜蜂上颚腺分泌物和蜂蜡、花粉等加工而成的一种具有芳香气味的胶状混 合物m 1 。不溶于水，微溶于松节油，部分溶于乙醇。其成分中含有树脂及树香胶 ( 油、脂5 5 ) 、蜡( 3 0 ) 、香精油( 1 0 ) 花粉( 5 ) ，黄酮类化合物、拟v p 类、萜烯类化合物、1 0 羟基一乙一壬烯双酸等。它们具有抑制和杀死细菌、病毒 等作用，还有黄酮类化合物、酸、醇、酚、酯、醚类，以及烯萜、甾类化合物和 多种氨基酸、脂肪酸、酶类、维生素、阿魏酸、多种微量元素等生物活性物质。 因此，蜂胶作为一种生物保鲜剂在食品的防腐保鲜中得到了广泛的应用【3 3 1 。 1 4 2 蜂胶的作用机理 1 4 2 1 蜂胶的抗菌活性 蜂胶具有神奇的抑制和杀灭多种细菌、真菌、病毒和原虫的能力，有关研究 采用溶剂法和层析法对河南蜂胶提取、分离，得到3 个具有抗菌活性的结晶，经 鉴定结晶1 为芥子酸，结晶2 为异阿魏酸，结晶3 为咖啡酸。抑菌试验表明，蜂 胶的抑菌作用是多种成分协同的结果。 蜂胶对多种细菌和霉菌具有直接的抑制作用，而且能抑制它们对细胞的粘附。 m e t e s m 测试了蜂胶对7 5 种菌株的敏感性，其中6 9 株是葡萄球菌属和链球菌属，7 个菌株对蜂胶提取液都敏感。蜂胶对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度( m i c ) 和最 低杀菌浓度( m b c ) 分别是1 0 和1 2 0 m g k g t 3 4 1 。 英国的g r a n g 和d a v e y 添加5 蜂胶乙醇抽出标品( 含树脂成分6 0 m l m g ) 至 接种2 0 株病原菌的血液培养基中：金黄色葡萄球菌6 株( 含耐抗生素菌m r s a 3 株，g ) ，肠内链球菌2 株( g ) ，b a c i l l u s c e r e u s2 株( g + ) ，b r a n h a m e l l a c a t a r r h a l i s 1 株( g ) ，c o r y m e b a c t e r i u ms p 株，p s e u d o m o n u sa e r u g i n o s a3 株( g ) ，大肠菌2 株( g 。) ，k r e b s i e l l ap m e u m o n i a1 株( g 。) ，进行培养统计观察其是否增殖。结果 表明，蜂胶标品可抑制全部g + 。然而，对革兰氏阴性菌没多大的效果。并且，蜂 胶液对各微生物抑制强弱的顺序为：细菌：金黄色葡萄球菌 蜡状芽孢杆菌 枯草 扬州大学硕士学位论文 杆菌 大肠杆菌；真菌；毛霉 黑根霉 尖孢镰刀菌 黑曲霉 青霉；酵母：啤酒酵母 异常汉逊氏酵母 假丝酵母【3 5 】。 1 4 2 2 蜂胶的抗氧化活性 蜂胶作为一种高效、安全的天然抗氧化剂被称为“双重抗氧化剂”。因为它对 由f e 2 + 等金属离子诱导的脂质过氧化作用有明显的抑制作用，并呈现量效关系； 其次还能有效淬灭超氧阴离子和羟基自由基，也呈现量效关系【3 6 1 。 蜂胶抗氧化的主要组分是黄酮类和酚酸类。r a p t a 等发现蜂胶醇提液中黄酮类 和咖啡酸酯类具有较强的清除自由基和抗氧化能力，并且采用测定氧化还原电势 的方法分析出抗氧化、清除阴离子自由基能力最强的是高良姜素和白杨素阳。 h a y a s h ik a t s u h i r o 3 8 1 等人分离了蜂胶中的抗氧化成分，发现蜂胶抗亚油酸氧化的能 力很强，抗氧化成分以a r t e p i l l i n c 的含量最高，并称其为最有潜力的天然抗氧化剂。 m o r e n o 等人对阿根廷各地产的蜂胶抗氧化能力进行了比较，验证了蜂胶可以作为 天然抗氧化剂，阻断畜产和水产品的氧化变质【3 9 】。 1 4 2 3 蜂胶的成膜作用及对自由基的清除作用 蜂胶液是良好的成膜剂，形成的薄膜( 仅几r t m ) 。不但可以减少病源生物的 侵染，而且可阻碍果蔬内部与外界气体交换，抑制果蔬呼吸、降低新陈代谢、减 少果蔬表面水分蒸发，因而可以减少营养物质的消耗能和品质的下降，起到了防 腐保鲜的作用【4 0 1 。活性氧自由基是一些处于激发态的含氧基团，如超氧阴离子自 由基、羟基自由基、烷氧自由基等，它们具有高度的反应活性，产生毒效。蜂胶 可清除这些自由基，起到抗氧化的作用【4 1 1 。 1 4 3 蜂胶在肉制品防腐保鲜中的应用 汤凤霞【4 2 1 等对蜂胶保鲜猪肉之效果进行了初步研究，8 蜂胶液保鲜的猪肉在 3 6 h 后仍能保持新鲜，肌肉呈红色，脂肪洁白，硫化氢、挥发性基氮、过氧化酶等 指标均符合国家一级鲜肉标准。4 的蜂胶液能使猪肉2 4 h 内保持一级新度，而对 照组只能保持1 2 h 的新鲜度。用蜂胶保鲜的猪肉保持口感和风味不变。另外，乞 张苗苗：n i s i n 、溶菌酶及蜂胶应用于盐水鹅保鲜效果的研究 永艳用0 0 2 4 的蜂胶乙醇提取液处理猪肉可起到较好的防腐作用，比对照推迟近 1 5 d 腐败，同时浓度下不会影响猪肉的口感和色泽【4 3 1 。 陈崇羔等研究蜂胶柠檬酸液对蜂王幼虫的保鲜效果，发现0 1 的蜂胶醇提液 和0 5 的柠檬酸液综合保鲜效果最理想，蜂王幼虫于常温下浸没保存于其中7 d ， 虫体t v b - n 仍小于1 5 0 m g k g ，相当于肉类和鱼类的一级新鲜度，浸没保存于其中 1 4 d ，虫体t v b n 值未超过2 5 0 m g k g ，相当于肉类和鱼类的二级新鲜度 4 4 1 。 h a r t 等人研究蜂胶醇提液和水提液对猪肉蛋白质和脂肪的影响，发现蜂胶水提 液和醇提液均能有效阻止脂肪氧化和蛋白质酶解，水提液的防腐保鲜效果比醇提 液好，并指出蜂胶水提液对肉制品具良好的防腐作用【4 5 1 。y a n g 等研究了蜂胶对干 鱿鱼的作用，发现蜂胶液不仅能抑制干鱿鱼上的微生物繁殖，而且能使干鱿鱼保 持原有水分、品质和风味不变1 4 6 。 1 4 4 蜂胶应用于生物保鲜的前景 蜂胶除具有高效、广谱、安全的抑菌效果外，还具有多种生物活性和功能保 健作用，因此，蜂胶在食品的防腐保鲜中具有广阔的应用前景。但是，目前多数 研究集中于单一蜂胶提取物的研究，对于与其它抗氧化剂的混合使用的研究较少， 因此，这一点将是蜂胶研究的一个新方向，使蜂胶的功能更加充分地发挥出来。 1 5 本研究的目的和意义 食品的防腐保鲜是食品工业所面临的最大难题之一，食品在贮藏期间会受到细 菌、霉菌、酵母菌等微生物的作用而腐败变质。变质食品不仅失去应有的营养价 值，而且发生感官变化，甚至产生有毒物质。长期以来，为保藏食品人们采取了 一系列物理和化学方法，如低温、加热、降低水分活性、真空包装、添加防腐剂 等。但是，传统的并已经广泛使用的化学防腐剂都具有二定的毒性；而辐射贮藏、 低温贮藏等物理方法又因使用范围、操作技术等限制，很难广泛推广。因此，寻 找安全、无毒的生物保鲜技术成为人们研究的热点。 盐水鹅传统工艺中盐水鹅熟化与杀菌温度保持在8 5 9 0 ，是其保持最佳嫩度 的关键因素。但是该温度下一些耐热微生物及其芽孢难以杀死。盐水鹅在配送、 扬州大学硕士学位论文 流通和消费过程中发生的变化主要有蛋白质的分解和氧化。脂肪的氧化可以通过 添加抗氧化剂和真空包装有效地防止；而蛋白质的分解主要由于微生物的繁殖产 生的酶，催化产生小分子物质氨、胺类、硫化氢、甲基吲哚、硫醇等有毒物质， 同时感官质量也随之恶化，因而如何控制盐水鹅中微生物的生长繁殖，防止产品 腐败，提高产品的保质期一直是国内盐水鹅保鲜研究的重点。由于鹅肉的水分含 量高，加工中若采用高温熟化和杀菌，虽然能在一定程度上延长产品的货架期， 满足销售和运输的需要，但是会导致蛋白质降解过度，使鹅肉质地变松软，但是 却导致产品的外观以及风味变差。 本研究首先针对盐水鹅中导致腐败变质的主要细菌进行分离鉴定，将使得盐 水鹅保鲜剂的筛选以及保鲜研究有的放矢；然后研究所选生物保鲜剂对分离到细 菌的抑制效果，根据前人研究结果，n i s i n 、溶菌酶等单一应用保鲜效果不是很理 想，因此，最后通过正交试验研究n i s i n 、溶菌酶、蜂胶对盐水鹅复合生物保鲜的 效果。该研究避免使用传统化学保鲜手段带来的环境污染问题，同时有助于提升 盐水鹅的风味，并使得产品有一定程度的保健作用，将为其它肉制品的防腐保鲜 研究提供借鉴和参考。 蝥苣堕l 塑堕璺! 登题堕及蜂胶应用于盐水鹅堡鲜效果的研究 一 监 2 1 试验材料 2 1 1 试验对象 材料与方法 盐水鹅。 由扬州白天鹅食品有限公司( 1 ) 、扬州天歌食品有限公司( 2 ) 、扬州佳珏食 品有限公司( 3 ) 、星月食品( 4 ) 。 所取盐水鹅样品均是以冻鹅为原材料，按照盐水鹅加工操作规程2 0 0 6 加 工所得。 2 1 2 试剂以及来源 蜂胶：扬州大学实验蜂场惠赠。 溶菌酶：2 x 1 0 7 i u g ，购自s i v a 公司。 n i s i n ：lx 1 0 6 i u g 浙江银象生物工程公司。 硼酸吸收液( 2 0 9 l ) 、盐酸( o 0 1 m o l l ) 标准滴定溶液、三氯乙酸、硫代巴比 妥酸( t b a ) 、氛仿等均为分析纯。 无菌生理盐水、无菌蒸馏水。 2 1 3 试验仪器以及设备 主要的试验仪器以及设备见表2 1 。 表2 - 1 试验主要仪器以及设备 ! 些! 宝；：! 壁巴垒i 旦曼9 坚i p 巴宝呈! 12 11 塾! ! 宝：! 仪器名称型号生产厂家 扬州大学硕士学位论文 另有：半微量定氮器、微量滴定管、培养皿、移液器、显微镜等。 2 2 试验方法 2 2 1 细菌分离与鉴定 2 2 1 1 采样 对1 、2 、3 、4 厂生产的盐水鹅( 未经任何保鲜防腐处理) 进行即时随机采样。 采样后盐水鹅在常温下和1 5 下贮藏。 2 2 1 2 细菌总数的测定 对于常温保存的盐水鹅样品，分别在贮藏的0 d 、3 d 、6 d 、9 d 进行细菌总 数的测定。细菌总数测定每天随机测3 只，每只作3 次重复，直至产品腐败变质。 方法：用采样板( 铝制，中间打一5 c m 2 孔) 压在检样上，将灭菌棉拭稍沾湿， 在板孔范围内揩抹1 0 次。一个检样作5 支棉拭，共涂抹检样面积5 0 e r a 2 ，本试验 检样部位分别是：头部、颈部、胸腔、翅根部、腿部。 每支棉拭揩抹后立即剪断，均投入盛有5 0 m l 的灭菌生理盐水的三角瓶浸泡。 检验时先充分摇匀，吸取瓶中的液体作为原液，再按要求作1 0 倍递增稀释。计算 l c m 2 含菌量。 2 2 1 3 盐水鹅细菌菌相分析 对已经发生腐败变质的盐水鹅产品进行细菌培养，分类统计不同形态菌落的 绝对数和相对数，获得纯培养后，通过革兰氏染色、氧化酶、过氧化氢酶等试验， 用微量生化反应，鉴定出全部菌株的属。 张苗苗：n i s i n 、溶菌酶及蜂胶应用于盐水鹅保鲜效果的研究 1 7 2 2 2 蜂胶、n i s i n 、溶菌酶单因素抑菌试验 2 2 2 1 蜂胶成分的测定 将本试验所用蜂胶送至中国蜂产品研究中心( 北京) ，采用高效液相色谱法 ( h p l c ) 测验基于8 类黄酮成分的分析，通过计算不同峰面积获得8 种黄酮成分 含量，并计算总黄酮含量。 2 2 2 2 抑菌液的配制： 蜂胶保鲜液的配n - 蜂胶经冷冻、粉碎、乙醇浸提，过滤得3 0 蜂胶乙醇浸 提液，再用灭菌蒸馏水制成不同浓度蜂胶乳浊液。 n i s i n 保鲜液的配制：称取一定重量的n i s i n 溶解于灭菌蒸馏水，配制成不同 的保鲜液。 溶菌酶保鲜液的配制：将溶菌酶用灭菌蒸馏水溶解成不同浓度。 复合保鲜液的配制：先将蜂胶按上述方法配制成一定浓度的乳浊液，然后再 利用灭菌蒸馏水将蜂胶乳浊液稀释成不同浓度，最后根据正交试验设计加入一定 量的n i s i n 和溶菌酶保鲜液配制成不同浓度组合的复合保鲜液。 2 2 2 3 测定指标 抑菌率：将0 d 样品分别在各种保鲜液浸泡6 0 s 取出沥干，常规封口包装后贮 存于0 4 。c 冰箱中，进行菌落总数测定以及感官评分，来评定单因素对盐水鹅的抑 菌防腐效果。用抑菌率表示防腐保鲜剂的抑菌效果。抑菌率计算公式如下： 抑菌率( ) = ( 对照样品菌落总数保鲜样品菌落总数) 对照样品菌落总数 感官评分：感官评分由5 名食品专业成员组成评审小组，对试验各组盐水鹅 产品进行盲评，评定指标主要包括外观及色泽、气味及滋味、组织状态。采用满 分1 0 0 分制，当评分低于6 0 分时，视为产品已经腐败变质。 2 2 3 蜂胶、溶菌酶、n i s i n 复合保鲜试验 2 2 3 1 正交试验 将a 蜂胶、b - n i s i n 以及c 溶菌酶分别设置三个浓度水平进行b 3 3 试验。浓 度设置依据：n i s i n 5 0 0 i u g 可以杀死绝大多数阳性菌【4 7 】；溶菌酶最小作用浓度为 扬州大学硕士学位论文 2 0 0 i u g t 4 引。另根据蜂胶最小抑菌浓度分别为鼠伤寒沙门氏菌o 8 ，志贺氏菌o 。8 ， 魏氏梭菌0 8 ，肉毒梭菌0 4 ，蜡样芽抱杆菌o 1 ，小肠结肠炎尔森氏菌o 4 ， 金黄色葡萄球菌0 4 1 4 9 , 5 0 , 5 1 】。设定试验所用蜂胶浓度为：o 2 、o 4 、0 8 ；n i s i n 浓度设置为5 0 0 i u g 、1 0 0 0 i u g 、1 5 0 0 i u g ：溶菌酶浓度为2 0 0 i u g 、5 0 0 i u g 、8 0 0 i u g 。 正交试验按照下表进行，试验共分9 组。 。 表3 5 正交试验方案 ! 垫! 翌：i ! 塾星! 曼垒宝翌12 12 丛篮2 呈型丝兰! 试验因素 试验号 ab c 将以冻鹅为原材料，按照盐水鹅加工操作规程2 0 0 7 ) ) 加工所得盐水鹅样品 分别在各组保鲜液浸泡6 0 s 取出沥干后用包装袋封口，1 5 c 下贮藏，o d 、5 d 、1 0 d 、 1 5 d 、2 0 d 进行指标测定。 2 2 3 2 测定指标 按g b 4 7 8 9 1 7 - 9 4 肉与肉制品检测取样，遇有感官性状异常，停止检验。 细菌总数：按照g b t 4 7 8 9 2 2 0 0 3 食品卫生微生物学检验一菌落总数测定 规定方法测定。测定方法同2 2 1 2 。 t