（内科学专业论文）occludin蛋白在重症急性胰腺炎小鼠肠上皮细胞的表达.pdf

洲ill ii i i if l i i ri l lirli r 删 17 6 9 0 81 目录 一、摘要 中文论著摘要1 英文论著摘要”3 二、英文缩略语5 三、论文 前言”6刖舌”6 材料与方法”6 结果“9 讨论1 3 结论1 4 四、本研究创新性的自我评价1 5 五、参考文献16 六、附录 综述18 在校期间科研成绩2 8 致谢2 9 个人简介3 0 中文论著摘要 o c c l u d i n 蛋白在重症急性胰腺炎小鼠 肠上皮细胞的表达 目的 观察小鼠重症急性胰腺炎肠上皮o c c l u d i n 蛋白表达变化，初步探讨o c c l u d i n 蛋白与肠粘膜屏障损伤的关系。 方法 雄性昆明种小鼠4 0 只，体重2 0 - 2 5 9 ，随机分为对照组( n = 8 ) 、实验组( n - 3 2 ) 。 实验组另分为3 、6 、1 2 、2 4 h 四个时间点，每个时间点8 只。所有小鼠在实验前 禁食1 2h ，自由饮水。实验组小鼠腹腔分两次注射2 0 精氨酸( 每次剂量2 5 0 m g 1 0 0 9 ) ，注射间隔为1h 。对照组腹腔注射等体积的无菌生理盐水。对照组小鼠 末次注射后立即处死，实验组小鼠在末次注射后3 、6 、1 2 、2 4 h 随机各取8 只处 死，取出胰腺组织、回肠组织，胰腺组织h e 染色观察组织形态，肠组织电镜下 观察肠上皮超微结构改变，并应用免疫组化测定紧密连接蛋白o c c l u d i n 表达。 结果 对照组电镜下肠上皮超微结构未见异常；实验组3 h 无明显变化，实验组其他 时点可见肠上皮微绒毛稀疏、排列不整齐，部分断裂、脱落；细胞器受损，核内异 染色质浓缩且边集，细胞连接增宽，2 4 h 时改变最明显。免疫组化显示对照组紧 密连接蛋白o c c l u d i n 均匀一致地分布于肠上皮细胞连接处的顶端；实验组分布不 均，o e c l u d i n 表达随时间推移表达逐渐降低，2 4 小时达最低。对照组与实验组各 组平均光密度值分别为o 3 4 4 8 + 0 0 0 2 8 ，0 3 4 31 + 0 0 0 2 0 ，0 3 4 2 3 + 0 0 0 1 9 ， 0 3 3 9 4 士0 0 0 1 5 ，0 3 0 9 5 士0 0 0 2 7 ，3 h 时与对照组相比无统计学意义，6 h 、1 2 h 、2 4 h 与对照组之间有统计学差异。 结论 重症急性胰腺炎小鼠早期即有肠粘膜屏障损伤，肠上皮细胞间连接增宽，其 可能机制与肠上皮o c c l u d i n 蛋白的表达降低有关。 关键词 重症急性胰腺炎；肠粘膜屏障；o c c l u d i n 2 英文论著摘要 ，1 n l ll l l1 1 ee x p r e s s l o no t0 c c l u 0 1 np r o t e i ni ni n t e s t i n a l aj e p i t h e l i u m0 ts e v e r ea c u t ed a n c r e a t l t l sm l c e o b j e c t i v e t oo b s e r v et h ee x p r e s s i o nc h a n g e so fo c c l u d i np r o t e i ni ni n t e s t i n a le p i t h e l i u mo f s e v e r ea c u t ep a n c r e a t i t i sm i c ea n di n v e s t i g a t et h er e l a t i o n s h i pb e t w e e no c c l u d i na n d i n t e s t i n a lm u c o s a lb a r r i e rd a m a g ep r e l i m i n a r y m a t e r i a l sa n dm e t h o d s 4 0m a l ek u n m i n gm i c e ( w e i g h i n g2 0 - 2 5 9 ) w e r er a n d o m l yd i v i d e di n t oc o n t r o l g r o u p ( n = 8 ) ，e x p e r i m e n t a lg r o u p ( n = 3 2 ) t h ee x p e r i m e n t a lg r o u pw a sd i v i d e d f o u r t i m ep o i n t ( 3 ，6 ，1 2 ，2 4 h ) t h ee x p e r i m e n t a lg r o u pm i c ew e r ei n t r a p e r i t o n e a li n j e c t e d 埘t l ll a r g i n i n e ( 2 5 0 m g gb o d yw e i g h t ) f o r2t i m e sw i t ha ni n t e r v a lo f1h o u r , 8m i c ei n t h ee x p e r i m e n t a lg r o u pw e r er a n d o m l yk i l l e da t3 ，6 ，1 2 ，2 4h o u r sa f t e rl a s ti n j e c t i o n c o n t r o lg r o u p sm i c ew e r ei n j e c t e d 谢t 1 1t h es a m ev o l u m eo fo 9 s o d i u mc h l o r i d ei n t h es a m ew a ya n dw e r es a c r i f i c e da tt h ee n do fl a s ti n j e c t i o n t h ep a n c r e a sa n di l e u mo f m i c ew e r er e m o v e dr a p i d l y p a n c r e a t i ct i s s u ew e r es t a i n e db yh ea n do b s e r v e du n d e r m i c r o s c o p e o b s e r v e d u l t r a s t r u c t u r a lc h a n g e so fi n t e s t i n a l e p i t h e l i a l c e l l su n d e r e l e c t r o nm i c r o s c o p ea n dd e t e r m i n e de x p r e s s i o no fi n t e s t i n a l e p i t h e l i a l c e l l s t i g h t j u n c t i o np r o t e i no c c l u d i n r e s u l t t h ec o n t r o lg r o u p su l t r a s t r u c t u r eo fi n t e s t i n a le p i t h e l i u mc e l l ss h o w e dn o r m a lu n d e r e l e c t r o nm i c r o s c o p e i nt h ee x p e r i m e n t a lg r o u p ，t h e r ew e r en oc h a n g e sa t3 h ，b u t i n t e s t i n a le p i t h e l i a lc e l l so f6 、12 、2 4 ht i m ep o i n t ，m i c r o v i l l iw e r et h i n ，r a r eo rd i s r u p t a n ds h e , d , t h eo r g a n e l l e sw e r ed a m a g e d ，n u c l e a r sh e t e r o c h r o m a t i nc o n d e n s e da n d o b v i o u s l yg a t h e r e da r o u n d ，c e l lj u c t i o n sb e c a m ew i d e n ，t h e s ep h e n o m e n o n sb e c a m e m o s to b v i o u sa t2 4h o u r s o c c l u d i np r o t e i nu n i f o r m l yd i s t r i b u t e dt o po ft h ei n t e s t i n a l e p i t h e l i a lc e l l sj u n c t i o n si nc o n t r o lg r o u p ，b u tt h ee x p e r i m e n t a lg r o u p so c c l u d i nu n e v e n 3 d i s t r i b u t e da n dd e c r e a s e dg r a d u a l l y , r e a c h e dt oam i n i m u ma t2 4h o u r s t h ea v e r a g e o p t i c a ld e n s i t yo fe a c hg r o u pw e r e0 3 4 4 8 + 0 0 0 2 8 ，0 3 4 31 士0 0 0 2 0 ，3 4 2 3 士0 0 0 19 ， 0 3 3 9 4 ：- 0 0 0 15 ，0 3 0 9 5 士0 0 0 2 7 t h e r ei s1 1 0s t a t i s t i c a ls i g n i f i c a n c eb e t w e e nc o n t r o l g r o u pa n d3 h ( 尸l o 0 5 ) ，b u th a v es t a t i s t i c a ls i g n i f i c a n c ec o m p a r e d 、) l ，i t l l6 h 、12 ha n d2 4 h ( 6 hv sc o n t r o lg r o u pp o 0 5 ；12 hv sc o n t r o lg r o u pp o o1 ，2 4 hv sc o n t r o lg r o u p p o 0 1 ) c o n c l u s i o n s i n t e s t i n a lm u c o s a lb a r r i e rw a si n j u r e di nt h ee a r l y s t a g e o fs e v e r ea c u t e p a n c r e a t i t i si nm i c e ，t h er e d u c t i o no fo e c l u d i ne x p r e s s i o nl e a dt ow i d ec e l l sj u n c t i o n a n dd a m a g et h ei n t e s t i n a lm u c o s a lb a r r i e r k e y w or d s s e v e r ea c u t ep a n c r e a t i t i s ；i n t e s t i n a lm u c o s a lb a r r i e r ；o c c l u d i n 4 英文缩略语 5 论文 o c c l u d i n 蛋白在重症急性胰腺炎小鼠肠上皮细胞 的表达 前言 重症急性胰腺炎( s e v e r ea c u t ep a n c r e a t i t i s ，s a p ) 是一种常见的临床急腹症，常 常并发胰腺组织细菌感染和与感染相关的全身炎性反应综合征( s i r s ) 和多器官 功能障碍综合征( m o d s ) ，其病情凶险，病因复杂，预后不良，有报道死亡率高 达2 0 3 0 【。患者往往死于继发感染和多脏器功能衰竭。 已有研究表明，多数的胰腺和胰周组织感染是由移位的肠道细菌及内毒素所 致的肠源性感染，肠道是引发感染细菌的主要来源【2 1 。s a p 时肠屏障功能损伤，通透 性增加，可能是导致肠道细菌及内毒素发生移位的主要原因【3 ，4 1 。o c c l u d i n 蛋白是 肠屏障的重要组成部分，目前已有o c c l u d i n 蛋白与暴发性肝功能衰竭相关肠屏障功 能障碍、烧伤相关肠屏障损伤方面的研究【5 ，6 1 ，本实验观察小鼠重症急性胰腺炎相 关肠上皮损伤时o c c l u d i n 蛋白表达变化。 材料与方法 一、实验材料 ( 一) 实验动物 雄性昆明种小鼠4 0 只，体重2 0 2 5 9 ，购自中国医科大实验动物部。 ( 二) 主要试剂及药品 1 、兔抗小鼠o c c l u d i n 抗体：s c 5 5 6 2 ，s a n t ac r u z 2 、s p 免疫组化试剂盒：购自北京中杉金桥公司 3 、d a b 试剂盒：购自北京中杉金桥公司 4 、l - 精氨酸：购自s i g m a 公司 ( 三) 主要仪器 6 1 、显微镜型号：o l y m p u sb x 4 1 2 、显微图像分析系统：美国m e t am o r p h d p l 0 b x 4 1 软件分析系统 3 、日本电子j e m 1 2 0 0 型透射电镜 二、实验分组及模型建立 随机分为对照组( n - 8 ) 、实验组( n _ 3 2 ) 分为3 、6 、1 2 、2 4 h 四个时间点，每 个时相点8 只。所有小鼠在实验前禁食1 2h ，自由饮水。实验组小鼠腹腔分两次 注射2 0 精氨酸( 每次剂量2 5 0m g l o o g ) ，注射间隔为1h 。对照组腹腔注射等体 积的无菌生理盐水。 三、取材和固定 实验组小鼠在末次注射后3 、6 、1 2 、2 4 h 随机各取8 只予1 0 水合氯醛麻醉致 死，迅速取出胰腺组织、回盲部3 c m 回肠组织，胰腺组织放入1 0 中性甲醛溶液中 固定，光镜下h e 染色观察组织形态。部分肠组织放入2 5 戊二醛溶液( 4 ) 中固 定，部分肠组织放入1 0 中性甲醛溶液固定。对照组小鼠在末次注射后立即予1 0 水合氯醛麻醉致死，同样方法取出胰腺及肠组织。 四、胰腺病理学检查 标本固定于1 0 中性甲醛溶液，石蜡包埋、切片，进行常规h e 染色，光镜观 察组织学变化。 五、电镜观察肠上皮细胞超微结构 操作步骤 1 、将小鼠处死后，立即取回肠，过程在2 分钟内完成。 2 、将取出回肠用0 1 m o l 磷酸缓冲液洗净，立即侵入2 5 戊二醛液( 4 ) 中 固定2 d , 时以上。 3 、o 1 m o l 磷酸缓冲液反复清洗3 次，每次1 0 2 0 分钟。 4 、1 四氧化锇固定液( 4 ) 固定2 5 小时。 5 、o 1 磷酸缓冲液反复清洗3 次，每次5 分钟。 6 、用5 0 、7 0 、8 0 、9 0 、1 0 0 梯度乙醇、丙酮脱水。 7 、用纯环氧树脂( e p o n ) 8 1 2 包埋液：丙酮( 1 ：1 、1 ：2 、1 ：3 ) 浸泡各3 、 7 4 、5 小时。 8 、取出样品，放置包埋模具中，放入6 0 烤箱中聚合2 天。 9 、取出制成半薄切片( 5 0 0 n m ) ，甲基蓝染色，光镜下定位，制成超薄切片 ( 5 0 n m ) ，醋酸双氧铀柠檬酸铅双重染色，透射电镜观察。 六、免疫组化法检测肠组织中o c c l u d i n 蛋白的表达 采用免疫组织化学检测技术s p 法，严格按照说明书进行，具体操作步骤： 1 、将盖玻片常规洗净、浸酸过夜、流水冲洗后烤干。 2 、将石蜡切片依次浸于：二甲苯i2 0 分钟一二甲苯i i1 0 分钟一二甲苯i i l l 0 分钟一1 0 0 乙醇i5 分钟一1 0 0 乙醇i i5 分钟- 9 5 乙醇5 分钟一9 0 乙醇5 分 钟- 8 0 乙醇5 分钟- 7 0 乙醇5 分钟- - p b s 5 分钟 3 、抗原热修复法：枸橼酸中煮沸5 分钟一关火5 分钟一煮沸8 分钟一凉至 3 7 以下。 4 、p b s 冲洗3 次，每次3 0 秒。 5 、滴加内源性过氧化氢酶阻断剂( a ) ，3 7 孵育箱保湿盒内孵育1 0 分钟， 封闭过氧化氢酶。 6 、p b s 冲洗3 次，每次3 0 秒。 7 、滴加山羊正常血清封闭液( b ) ，3 7 孵育箱保湿盒内孵育1 0 分钟。 8 、滴加一抗兔抗小鼠o c c l u d i n 抗体，4 。c 过夜。抗体工作浓度为1 ：2 0 0 。 9 、恢复至室温，3 7 c 孵育箱保湿盒内孵育2 0 分钟。 1 0 、滴加生物素标记的山羊抗小鼠i g g ( c ) ，3 7 。c 孵育箱保湿盒内孵育3 0 分 钟。 1 1 、p b s 洗3 次，每次3 0 秒。 1 2 、滴加链霉素抗生物素过氧化物酶( d ) ，3 7 c 孵育箱保湿盒内孵育1 0 分 钟。 1 3 、p b s 洗3 次，每次3 0 秒。 1 4 、d a b 显色，滴加新鲜配制的d a b 显色剂，显色5 2 0 分钟，充分水洗。 1 5 、苏木素复染3 0 秒，充分水化。 1 6 脱水封片，7 0 乙醇1 5 秒8 0 乙醇一9 0 乙醇1 5 秒- - 9 5 乙醇1 5 秒 8 一1 0 0 乙醇i i1 5 秒一1 0 0 乙醇i1 5 秒一二甲苯i i1 5 秒一二甲苯i1 5 秒，封片。 阴性对照除了用p b s 代替一抗外，所有步骤同上。 蛋白表达的半定量分析：每个时间点每组随机抽取不同的切片8 张，每张切 片于光镜下( x 4 0 0 ) 随机选取5 个视野，固定窗口面积，利用美国u n i v e r s a li m a g i n i n g p o r p p r a t i o n 图象分析系统，应用m e r em o r p h 软件分析平均光密度值。 六、统计学分析 数据均以x 士s 表示，应用s p s s1 3 0 对各组间数据进行分析，组问比较采用 l s d 方差分析，以p o 0 5 表示差异有显著性。 结果 一、肉眼观察小鼠腹腔内变化 对照组未见明显异常( 图1 ) 。实验组3 h 无明显变化( 图2 ) ，6 h 可见胰腺轻 度允血( 图3 ) ，1 2 h 可见微量腹水( 图4 ) ，实验组2 4h 时腹腔可见较多腹水，并 见胰腺体积增大、水肿明显，肠道部分充血、扩张( 图5 ) 。 图1 ，对照组小鼠腹腔 一 图2 ，实验组3 h d , 鼠腹腔 图3 ，实验组6 h d , 鼠腹腔图4 ，实验组1 2 h d 、鼠腹腔 9 图5 ，实验组2 4 h d x 鼠腹腔 二、胰腺病理学改变 对照组小鼠的胰腺组织结构清晰，细胞形态正常，无出血坏死( 图6 ) 。实验 组3 h 无明显变化( 图7 ) ；实验组6 h 呈现水肿胰腺炎改变，小叶间隙增宽、炎细胞 侵润，但小叶结构完好，腺泡细胞无坏死；1 2 h 、2 4 h 胰腺小叶结构紊乱，明显充 血，腺泡细胞坏死，坏死区周围炎细胞侵润( 图8 ，图9 ，图1 0 ) 。 图6 ，对照组胰腺h e 染色( x 4 0 0 )图7 ，实验组3 h 胰腺h e 染色( x 4 0 0 ) 图8 ，实验组6 h 胰腺h e 染色( x 4 0 0 )图9 ，实验组1 2 h 胰腺h e 染色( x 4 0 0 ) 1 0 图1 0 ，实验组2 4 h 胰腺h e 染色( x 4 0 0 ) 三、电镜下肠上皮细胞超微结构改变 对照组肠黏膜上皮细胞表面微绒毛排列整齐，柱状上皮细胞结构完整，细胞质 内细胞器丰富，结构未见异常，细胞问连接紧密( 图1 1 ) ；实验组3 h 无明显变化 ( 图1 2 ) ；实验组其余各时间点可见微绒毛稀疏、排列不整，部分断裂、脱落；线 粒体肿胀，嵴减少，胞质内粗面内质网和高尔基复合体扩张呈空泡变性，内质网扩 张，核糖体脱落，胞核形状不规则；核内异染色质浓缩且边集明显；细胞连接增宽； 2 4 h 时改变最明显。( 图1 3 ，图1 4 ，图1 5 ) 。 图1l ，甜照组肠上皮电镜超微绌构( x 8 0 0 0 )图1 2 ，实验组( 3 h ) 肠上皮l 乜镜超微结构( x 8 0 0 0 ) 图1 3 ，实验组( 6 b ) 肠上皮l 也镜超微纷构( x 8 0 0 0 )图1 4 ，实验组( 1 2 h ) 肠上皮电镜超微结构( 8 0 0 0 ) 图1 5 ，实验组( 2 4 h ) 肠卜皮电镜超微结构( x 8 0 0 0 ) 四、o c c l u d i n 蛋白在肠组织的表达 对照组o c c l u d i n 蛋白均匀一致地分布于肠上皮细胞连接处的顶端，呈表达很 强的棕褐色信号( 图1 6 ) 。实验组蛋白o c c l u d i n 蛋白表达颜色变淡，分布不均， 表达逐渐减弱，( 图1 7 、图1 8 、图1 9 、图2 0 ) 。免疫组化平均光密度值示3 h 与 对照组相比无统计学意义，6 h 、1 2 h 、2 4 h 与对照组之问有统计学差异( 表1 、图 2 1 ) 。各组o e c l u d i n 蛋白表达的平均光密度值比较( x 士s ，n - 8 ) 组别o c c l u d i n 平均光密度值 对照03448士00028 3 h0 3 4 31 + 0 0 0 2 0 6 h0 3 4 2 3 士0 0 019 a 实验组1 2 h 0 3 3 9 4 0 0 0 1 5 b4 士5 。 2 4 h 0 3 0 9 5 - 4 - 0 0 0 2 7 b a 与对照组比较，氏0 0 5 ；b 与对照组比较，p 0 0 1 图1 6 ，对照组o c c l u d i n 表达( 免疫组化x 4 0 0 )图1 7 ，实验组( 3 h ) o c c l u d i n 表达( 免疫组化x 4 0 0 ) 1 2 图1 8 ，实验组( 6 h ) o c c l u d i n 表达( 免疫组化x 4 0 0 )图1 9 ，实验组( 1 2 h ) o c c l u d i n 表达( 免疫组化x 4 0 0 ) 图2 0 ，实验组( 2 4 h ) o c c l u d i n 表达( 免疫组化4 0 0 )图2 1 ，o c c l u d i n 蛋白表达的平均光密度值比较 讨论 重症急性胰腺炎( s e v e r ea c u t ep a n c r e a t i t i s ，s a p ) 常并发胰腺组织细菌感染和与 感染相关的全身炎性反应综合征( s i r s ) 和多器官功能障碍综合征( m o d s ) ，患 者多死于继发感染和多脏器功能衰竭。多数的胰腺和胰周组织感染是由移位的肠 道细菌及内毒素所致的肠源性感染，肠道是引发感染细菌的主要来源。s a p 时肠 屏障功能损伤，可能是导致肠道细菌移位的主要原因。有研究发现a p 组肠组织中 t n f 0 【含量显著高于对照组，表明t n f a 参与了a p j 鼠的肠屏障功能损伤j ，另有 研究通过免疫吸附清除循环t n f 0 【能有效减轻休克兔肠道的病理损害p 1 。国内有 学者研究观察p 1 犬小肠缺血再灌注后超微结构的改变，发现犬小肠缺血再灌注后 肠黏膜上皮细胞微绒毛广泛剥脱、上皮细胞表面破溃，肠黏膜屏障遭破坏。重症 急性胰腺炎时，蛋白质分解，糖原异生，脂肪动员增强，机体呈高代谢反应状态， 有研究结果表训1 0 ，1 1 1 ，完全肠内营养超过l 周可使肠黏膜细胞萎缩，肠道菌群失 调，细菌移位。大分子物质包括细菌穿过肠黏膜上皮细胞，一是通过上皮细胞的 1 3 胞饮作用，另一种是通过细胞旁间隙l l 川，后者依赖于细胞间连接完整性的破坏。 肠上皮细胞间连接由紧密连接、黏附连接、缝隙连接等构成。构成肠上皮细胞间 连接的蛋白主要有o c c l u d i n 、c l a u d i n 、z o 1 等l j 川。o c c l u d i n 蛋白是紧密连接中重 要的结构蛋白，能通过外环以拉链式结合进而产生严密的细胞间连接制。有研究 表明，缺乏o c c l u d i n 蛋白的成纤维细胞不能形成典型的紧密连接结构川，o c c l u d i n 蛋白作为构成紧密连接的主要蛋白之一，在维持紧密连接结构方面具有重要作用。 目前对烧伤和暴发肝功能衰竭动物模型的研究显示有肠屏障损伤，o c c l u d i n 蛋白的 表达降低l 孓酬，但对s a p 时肠上皮o c c l u d i n 蛋白的研究较少。 本实验研究显示，电镜下观察s a p 组小鼠肠上皮超微结构，微绒毛稀疏、排 列不整，部分断裂、脱落，细胞连接增宽，2 4 h 时改变最明显，表明s a p 可导致小鼠 肠粘膜屏障损伤。免疫组化显示，对照组o c c l u d i n 蛋白均匀一致地分布于肠上皮细 胞连接处的顶端，呈表达很强的棕褐色信号。而实验组3 、6 、1 2 、2 4 h 时表达逐渐 减弱，颜色变淡，分布不均。免疫组化平均光密度值示3 h 与对照组相比无统计学 意义，6 h 、1 2 h 、2 4 h 与对照组之间有统计学差异。在急性重症胰腺炎小鼠模型中， 肠上皮o e c l u d i n 蛋白表达降低，2 4 h 时最明显，与肠上皮超微结构改变一致，因而 推测肠上皮o c c l u d i n 蛋白表达下调可能导致紧密连接的完整性受到破坏，导致细胞 间隙增宽，进而为细菌的穿透提供了可能，引起胰腺和胰周组织感染。结合前文 所述，急性重症胰腺炎时o c c l u d i n 蛋白表达降低可能主要与下列因素有关：1 炎症 介质及细胞因子的释放，研究已发现t n f a ，i n f r 等炎症因子有协同作用下调 o c c l u d i n 蛋白启动子的表达l lo 。；2 肠道微循环障碍，已有研究发现，停循环低温后 家兔脑血管内皮细胞o c c l u d i n 表达减少u ；3 肠道营养障碍，胰腺炎由于禁食及高 代谢，导致合成o c c l u d i n 蛋白的营养物质缺乏。但重症胰腺炎时o c c u l d i n 蛋白表达 降低的确切机制有待于进一步相关实验研究。 结论 重症急性胰腺炎小鼠早期即有肠粘膜屏障损伤，肠上皮细胞o c c l u d i n 蛋白的表 达降低可能导致细胞连接增宽，损伤肠粘膜屏障。 1 4 1 5 紧密连接结构方面 的紧密连接结构。 o c c l u d i n 蛋白的表 究较少。本研究通 白表达变化。 h e m o r r h a g i cp a n c r e a t i t i s t m u m a 2 0 0 0 ；8 ( 2 ) ：314 - 3 16 4j u v o n e np o , a l h u v ae m ，t n k m aj a g u tp e r m e a b i l i t yi np a t i e mw i t ha c u t ep a n e r e a t i t i s s c a n d jg a s t r o e n t e r 0 1 2 0 0 0 ；3 5 ( 12 ) ：1314 - 1318 5c u iw ：w a n gy ，e ta 1 t h ei m p a c to ft u m o rn e c r o s i sf a c t o ra l p h ao ne x p r e s s i o no fi n t e s t i n a l e p i t h e l i a lt i g h tj u n c t i o np r o t e i no c c l u d i ni nf u l m i n a n th e p a t i cf a i l u r em i c em o d e l z h o n g h u a n e ik ez az h i 2 0 0 7j u n ；4 6 ( 6 ) ：4 7 8 - 4 81 6 s h a ol h u a n gq ，e ta c h a n g e so fo c c l u d i ne x p r e s s i o ni ni n t e s t i n a lm u c o s aa f t e rb u mi nr a t s b u r n s 2 0 0 5n o v ；31 ( 7 ) ：8 3 8 8 4 4 7 赵秋玲，董银生，李天真l 精氨酸诱导急性胰腺炎小鼠肠黏膜损伤的实验研究胰腺病 学2 0 0 5 ；5 ( 2 ) ：9 7 - 1 0 0 8 林跃萍，张训，侯凡凡免疫吸附清除循环肿瘤坏死因子a 对内毒素休克兔肠道改变的影响 中国危重病急救医学1 9 9 9 ；11 ( 8 ) ：4 6 9 4 7 1 9 邬善敏，赫杰，邹力，等肠缺血再灌注对肠粘膜屏障损害的超微结构研究华中医学杂 志1 9 9 8 ；2 3 ( 3 ) ：1 0 1 - 1 0 2 10a m m o r ib j ，c a i r n sa ，d i x o nm f ，e ta 1 a l t e r e di n t e s t i n a lm o r p h o l o g ya n di m m u n i t yi n p a t i e n t sw i t ha c u t en e c r o t i z i n gp a n c r e a t i t i s h e p a t o b i l i a r yp a n c r e a ts u r g , 2 0 0 2 ；9 ( 4 ) ：4 9 0 - 4 9 6 11a b o u - a s s is ，c r a i gk ，0 k e e f es j h y p o c a l o r i cj e j u n a lf e e d i n gi sb e t t e rt h a nt o t a lp a r e n t e r a l n u t r i t i o ni na c u t ep a n c r e a t i t i s ：r e s u h so far a n d o m i z e dc o m p a r a t i v es t u d y a mjg a s t r o e n t e r 0 1 2 0 0 2 ；9 7 ( 9 ) ：2 2 5 5 - 2 2 6 2 1 2n u s r a ta ，t u r n e r ，j r , m a d a r a 儿m o l e c u l a rp h y s i o l o g ya n dp a t h o p h y s i o l o g yo f t i g h t j u n c t i o n s i vr e g u l a t i o no ft i g h tj u n c t i o n sb ye x t r a c e l l u l a rs t i m u l i ：n u t r i e n t s ，c y t o k i n e s ，a n di m m u n ec e l l s a mjp h y s i o lg a s t r o i n t e s tl i v e rp h y s i 0 1 2 0 0 0 ；2 7 9 ：g 8 5 1 - 8 5 7 1 3m a z z o ne ，s t u m i o l og c ，p u z z o l od ，e ta 1 e f f e c to fs t r e s so nt h ep a r a c e l l u l a rb a r r i e ri nt h er a t i l e u m g u t2 0 0 2 ；51 ：5 0 7 513 14n u s r a ta ，c h e nj a ，f o l yc s ，e ta 1 t h ec o i l e d - c o i ld o m a i no fo c c l u d i nc a l la c tt oo r g a n i z e s t r u c t u r a la n df u n c t i o n e a le l e m e n t so ft h e e p i t h e l i a lt i g h tj u n c t i o n j b i o lc h e m 2 0 0 0 ；2 7 5 ( 3 8 ) ：2 9 816 2 9 8 2 2 15s a i t o um ，f u j i m o t ok ，d o iy ，e ta 1 o c c l u d i n - d e f i c i e n te m b r y o n i cs t e mc e l l sc a nd i f f e r e n t i a t e i n t op o l a r i z e de p i t h e l i a lc e l l sb e a r i n gt i g h tj u n c t i o n s jc e l lb i o l19 9 8 ；141 ：3 9 7 - 4 0 8 16m a n k e r t zj ，t a v a l a l is ，s c h m i t zh ，e ta 1 e x p r e s s i o nf r o mt h eh u m a no c c l u d i n gp r o m o t e ri s 1 6 a f f e c t e d b yt u m o rn e c r o s i sf a c t o ra l p h aa n di n t e r f e r o ng a m m a jc e l l s c i2 0 0 0 ；113 ( p t l1 ) ：2 0 8 5 2 0 9 0 1 7 黄海波，i 丑) l l ，等深低温停循环后家兔脑血管内皮细胞紧密连接蛋i 刍o c c l u d i n 表达变化的实 验研究中国分子心脏病学杂志2 0 0 9 年6 月第9 卷第3 期 1 7 ，常 常并发胰腺组织细菌感染和与感染相关的全身炎性反应综合征( s i r s ) 和多器官 功能障碍综合征( m o d s ) ，其病情凶险，病因复杂，预后不良，病死率达1 5 2 0 【1 1 ，亦有报道死亡率高达2 0 3 0 【2 1 。患者往往死于继发感染和多脏器功能 衰竭。已有研究表明，多数的胰腺和胰周组织感染是由移位的肠道细菌及内毒素 所致的肠源性感染，肠道是引发感染细菌的主要来源p j 。s a p 时肠屏障功能损伤， 通透性增加，可能是导致肠道细菌及内毒素发生移位的主要原因【4 ，5 1 。本文就重症 急性胰腺炎相关肠屏障功能损伤的机制作一综述。 一、s a p 时肠屏障的变化 肠屏障由机械屏障、微生物屏障、化学屏障及免疫屏障共同构成。肠道依靠 其屏障作用，可有效地防止肠内细菌及内毒素发生移位。但机体在严重感染、创 伤、疾病( s a p ) 等情况下，肠黏膜结构及功能可严重受损，进而继发肠内细菌及内 毒素移位，引起肠外脏器感染，导致机体致命性的损伤。 ( 一) 机械屏障变化 机械屏障由肠道黏液层、肠黏膜上皮细胞、细胞间紧密连接与菌膜等构成，是 肠黏膜屏障的结构基础。广义上讲，机械屏障还应包括肠道的运动功能，肠蠕动将 肠内食物残渣向远侧推进，防止细菌在邻近肠黏膜的长时间滞留，减少细菌穿过 黏液层到达上皮的机会，起到肠道自洁作用。n a g p a l 6 1 利用糖分子探针对s a p 患 者肠通透性进行研究，乳果糖甘露醇的吸受比较轻型胰腺炎( m a p ) 患者增加近6 倍，表明肠通透性明显增加，且于病程7d 达到高峰。y a s u d a 等l ，1 研究发现s a p 时可见肠黏膜水肿，肠上皮细胞间紧密连接遭到破坏，肠上皮细胞凋亡增加，肠 绒毛高度降低，肠系膜血管收缩血流量减少，严重者黏膜出现坏死、溃疡。 ( 二) 微生物屏障变化 1 8 ，正常肠道内细菌达5 0 0 种以上，其中9 9 为专性厌氧菌，约1 为需氧菌及兼 性厌氧菌，在肠道细菌和肠道的形态与功能之间，不同种类的肠道细菌之间维持 着精细而又复杂的平衡。双歧杆菌等益生菌具有定植性、排他性和繁殖性，可以 产生有机酸、过氧化氢和细菌素等抗菌活性物质，显著限制致病的肠道微生物与 肠黏膜上皮接触、黏附和定植p j ，也可以通过产生某些酶来修饰毒素受体，阻断 或减少毒素与肠黏膜受体的结合【9 1 。s a p 时机体易出现肠道菌群紊乱，主要表现 为以大肠杆菌为主的肠道需氧菌呈优势生长，而双歧杆菌等厌氧菌受到抑制，数 量减少，正常的菌膜结构遭破坏，导致厌氧菌定殖力大为减弱。v a n 等【1 0 】报道， 急性坏死性胰腺炎( a n p ) 大鼠十二指肠革兰阳性球菌、革兰阴性杆菌、厌氧菌均过 度生长。吴承堂等u 发现，s a p 犬模型的肠内双歧杆菌和乳杆菌计数明显下降， 厌氧菌与需氧菌比例严重失衡。 ( 三) 化学屏障变化 是指肠黏膜上皮分泌的黏液、消化液及肠腔内正常寄生菌产生的抑菌物质构 成肠道的化学屏障。胃液高酸度，可以有效地杀灭细菌，肠黏液可以包裹细菌、毒 素，肠道菌群对致病菌有制约作用。s a p 时禁食、胃肠减压时间如果超过1 2 周， 由于胃肠道长期处于无负荷状态，使消化液产生减少，胃肠减压又导致消化液大 量丢失，肠粘膜化学屏障破坏。 ( 四) 免疫屏障变化 肠道免疫屏障主要由分泌至肠黏膜表面及肠腔中的免疫球蛋白( 主要为s i g a ) 和肠道黏膜内以淋巴细胞为主体的免疫活性细胞共同构成。肠黏膜上皮细胞处于 机体与外界抗原接触的第一线，在感染防御及抗原吸收、转运、提呈等方面具有重 要作用。s a p 患者全身各器官处于高代谢状态，由于长期禁食、营养物质缺乏等 因素，肠道相关淋巴组织的特异性与非特异性免疫功能受损，特别是s l g a 分泌减 少。通常认为肥大细胞指数代表了肠黏膜免疫功能，a m m o r i o z 发现，s a p 患者 回肠黏膜肥大细胞指数较对照组减少3 0 。王兴鹏等副研究发现a n p 大鼠6h 后回肠p e y e r 集合淋巴结中存在大量凋亡淋巴细胞， 提示肠道免疫屏障受损。另 外s a p 患者周围循环淋巴细胞凋亡增加。 1 9 二、s a p 时肠屏障的损伤机制 目前s a p 患者导致肠屏障损伤的具体机制仍不甚清楚，s a p 时肠屏障功能的 损伤不是由某个单一因素所致的，它是多种损伤因素共同作用的结果，各因素间 相互关联、互相作用，共同导致肠屏障功能的损害，可能与下列因素有关。 ( 一) 炎症介质与细胞因子过度释放 s a p 早期胰腺内、肠粘膜即有白细胞的过度激活，产生的大量促炎症因子如 t n f a 、p a f 、n f k b 、i l 1 、i l 6 等，介导了肠粘膜的炎症反应，肠粘膜屏障功 能障碍导致细菌易位，进一步促进细胞因子、炎性介质、氧自由基等大量释放， 进一步加重肠粘膜炎症。s a p 时细胞因子一旦产生，不但可以自身激活，还能促 进其它细胞因子和炎性介质的产生，引起连锁和放大效应，即瀑布效应( c a s c a d e ) 。 有研究表明高迁移率族蛋白b 1 ( h m g b l ) 作为晚期炎症介质介导了肠黏膜屏障 功能不全的发生与发展【1 4 1 。炎症介质和细胞因子是机体、对各种有害因子作出保 护性应答反应的产物，但过多产生除加重s i r s 、引发m o d s 外，进一步损伤肠 屏障功能 1 5 ，1 6 1 。 l 、肿瘤坏死因子( t n f a ) t n f a 主要由活化的单核巨噬细胞产生，具有广泛的生物学活性，在一定的 水平下能对机体产生保护作用，但过高浓度的t n f 0 【则可引发对机体组织器官的 损害。在s a p 时，t n f q 主要由浸润胰腺的巨噬细胞产生，此外，肺、脾和腹膜 单核巨噬细胞也能产生t n f n 。现已证实，t n f a 是a p 时炎性介质级联反应中 一种起核心作用的免疫反应刺激因子川。肿瘤坏死因子( t n f 0 【) 被认为既可直接 诱导血管内皮细胞的通透性增加，