（劳动卫生与环境卫生学专业论文）dna修饰及其检测方法研究.pdf

兰塑苎查兰旦查垦兰堕 一三生兰堂堕墨 中英文缩略词表 序号英文缩写 英文全称 中文名称 1d s b d o u b l es t r a n db r e a k双链断裂 2s s b 35 一m c 4 c p g 5 c p g s 6t m 7r a s s f l a 8e c a d h e r i n 9p c r 1 0b s p 1 1b i p s 1 2m s p 1 3c o b r a 1 4d hp l c s i n g l es t r a n db r e a k 单链断裂 5 - m e t h y l a t i o nc y t o s i n e 5 - 甲基胞嘧啶 t h ec y t o s i n ea n dg u a n i n ed i n u c l e o t i d ec g 二核苷酸 c p gi s l a n d s t u m o t l rm a r k e r s r a sa s s o c i a t i o nd o m a i nf a m i l yg e n ela e p i t h e l i a lc a d h e r i ng e n e p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n b i s u l f i t es e q u e n c i n g b i s u l f l t e - p c r - s s c p m e t h y l a t i o ns p e c i a lp c r c o m b i n e db i s u l f i t er e s t r i c t i o na n a l y s i s c p g 岛 肿瘤标志物 r a s 相关结构域家族基因1 a 上皮钙粘附蛋白基因 聚合酶链反应 亚硫酸氢钠测序法 亚硫酸盐- p c r - s s c p 甲基化特异性聚合酶链反应 限制性内切酶分析法 d e n a t u r e h i g h p e r f o r m a n c el i q u i d 变性高效液相色谱 c h r o m a t o g r a p h y 15m s - s n u p e m e t h y l a t i o n s e n s i t i v e s i n g l en u c l e o t i d e 1 6n a h s o ， 1 7t s g s 1 8s n p s 1 9l m p c r 2 0s a g e 2 lc l a p 2 2d m s p r i m e re x t e n s i o n b i s u l f i t es o d i u m t u m o u rs u p p r e s s o rg e n e s i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m s l i g a t i o n - m e d i a t e dp c r s e r i a la n a l y s i so f g e n ee x p r e s s i o n a l k a l i n ep h o s p h a t a s ec a l fi n t e s t i n e d i m e t h y l s u l f a t e 甲基化敏感的单核营酸引物 延伸 亚硫酸氢钠 抑癌基因 单核苷酸多态性 连接介导聚合酶链式反应 基因系列表达分析 碱性磷酸酶 硫酸二甲酯 华中科技大学同济医学院 硕士学位论文 d n a 修饰及其检测方法研究 硕士研究生：张莉君 指导老师：徐顺清教授 中文摘要 d n a 是生命的物质基础，编码着自然界千变万化的遗传现象，贮存着生物界 无穷无尽的遗传信息。众所周知，d n a 分子由a 、t 、c 、g 四种核苷酸经3 ，5 磷酸二酯键相连构成d n a 的基本骨架。但在基本骨架之外，d n a 还存在修饰， 构成对d n a 结构的重要补充，其中同样蕴涵神秘的遗传学信息。 d n a 修饰( d n am o d i f i c a t i o n ) 是指与d n a 共价结合的修饰基团，其结果 是使具有相同序列的等位基因处于不同的修饰状态，其分子基础是d n a 甲基化以 及染色质的化学修饰和物理重塑。d n a 修饰与蛋白修饰、非编码r n a 调控共同 构成了表观遗传中基因表达调控的3 个层面，共同在遗传因素和环境因素的互动 关系中起着桥梁的作用。d n a 修饰按来源主要分为两大类：d n a 自发性化学修 饰和外来因素引发的修饰。 “d n a 甲基化限制修饰系统”是最常见的d n a 自发性化学修饰，也是d n a 修饰研究领域的第一项重大发现。d n a 甲基化可能存在于所有生物中，在真核生 物基因组中主要发生在c p g 和c p x p g 的胞嘧啶碱基5 位碳环上，简称5 - m c ， 原核生物基因组中c c a t g g 和g a t c 则常被甲基化。d n a 甲基化是表观遗传学 中研究最为深入的一种形式，具有多方面的生物学意义，与胚胎正常发育、基因 表达调控、雌性个体x 染色体失活、寄生d n a 序列的抑制、印迹基因及基因组 的结构稳定等关系密切。特别是近几年研究发现，该机制的异化可导致基因表达 的异常及基因组稳定性的降低，继而促进肿瘤发生和发展。 2 华中科技犬学同济医学院 硕士学位论文 除了d n a 自发性化学修饰，外环境中的理化因素也能作用于细胞内d n a ， 对d n a 的结构和稳定性产生影响，导致碱基修饰和加合物形成，这就是另一类 d n a 修饰。若这些d n a 分子上的修饰逃脱了生物体内的修复或被不正确的修复， 则将导致遗传信息的改变而诱发变异。所以，d n a 加合物的形成可能是产生d n a 突变的第一阶段，继而发生d n a 链断裂、碱基置换和碱基缺失等一系列事件。 很多研究已经证明，环境中多种诱变剂或其活性产物能与d n a 结合形成加合 物，引发d n a 损伤或基因结构的异常，由此造成的重要相关基因表达或功能上的 改变是细胞恶性转化的主要前提。 随着现代分子生物学技术和理论的发展，人们正在不断的发展并完善灵敏的 技术来检测化学物与d n a 的作用，以使d n a 甲基化、d n a 加合物及d n a 双链 断裂( d o u b l es t r a n db r e a k ，d s b ) 等d n a 分子异常修饰与疾病发生和遗传变异 的关系更明朗的展现在人类面前。 本研究的目的是建立d n a 甲基化和d n a 加合物这两种d n a 修饰的检测 方法。在第一部分中，我们用亚硫酸氢钠测序法成功鉴定了人肿瘤细胞株h e p g 2 和m c f 一7 的r a s s f la 和e c a d h e r i n 基因启动子甲基化状态，同时，针对亚硫 酸氢钠处理后的d n a 进行p c r 扩增出现大量非特异性扩增产物，扩增效率很低 等缺点，对原有方法中的p c r 扩增方法加以改进，使之更有利于d n a 甲基化的 检测，也为p c r 扩增c g 含量较高的启动子区域提供了参考方法。另外，已知的 加合物检测方法仅能检测特定基因片段中的d n a 加合物，对全基因组结合物尚无 法达到检测的目的，鉴于此，我们建立了一种检测基因组中d n a 加合物的新方法， 实验证实该方法合理可行，有望成为一种高通量且快速有效地检测基因组d n a 加 合物位点的新技术。 第一部分改进的亚硫酸氢钠测序法在启动子c p g 岛甲基化检测中的应用 目的：用亚硫酸氢钠测序法检测启动子c p o 岛甲基化状态，改进其p c r 扩 增过程，并检验改进后方法在甲基化检测中的可行性。方法：人肿瘤细胞株h e p 0 2 和m c f - 7 基因组d n a 经亚硫酸氢钠化学修饰后；针对r a s s f l a 和e c a d h e r i n 华中科技大学同济医学院 硕士学位论文 基因启动子d n a 序列分别设计特异性引物，用常规、降落、及改进p c r 分别扩 增，比较扩增效果，p c r 产物纯化回收后，t - a 克隆入载体p g e m t ，转化大肠 杆菌f ec o l id h 5c 1 ) ，经p c r 扩增鉴定后获得阳性克隆，测序比对。结果：h e p g 2 细胞中r a s s f i a 基因启动子扩增产物直接测序结果显示，所测3 6 5 个碱基对应 的原始序列中含胞嘧啶( c ) 1 1 3 个，其中1 5 个c g 位点均未转变，m c p g c i z i g 为1 0 0 ，序列起始部位还有4 个c 未转变，其余9 4 个c 全部转变为t ，转化率 为9 5 9 2 ，实验结果再次证明h e p g 2 细胞r a s s f l a 基因启动子是高甲基化的， 同时证明亚硫酸氢钠化学修饰完全、结果可信。m c f 一7 细胞扩增产物克隆测序显 示，r a s s f l a 基因启动子1 7 个c g 中有1 6 个c o 未转变为t g ，m c p g c p g 为 9 4 2 ，其余还有3 个c t g 和1 个c a g 未转变；e 。c a d h e r i n 基因启动子共有3 7 个c g ，其中有3 2 个转变为t g ，其余5 个保持c g 不变，m c p g c p g 为1 3 5 ， 其余碱基中还有3 个c t g 和3 个c a g 未转变为t t g 和t a g 。比较三种p c r 扩 增效果，发现用改进后的p c r 可可扩增出理想目的条带，用降落p c r 和常规p c r 方法，也有目的条带出现，但亮度明显减弱，且引物二聚体和非特异性扩增产物 明显。结论：h e p g 2 细胞基因组d n a 中r a s s f l 一a 启动子是高甲基化的； m c f 一7 细胞基因组d n a 中，r a s s f l a 基因启动子c p g 岛是高甲基化的，而 e c a d h e r i n 基因启动子c p g 岛未呈现高甲基化状态；改进后的p c r 与常规、降 落p c r 相比，提高了扩增效率，抑制了非特异性扩增，增强了以p c r 为基础的 甲基化分析的可行性，更为扩增c o 含量较高的启动子区域提供了参考。 第二部分用l m p c r 检测基因组d n a 加合物的方法学研究 目的：基于l m p c r 技术，建立一种检测基因组加合物的新方法。方法：盐 酸氮芥处理人肝瘤h e p g 2 细胞形成的加合物，制备基因组d n a 片段、l m p c r 检测。具体策略如下：首先，提取基因组d n a 经x b a i 内切酶切割，得到的d n a 片段与人工合成的连接子l i n k e r 3 连接，p c r 检测连接效果。其次，上述连接产 物经碱性磷酸酶( c i a p ) 去磷酸化处理消除已有磷酸末端，处理产物经哌啶剪 切及变性后，在加合物位点处断裂形成带有5 磷酸基末端的d n a 单链。再用单 个引物p r i m e r 3 在t a q 酶的作用下将d n a 单链延伸成带有a 尾的粘端双链结构。 再次，粘端双链经t 4d n a 连接酶与5 端为t 、带有磷酸基团的连接子l i n k e r l 华中科技大学同济医学院 硕士学位论文 连接，亲和素包裹的磁珠捕获连接产物。以该连接产物为模板，生物素标记p r i m e r l 和p r i m e r 3 为引物扩增。最厉，p c r 产物绛磁珠纯化、m i n ei 内切酶切割后与人 工合成的连接子l i n k e r 2 连接，以该连接产物为模板，p r i m e r l 、p r i m e r 2 为引物 扩增包含有加合物相邻基因的d n a 片段。结果：盐酸氮芥给药浓度与h e p g 2 细胞存活率呈负相关( r 2 = o 9 5 7 ，p 0 0 1 ) ，依照标准曲线，确定h e p g 2 存活率 为9 0 的盐酸氮芥处理浓度为o 4 5 m m o l l ；终浓度为o 4 5 m m o l l 的盐酸氮芥 处理h e p g 2 ，基因组d n a 完整性好，无断裂可见断裂，可用与下一步的检测； 用x b a i 酶切后的d n a 与连接子l i n k e r 3 的连接产物经p c r 扩增，产物电泳显示 应为长短不一的d n a 条带，长度主要集中在2 0 0 b p 1 0 0 0 b p ，与预期结果一致， 制备基因组d n a 片断成功。l m p c r 扩增产物长度为7 0 b p ，得到基因组中d n a 加 合物位点相邻序列，l m p c r 检测基因组d n a 加合物成功。结论：新的加合物检测 方法能够对全基因组中加合物做到定性检测：并且具有创新性、通用型、简便性 和安全性，有望成为一种高通量且快速、有效检测基因组d n a 加合物位点的新技 术。 关键词：d n a 修饰；d n a 甲基化；聚合酶链反应；上皮钙粘附蛋白基因； r a s 相关结构域家族基因l a ；基因组d n a ；d n a 加合物：连接介导聚合酶链 式反应 华中科技大学同济医学院硕士学位论文 d e v e l o p m e n to fm e t h o dt od e t e c td n a m o d i f i c a t i o n m a t e rc a n d i d a t e ：z h a n gl o u n s u p e r v i s o r ：p r o f x us h u n q i n g a b s t r a c t i t1 sw e l lk n o w nt h a td n ai st h eh e r e d i t a r ym o l e c u l ea n dt r a n s m i t si n f o r m a t i o n f r o mg e n e r a t i o nt og e n e r a t i o n ，w h i c he n c o d e st h ei n f o r m a t i o nt om e e tc e l l sr e q u i r e m e n t f o rs u r v i v i n g ，s p e c i a l i z i n ga n dr e p l i c a t i o n t h ek e yt od n af u n c t i o na sa ni n f o r m a t i o n m o l e c u l el i e si nt h es e q u e n c eo fa d e n i n e s ，t h y m i n e s ，c y t o d i n e sa n dg u a n i n e s ( a ，t ，c a n dgf o rs h o r t ) ，t h er u n g so ft h ed n ad o u b l eh e l i xc o n s i s to fh y d r o g e n b o n g d e d c o m p l e m e n t a r yb a s e dp a i r s ( aw i t ht ，a n dcw i t hg ) t h er a i l sa r ec h a i n so f a l t e r n a t i n gs u g a r sa n dp h o s p h a t e st h a tr u na n t i p a r a l l e lt oe a c ho t h e r a l lo f t h e s ea r et h e c o m p o n e n t so fd n ab a c k b o n e s i na d d i t i o n ，d n ab a c k b o n e sc a nb em o d i f i e di na n u m b e ro fw a y s ，f o ri n s t a n c e ，b yr e p l a c i n gt h ep h o s p h o d i e s t e rg r o u p sw i t hp e p t i d e g r o u p s ，o r w i t h m e t h y e n em e t h y l i m i n o g r o u p s a n ds o o n t h e r e f o r e ，d n a m o d i f i c a t i o ni st h ei m p o r t a n tc o m p o n e n to fd n as t r u c t u r ea n de n c o d e st h en u m e r o u s a n dm y s t e r i o u sg e n e t i ci n f o r m a t i o n ，a l s o d n am o d i f i c a t i o ni st h ec o v a l e n tc o m p o u n do fd n aa n do t h e rg r o u p s ，w h i c h m a k et h ea l t e r n a t i o no fp h e n o t y p e so c c u rw i t h o u ta n yc h a n g eo ft h ea l l e l o m o r p hg e n e s e q u e n c e t h i sm e c h a n i s mu n d e r l i n i n gi se p i g e n e t i c st h a ti n c l u d ed n am e t h y l a t i o n ， p r o t e i nm o d i f i c a t i o na n dn o n e n c o d i n gr n a i na n o t h e rw o r d ，d n am o d i f i c a t i o ni s t h em a i nc o m p o n e n to f e p i g e n e t i c s d n am o d i f i c a t i o ni sd i v i d e di n t ot w om a j o rt y p e ， d n a s p o n t a n e o u sc h e m i c a lm o d i f i c a t i o na n dm o d i f i c a t i o nf r o me x o g e n o u sf a c t o r s e n z y m a t i cm e t h y l a t i o n i sm o s t i m p o r t a n t d n as p o n t a n e o u sc h e m i c a l m o d i f i c a t i o n ，a n di sa l s ot h em o s ti n t e n s i v ee p i g e n e t i c s ，w h i c hp l a y st h ei m p o r t a n t r o l e si nb o t h p r o k a r y o t e sa n de u k a r y o t e s t h es i m p l i f i e du n d e r s t a n d i n go fd n a 6 华中科技大学同济医学院 硕士学位论文 m e t h y l a t i o nf u n c t i o ni st h a tt h eh y p e r m e t h l a t i o nw o u l dd o w n - r e g u l a t eg e n e se x p r e s s i o n t h e r e f o r e d n am e t h y l a t i o nw i t h i nt h ee u k a r y o t es p e c i e sp l a y sa ni m p o r t a n tr o l ei n m o d u l a t i n gg e n e se x p r e s s i o n ，e t i o s i so ft u m o r ，g e n e si m p r i n t i n g ，xc h r o m o s o m e i n a c t i v a t i o na n dt h em a i n t e n a n c eo fc h r o m o s o m es t r u c t u r e m a n ys t u d i e sh a v es h o w n t h a tt h ed n aa l t e r a t i o nm e t h y l a t i o ni np r o m o t e ro c c u r sv e r ye a r l ya n d 矗e q u e n t l yw h e n t h em a l i g n a n tt u m o ro c c u r s s ot h em e t h y l a t i o no ft u m o rr e l a t e dg e n ei se x p e c t e dt ob e a ne a r l y ，s u s c e p t i v ea n dp r o m i s i n gi n d e xo f t u m o rb i o m a r k e r i na d d i t i o no fm e t h y l a t i o n ，a n o t h e ri m p o r t a n tt y p eo fd n am o d i f i c a t i o ni sd n a a d d u c t s ，w h i c hc a r lb e c o m ep e r m a n e n tv i at h ef o r m a t i o no fm u t a t i o n so ro t h e rt y p e so f g e n o m i ci n s t a b i l i t y e n v i r o n m e n t a le x o g e n o u sf a c t o r si n c l u d i n ga l k y l a t i n gc a r c i n o g e n s ， u l t r a v i o l e t ( u v ) 一l i g h ta n di o n i z i n gr a d i a t i o n ( i r ) a sw e l l a sal a r g ea m o u n to f a n t i c a n c e rd r u g sc a ni n d u c ed n aa d d u c t s i fn o tr e p a i r e dp r i o rt or e p l i c a t i o n ，d n a a d d u c t si sg e n e r a l l yh a r m f u lr e s u l t i n gi ne f f e c t sd e t e c t a b l eo nt h el e v e lo fc h r o m o s o m a l a b e r r a t i o n s ，r e c o m b i n a t i o n a sw e l la sg e n em u t a t i o n sa n dm a l i g n a n tt r a n s f o r m a t i o n m a n yd i f f e r e n td n a b a s ec h a n g e sh a v eb e e ns e e nf o l l o w i n gs o m ef o r m so fo x i d a t i v e s t r e s s ，a n dt h e s el e s i o n sa r ew i d e l yc o n s i d e r e da si n s t i g a t o r sf o rt h ed e v e l o p m e n to f c a n c e ra n da r ea l s oi m p l i c a t e di nt h ep r o c e s so fa g i n g o n eo f t h em o s ta b u n d a n tf o r m s o fc e l l u l a rs t r e s si st h ec o n s t a n te x p o s u r et or e a c t i v es p e c i e so fo x y g e no rr a d i c a l st h a t c a u s ep r o t e i na n dd n a d a m a g e w i t ht h ec o n t i n u o u s l yd e v e l o p m e n to fm o l e c u l a rb i o l o g yt e c h n i q u e si nr e c e n t y e a r s ，s m a l lm o l e c u l a rb i o m a r k e ri nv i v or e l a t e dw i t ht u m o ro c c u r r e n c e ，d e v e l o p m e n t a n dt r e a t m e n th a v eb e c o m et h eh o t s p o to ft u m o rm a r k e r ，e s p e c i a l l yt h ee n v i r o n m e n t a l p r o b l e m m o r ep e r f e c ta n di n t e l l i g e n tt e c h n i q u e sa r er e q u i r e dt oe x a m i n et h ec h e m i c a l c a r c i n o g e ne x i g e n t l ys oa st oc l a r i f yt h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nd n am o d i f i c a t i o na n d h u m a nd i s e a s e s ，h e r e d i t ya n da b e r r a n c e w eu s e da n dd e v e l o p e db i s u l f i t es e q u e n c i n gt od e t e c tt h em e t h y l a t i o no f p r o m o t e r o fr a s s f l aa n de c a d h e r i ni nt u m o rc e l l s ，a n dt h ed e v e l o p e dm e t h o dl i k e l yc a nb e 华中科技大学同济医学院 硕士学位论文 a p p l i e dt od e t e c td n am e t h y l a t i o na n dt oa m p l i f yo t h e rg c - r i c hg e n o m i cs e q u e n c e s o t h e r w i s e ，u s i n gp a r a l l e lg e n o t y p i n ga s s a yo fs n p sa n dl m p c rf o rr e f e r e n c e ，w e e s t a b l i s h e dan e wm e t h o dt od e t e c td n aa d d u c t si ng e n o m i cd n a s t h er e s u l t s s h o w e dt h a tt h ep r o t o c o lo ft h i sn e wm e t h o di sv e r yr e a s o n a b l ea n di ti se x p e c t e dt ob e ah i g ht h r o u g h p u tm e t h o dt od e t e c tt h ed n aa d d u c t so ro t h e rg e n em u t a t i o ni n g e n o m i cd n a s p a r t1 a p p l i c a t i o na n di m p r o v e m e n to fb i s u l f i t es e q u e n c i n gi na n a l y s i so f m e t h y l a t i o no fc p g i s l a n di ng e n ep r o m o t e r o b j e c t i v et oa p p l ya n di m p r o v eb i s u l f i t es e q u e n c i n gt oa n a l y s i sm e t h y l a t i o no f c p gi s l a n d i n g e n ep r o m o t e ra n dt o d i s c u s st h e s e n s i t i v i t ya n ds p e c i f i c i t yo ft h e i m p r o v e dp o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o na m p l i f i c a t i o ni nm e t h y l a t i o na n a l y s i s m e t h o d s t h eg e n o m i cd n a sw e r ee x t r a c t e df r o mm c f 一7a n dh e p g 2c e l l sa n dt r e a t e db y b i s u l f i t es o d i u m ，t h em e t h ) r l a t i o ns t a t u sa tr a s s f l aa n de - c a d h e r i na m p l i f i e dw i t h r e g u l a r , t o u c h d o w n a n di m p r o v e dp o l y m e r i s ec h a i nr e a c t i o nr e s p e c t i v e l yw e r e d e t e c t e db yu s i n gb u s i l f i t es e q u e n c i n g ，t h e nt h ea m p l i f i e dd n aw e r es u b c l o n e di n t ot h e t ac l o n i n gv e c t o ra n ds e q u e n c i n g r e s u l t sf o rh e p g 2 ，r a s s f l a s e q u e n c i n gs h o w e d t h a tt h e r ew e r e3 6 5b a s e st ob es e q u e n c e d ，i nw h i c h15c gh a v e n tc h a n g e d ，t h e p e r c e n to fm c p g c p gi s 10 0 a n dt h ee f f i c i e n c yo fb i s u l f i t es o d i u mt r e a t m e n ti s 9 5 9 2 t h e r e f o r e t h ec p gi s l a n d so fr a s s f l ap r o m o t e ri n h e p g 2a r e h y p e r m e t h y l a t e d f o rm c f 一7 ，r a s s f l ac l o n i n gs e q u e n c i n gs h o wt h a tt h e r ew e r e1 7 c gb u to n l yo n eh a sc o n v e n e dt ot g , a n dt h ep e r c e n to fm c p g c p gi s9 4 2 i n a d d i t i o n ，t h r e ec t ga n do n ec a gh a v e n tc h a n g e d m e a n w h i l e ，w eg o tt h ed i f f e r e n t m e t h y l a t i o nf e a t u r eo fe c a d h e r i ni nm c f 一7 t ac l o n i n gs e q u e n c i n gs h o w e dt h a tt h e r e a r e3 7c gi n t h i s p r o m o t e rb u to n l y5c gh a v em a i n t a i n e d ，a n dt h ep e r c e n to f m c p g c p gi so n l y1 3 5 b e s i d e st h a t t h r e ec t ga n dt h r e ec a gh a v e n tc h a n g e d t o o c o n c l u s i o nt h ei m p r o v e dp c rm e t h o dc a np r o v i d et h ep o w e r f u lf e a t u r et h a tt h e c p gi s l a n d so fr a s s f l a i nm c f 一7a n dh e p g 2a r eh i g h l ym e t h y l a t e db u te - c a d h e r i n i nm c f 一7 a d d i n gt h ep r i m e r sa td i f f e r e n tt i m ei np c r a m p l i f i c a t i o na n dc o m b i n i n g w i 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