（分析化学专业论文）β环糊精修饰的纳米金粒子在毛细管电色谱手性分离中的应用研究.pdf

雯，! 弋00 e _ 俺 t 独创性声明 本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师指导下独立进行研究工作所取 得的成果。据我所知，除了特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果。对本人的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文 中作了明确的说明。本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：酗。跹 日期：丝丝：! ! ：丑 学位论文使用授权书 本学位论文作者完全了解东北师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即： 东北师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子版， 允许论文被查阅和借阅。本人授权东北师范大学可以将学位论文的全部或部分内容 编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编本学位 论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：毖 日 期：2 0 l o , o ( ，0 7 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 指导教师签名： 日期： 电话： 邮编： 黔一 h i 摘要 毛细管电泳以其分离效率高，分离速度快，操作模式多等特点，迅速发展成为一种 极其有效的分离技术，在分离分析方面具有十分重要的作用和广泛的应用前景。本论文 主要研究了以巯基环糊精修饰的纳米金粒子作为准固定相的毛细管电色谱( c e c ) 在手 性分离中的应用，旨在建立一种高效、灵敏、快速、低耗的毛细管电色谱手性分离的方 法。本论文的研究工作主要集中在以下几个部分： ( 1 ) 合成水溶性的、分布均匀的、稳定性好的巯基环糊精修饰的纳米金粒子( p s h c d m o t t l e dg n p s ) ，并通过透射电镜( t e m ) ，核磁共振( h n m r ) ，红外( f t t r ) 以及紫外 光谱( u v ) 进行表征。 ( 2 ) 以合成的巯基环糊精修饰的纳米金粒子为准固定相，利用高效毛细管电色谱技 术对几种典型的天然手性氨基酸进行拆分。优化缓冲溶液p h 值、分离电压、纳米金粒 子浓度等实验条件。以极低的纳米金粒子浓度( 如1 0 m m l ，仅相当于o 3 8m m 环糊 精) 即可达到基线分离。 ( 3 ) 以合成的巯基环糊精修饰的纳米金粒子为准固定相，利用高效毛细管电色谱技 术对几种市售手性药物进行拆分。优化实验条件，同样以极低的纳米金粒子浓度( 如 0 8 m # m l ，仅相当于0 3 0m m 环糊精) 即可达到基线分离。 ( 4 ) 采用毛细管电泳紫外检测技术分析分离了爆炸残余物无机阴阳离子和一些有机 物。通过快速、准确检验鉴定爆炸残余物痕量成份，准确地认定炸药种类，能够为侦破 爆炸案件提供线索和证据。 关键词：毛细管电泳；毛细管电色谱；手性分离；纳米金；环糊精 m i 一 t i o a b s t r a c t c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i si sau s e f u ls e p a r a t i o nt e c h n o l o g ya n d h a sb e e na p p l i e dt om a n y f i e l d s ，o w i n gt oi t sc h a r a c t e r i s t i c s ：h i 曲e f f i c i e n c ys e p a r a t i o n ，h i 曲s p e e da n a l y s i s ，m o r e m a n i p u l a t i o nm o d ea n de ta 1 a p p l i c a t i o n so ft h i o l a t e d b c y c l o d e x t r i nm o d i f i e dg o l dn a n o p a r - t i c l e sf o rc h i r a ls e p a r a t i o nb a s e do nc a p i l l a r ye l e c t r o c h r o m a t o g r a p h yw e r es t u d i e di nt h i s a r t i c l ew h i c ha i m e da te s t a b l i s h i n ga na n a l y s i sm e t h o do fe f f i c i e n c ys e p a r a t i o n ，h i g hs p e e d a n a l y s i sa n dl o wc o n s u m p t i o n i ti n c l u d e ss o m ep a r t si nt h i sr e s e a r c hw o r k ： ( 1 ) ac l a s s i c sm e t h o dw a si n t r o d u c e di ns y n t h e s i z i n gt h i o l a t e d - 1 3 一c y c l o d e x t r i nm o d i f i e d g o l dn a n o p a r t i c l e so fw h i c hw e r ew a t e rs o l u b l e ，h o m o g e n i z e da n dg o o ds t a b i l i t y a n dt h e y w e r ec h a r a c t e r i z e db yt e m ，n m r ，f t - t ra n du va b s o r p t i o ns p e c t r o s c o p y ( 2 ) u s et h es y n t h e s i z e do ft h i o l a t e d 3 - c y c l o d e x t r i nm o d i f i e dg o l dn a n o p a r t i c l e sa s p s e u d o s t a t i o n a r yp h a s ef o ra m i n oa c i de n a n t i o s e p a r a t i o n b a s e do nc a p i l l a r ye l e c t r o c h r o m a t o - g r a p h yw a ss t u d i e di nt h i sc h a p t e r e x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n so f b u f f e rp h ，s e p a r a t i o nv o l t a g e a n dc o n c e n t r a t i o no fg n p sw e r eo p t i m i z e d b a s e l i n es e p a r a t i o nw a sr e c e i v e da tv e r yl o w c o n c e n t r a t i o no fg n p s ( s u c ha s1 0 m g m l ，t ob ee q u i v a l e n tt oo 38m mo f 1 3 - c d ) ( 3 ) u s et h es y n t h e s i z e do ft h i o l a t e d1 3 - c y c l o d e x t r i n m o d i f i e dg o l dn a n o p a r t i c l e sa s p s e u d o s t a t i o n a r yp h a s ef o rd r u g se n a n t i o s e p a r a t i o n b a s e do nc a p i l l a r ye l e c t r o c h r o m a t o g r a p h y w a ss t u d i e di nt h i sc h a p t e r e x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n sw e r eo p t i m i z e d b a s e l i n es e p a r a t i o nw a s r e c e i v e da tv e r yl o wc o n c e n t r a t i o no fg n p s ( s u c ha so 。8 m g m l ，t ob ee q u i v a l e n tt o0 3 0m m o f 1 3 - c d ) ( 4 ) s o m ei n o r g a n i c sa n do r g a n i c si ne x p l o s i v e sr e s i d u ew e r ea n a l y z e db yc a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s i s i tc o u l db ec o n f i r m e da c c u r a t e l yt h a tt h ek i n do fe x p l o s i v e sb ye x p e r i m e n t w h i c hc o u l da p p l yc l u e sa n de v i d e n c e sf o rc a s e so fe x p l o d i n g k e y w o r d s ：c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ：c a p i l l a r ye l e c t r o c h r o m a t o g r a p h y ；c h i r a ls e p a r a t i o n ； g o l dn a n o p a r t i c l e s ；c y c l o d e x t r i n i i 囊 孙_，- 一 、： 目录 中文摘要i 英文摘要i i 目录i l l 第一章前言1 1 1 弓l 言1 1 2c e 的基本理论1 1 2 1c e 的基本原理_ 1 1 2 2c e 的分离模式2 1 2 3 检测方法0 000 00 ! 3 1 2 4 特点4 1 3 毛细管电泳的应用4 1 4c e 手性拆分的原理5 1 4 1 手性消除6 1 4 2 构建手性环境o o g o o 6 1 5 手性添加剂0 0 00 00 7 1 5 1 环糊精的简介7 1 5 2 环糊精对对映体的识别机理- - 8 1 5 3 环糊精在手性分离中的应用8 1 6 纳米材料在毛细管电泳应用中的研究9 1 7 展望c e 技术：9 1 8 本论文研究的内容和意义b 00 p qoo 1 0 参考文献1 1 第二章巯基环糊精修饰的纳米金的合成及其表征1 5 2 1 前言1 5 2 2 实验部分1 5 2 2 1 实验仪器和试剂1 5 2 2 2 单取代巯基环糊精修饰的纳米金的合成1 5 2 3 表征手段1 7 2 3 1 简单易操作的表征方法验证巯基1 7 2 3 2 紫外光谱1 7 i i i 2 3 3 透射电镜1 7 2 3 4 红外谱图1 8 2 3 5 核磁谱图1 8 2 4 结论1 9 参考文献2 0 第三章毛细管电色谱对氨基酸的手性分离2 2 3 1 引言2 2 3 2 实验部分2 2 3 2 1 仪器与试剂2 2 3 2 2 缓冲溶液和样品的制备2 3 3 2 3 衍生方法2 3 3 2 4 电泳条件2 3 3 3 结果讨论2 3 3 3 1 1 3 - s h c dm o d i f i e dg n p s 的浓度对手性分离的影响2 3 3 3 2p h 值的影响2 4 3 3 3 电压”d j qodo e 2 5 3 3 4 环糊精浓度对比实验2 6 3 4 结论2 7 参考文献2 9 第四章毛细管电色谱对手性药物的分离3 1 4 1 前言3 1 4 2 实验部分3 1 4 2 1 实验仪器0 0 00 0oq00 00 3 2 4 2 2 实验药品3 2 4 2 3 样品准备3 2 4 2 4 电泳条件3 2 4 3 结果与讨论3 2 4 3 1 3 - s h c dm o d i f i e dg n p s 的浓度对分离的影响3 2 4 3 2 缓冲溶液浓度的影响3 4 4 3 3 溶液p h 值的影响3 4 4 3 4 电压的影响：3 4 4 3 5 环糊精浓度对比实验3 4 4 4d 、结3 6 参考文献3 7 第五章毛细管电泳在爆炸残余物成分鉴定中的应用3 8 5 1 简介3 8 5 2 实验部分k 3 8 i v v 一 东北师范大学硕士学位论文 第一章前言 1 1 引言 毛细管电泳( c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ，c e ) 又称高效毛细管电泳( h p c e ) ，是2 0 世纪8 0 年代后期兴起并且迅速发展起来的一种新型液相分离分析方法，是现代分析化 学中继高效液相色谱之后的又一重大发展，它出现就引起分离科学界极大的关注。它 是以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据样品中各组分之间淌度和分配行为 上的差异而实现分离的一类液相分离技术。毛细管电泳是电泳技术和现代微柱分离相结 合的产物，它具有速度更快、效率更高、样品和试剂消耗量特少、操作模式多且灵活等 优点，可用于生化分析，环境分析，医药分析，食品分析以及侦破学分析等很多领域。 由于c e 的这些优点，使其在短短的几十年已经发展成为手性物质分离的一种很有效 的方法，并得到了普遍应用。手性是自然界的一种普遍现象，构成生物体的基本物质如 氨基酸、糖类等都是手性分子。手性分子( 也称对映体) 是其分子结构具有左右对称的 性质，这类物质除了对偏振光呈现不同的性质之外，其它的物理化学性质都相同，但是 它们在活性、代谢以及药物动力学上存在着差异，特别是在食品科学，药物科学，环境 科学等往往要求进行手性分析分离，因此对手性化合物的研究具有十分重要的意义。 纳米材料是指在纳米( 1 0 。9 m 长度范围内的微粒或复合材料，它具有表面效应、 小尺寸效应、量子效应和宏观隧道效应等特性。早期就有运用纳米材料来改善液相色谱 和气相色谱分离效果的研究【1 。2 】。近年来一些分析工作者先后做了将纳米材料应用到毛 细管电泳技术的尝试，并且取得了很大进展。但是有关将纳米材料应用到毛细管电色谱 实现手性分离的研究不是很多。 本论文主要研究了以巯基p 一环糊精修饰的纳米金粒子为准固定相，利用毛细管电色 谱技术实现了几种典型氨基酸和药物的手性分离。 1 2c e 的基本理论 1 2 1c e 的基本原理 c e 系统指以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据样品中各组分之间淌度 和分配行为上的差异而实现分离的一类液相分离技术。在电解质溶液中，带电粒子在电 场作用下，以不同的速度向其所带电荷相反方向迁移的现象叫电泳。在高电压作用下， 双电层中的水合阳离子引起流体整体地朝负极方向移动的现象叫电渗。粒子在毛细管内 电解质中的迁移速度等于电泳和电渗流( e o f ) 两种速度的矢量和。正离子的运动方向 和电渗流一致，故最先流出；中性粒子的电泳流速度为“零”，故其迁移速度相当于电 渗流速度；负离子的运动方向和电渗流方向相反，但因电渗流速度一般都大于电泳流速 1 东北师范大学硕士学位论文 度，故它将在中性粒子之后流出，从而因各种粒子迁移速度不同而实现分离。这就是毛 细管电泳分离的原理。 毛细管电泳仪结构包括一个高压电源，一根毛细管，一个检测器及两个供毛细管两 端插入而又可和电源相连的缓冲液贮瓶。其仪器装置简易图见f i g u r e l 1 。其中毛细管是 c e 的关键部件，它由石英制成，毛细管的内径一般是2 5 微米- 1 0 0 微米，外壁涂以聚合物 以增强毛细管的韧性及强度，内壁分为涂层和无涂层两种。 f i g u r e l 1 s i m p l i f i e dd i a g r a m so f c ee q u i p m e n t 1 2 2c e 的分离模式【3 】 c e 的分离模式非常灵活，根据实际样品不同的性质，选择不同的分离模式。其中主 要分为以下几种分离模式： ( 1 ) 毛细管区带电泳( c a p i l l a r yz o n ee l e c t r o p h o r e s i s ，c z e ) 又称毛细管自由电泳， 是c e 中最基本、应用最普遍的一种模式。 ( 2 ) 胶束电动毛细管色谱( m i c e l l a re l e c t r o k i n e t i cc a p i l l a r yc h r o m a t o g r a p h y ，m e c c ) 是把一些离子型表面活性剂( 如十二烷基硫酸钠s d s ) 加到缓冲液中，当其浓度超过临界 浓度后就形成有一疏水内核、外部带负电的胶束。m e c c 使c e 能用于中性物质的分离， 拓宽了c e 的应用范围，是对c e 有极大的贡献。 ( 3 ) 毛细管凝胶电泳( c a p i l l a r yg e le l e c t r o p h o r e s i s ，c g e ) 是将板上的凝胶移到毛细 管中作支持物进行的电泳。凝胶具有多孔性，起类似分子筛的作用，溶质按分子大小逐 一分离。 ( 4 ) 毛细管等电聚焦( c a p i l l a r yi s o e l e c t r i cf o c u s i n g ，c i e f ) 将普通等电聚焦电泳转移 到毛细管内进行。通过管壁涂层使电渗流减到最小，以防蛋白质吸附及破坏稳定的聚焦 区带，再将样品与两性电解质混合进样，两端贮瓶分别为酸和碱。加高压( 6 一- - 8 k v ) 3 5 m i n 2 东北师范大学硕士学位论文 后，毛细管内部建立p h 梯度，蛋白质在毛细管中向各自等电点聚焦，形成明显的区带。 最后改变检测器末端贮瓶内的p h 值，使聚焦的蛋白质依次通过检测器而得以确认。 、( 5 ) 毛细管等速电泳( c a p i l l a r yi s o t a c h o r p h o r e s i s ，c i t p ) 是一种较早的模式，采 用先导电解质和后继电解质，使溶质按其电泳淌度不同得以分离，常用于分离离子型物 质，目前应用不多。 ( 6 ) 毛细管电色谱( c a p i l l a r ye l e c t r o c h r o m a t o g r a p h y ，c e c ) 是将h p l c c p 众多的固 定相微粒填充到毛细管中，以样品与固定相之间的相互作用为分离机制，以电渗流为流 动相驱动力的色谱过程，虽柱效有所下降，但增加了选择性。 ( 7 ) 毛细管筛分电泳( c a p i l l a r ys i e v i n ge l e e t r o p h o r e s i s ，c s e ) 在毛细管内填充了多 聚物作为分离介质，如甲基纤维素对分子的泳动起着阻碍作用。其作用机制类似平板电 泳凝胶的筛网作用，大分子较小分子所受的阻碍大，泳动速度减慢。 ( 8 ) 非水毛细管电泳( n o n a q u e o u sc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ，n a c e ) 1 9 8 4 年w a l b r o e h l 和j o r g e n s o n 首次将非水介质引入c e 【4 】。它是利用纯有机溶剂( 甲酰胺及其衍生物、乙腈、 醋酸、甲醇、二甲亚砜等) 或混合试剂替代水介质来完成样品的电泳分析。n a c e 主要 用于分析不易溶于水而易溶于有机溶剂的物质，分离在水溶剂中淌度十分相似的物质， 研究在水中难以发生的反应等。 ( 9 ) 毛细管阵列电泳( c a p i l l a r ya r r a ye l e c t r o p h o r e s i s ，c a e ) 由美国加州大学伯克 利分校i 拘m a t h i e s 研究小组首先提出来的【5 】，它是在常规c e 原理和技术的基础上，结合微 型制造技术设计出来的一种检测技术由微通道或反应池等构成通道型微阵列芯片，通过 加载生物样品，进行一种或连续多种反应，达到快速高效分析的目的，是一种新型的生 物芯片。 ( 1 0 ) 免疫亲和毛细管电泳【6 】( i m m u n o a f f m i t yc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ，a c e ) 是把 蛋白质( 抗原或抗体) 事先固定在毛细管柱内，利用抗原一抗体的特异性识别反应。c e 的高效、快速分离能力，l i f 的高灵敏度来分离检测样品混合物中能与固定化蛋白质特异 结合的组分。 无论是哪种分离模式，毛细管电泳的分离原理基本是相同的，目前比较常用的分离 模式是c z e 、m e c c 。近几年，有关c e c 模式的研究也在不断的进展，已受到越来越广 泛的关注。 1 2 3 检测方法 c e 对检测器灵敏度要求相当高，故检测器是c e 中的关键问题。其中主要检测器有： ( 1 ) 紫外检测器( u v ) ； ( 2 ) 激光诱导荧光检测( l 环) ； ( 3 ) c e m s 联用； ( 4 ) 电化学检测器( e c ) ； ( 5 ) 化学发光检测器( c l ) 。 东北师范大学硕士学位论文 随着研究进一步深入，实际应用中还有其它检测器，如激光热透镜检测、激光光热 检测和激光拉曼检测等。 紫外检测器( u v ) 是c e 常用的检测器。检测器是c e 中具有挑战性的研究工作。 c e m s 联用是最有应用价值的检测器，但价格昂贵，不易推广。发展新型检测器，提高 u v 等检测器灵敏度，以及发展c e 和其它分离方法、检测方法联用是c e 研究重点之一。 1 2 4 特点 ( 1 ) 优点： 所需样品量少，仪器简单，操作简便； 分析速度快，分离效率高，分辨率高，灵敏度高； 操作模式多，开发分析方法容易； 分析成本低，样品消耗少； 操作自动化程度高，可用计算机控制实现软件分析，应用范围极广。 ( 2 ) 缺点： 由于进样量少，制备能力差； 由于毛细管电泳采用内径极小，而只能进行微量分析，灵敏度降低； 不能对多个样品进行平行处理，而只能对单个样品进行多次进样分析，缺乏平行 对照，影响分离的重复性。 1 3 毛细管电泳的应用 ( 1 ) 手性对映体分离【7 】 手性对映体分离鉴定有巨大的应用价值，已经成为医药领域内一个重要课题。常用 的手性选择剂有环糊精及其衍生物、冠醚类、大环抗生素、粘多糖、胆酸盐、金属络合 物、手性混合胶束等等。我国在环糊精及其衍生物在手性分离中的应用研究很深入，分 离了多种手性药物，达到了国际先进水平。环糊精分子为锥形筒状，筒腔内部呈相对疏 水性，可容纳较低极性的分子或集团，筒口则由于环糊精的羟基呈顺时针方向排列，可 与客体的极性部分呈氢键缔合，客体与主体形成所谓包埋络合物，因而具有良好的手性 识别特征。 ( 2 ) 药物分析和临床检验【刀 随着c e 技术进入成熟阶段并日益普及，利用其优点来解决中药有效成分或特征性 成分进行定量分析是发展趋势。c e 已经用于化学药物，生化药物，抗生素药物，中草 药，生物制品等成分分析、相关杂质检测、纯度检查、无机离子含量测定及定性鉴别等 方面。c e 成为法定方法，最可能的突破点是手性药物的鉴别；基因工程药物的纯度检 测和分子量测定。c e 在临床化学中除进行临床分子生物学测定外，也广泛用于疾病临 床诊断、临床蛋白分析、临床药物监测和药物代谢研究等等。药物代谢研究对c e 是一 个挑战，虽有不少成功报道，但在提高灵敏度、解决蛋白吸附等方面仍待改进。 4 东北师范大学硕士学位论文 ( 3 ) 环境监测和离子分析【8 】 c e 技术出现得比较晚，在环境分析和监测中的应用是近几年来才起步的，最初的 研究工作大多数局限于方法的研究和改进。但近年来c e 已经越来越多地用于环境中实 际样品的分离或分析工作，特别适用于环境保护、大气、水源等污染的痕量检测。水源 是人类生存最重要的环境资源，对水质的分析是c e 最广泛的应用领域之一。对环境水 源水样品中的苯系物( 包括多环芳烃、多氯联苯) ，酚类污染物，农药，有害金属化合 物和一些无机化合物等进行定性分离。c e c 分离监测土壤等环境中多环芳烃( p a h s ) ， y a h 等人【9 】运用反相填充柱系统地研究了溶剂c e c 梯度技术，在1 0 r a i n 内成功地分离了 1 6 种p a h s 。但是c e 在环境检测方面的应用存在一定的问题，还有待进一步的深入研 究。 ( 4 ) 肽和蛋白分析 c e 在生物大分子蛋白和肽的应用可以概括为两部分：一是结构的表征；二是研究 相互作用。蛋白质一级结构的表征包括纯度、含量、等电点、肽谱、氨基酸序列和n 的 一端序列的测定等。c e 广泛用于最有效纯度的检测手段，可以检测出肽链上多个氨基 酸的差异。 c e 较重要的应用还有糖的分析，单细胞，单分子的检测，侦探学中毒物和滥用药 物以及枪击残余物及炸药分析，毛细管电泳芯片等方面。目前有关糖的分析最成功的是 用a p t s 作糖的衍生化试剂，标记后用l i f 可进行单糖和多糖的测定。 随着毛细管电泳技术的不断完善和发展，目前利用毛细管电色谱实现手性物质的拆 分仍是研究的热点和前沿。 1 4c e 手性拆分的原理 在自然界中，有很多物质都是手性物质，如一些药物和大多数氨基酸等，并且这些 物质经常是以两种或更多种对映体的外消旋体同时存在，从生物活性的观点来看，是几 种完全不同的物质。一般而言，只有其中一种对映体具有所需要的生物活性，而另一( 几) 种则是多余的，并影响有效物质活性的发挥，甚至起到相反的副作用。人们认识到药物 在生物体内的一系列活动与其结构有密切关系，不同对映体所表现的药理活性、代谢过 程和药物动力学情况存在着很大的差异【lo 】，甚至会产生不良反应【1 1 】。据统计，目前市售 的1 8 5 0 种药物中，除一些激素、抗生素等天然药物主要以单一异构体存在外，其它的合 成药物则多数是以消旋体供药的【1 2 1 ，这显然会给疾病的治疗或其他方面的应用带来一些 严重的问题。因此，如何进行手性拆分并提供单一的手性药物，从而控制药品生产的质 量，已成为人们关注的重大课题。 当前用于手性化合物拆分的其方法主要分为两大类：一类是非色谱法，包括结晶、 萃取、酶促法；另一类为色谱法，包括薄层色谱、气相色谱、高效液相色谱、超临界色 谱、毛细管电泳【1 3 1 。近年来利用高效毛细管电泳技术【体1 5 】对光学异构体的分离日益受到 人们的重视，尤其是以环糊精及其衍生物为手性选择剂的c e 就因其高效、快速、低耗、 东北师范大学硕士学位论文 应用范围广、方法灵活等优点，而得到迅速发展，并在此基础上，将毛细管电泳法与色 谱相结合而发展成为另一种分离方法一毛细管胶束电动色谱分离法。毛细管电色谱体系 是在毛细管壁上键合涂渍基内填充固定相进行电泳的方式，目的是希望将h p l c 发展的 各种固定相能用到c e 中去，但又保持h p l c 的固有特点，这种方式在对映体分离中也取 得了成功。 c e 进行手性拆分不是基于电泳分离的原理，而是依靠色谱原理，构建手性分离的环 境，使对映异构体与手性选择剂相互作用。它兼有高压电泳的高速、高分辨率及h p l c 的高柱效和高选择性【1 6 】等优点，目前已经广泛运用于手性药物的研究领域。 毛细管电泳手性拆分有两种基本策略，一是手性消除，二是构建手性分离环境。 1 4 1 手性消除【1 7 】 手性消除一般都采用柱前反应方法。即用光学纯的手性试剂，将对映体衍生成非对 映体复合物，这些非对映体复合物具有不同的理化性质，便能使用常规的色谱技术分离。 1 9 8 9 年l e o p o l d 等利用m a r f e y 氏试剂与氨基酸对映异构体反应，而后在含有0 2 m o l l 十 二烷基硫酸钠( s d s ) 的硼酸盐( p h 8 5 ) 缓冲体系下进行胶束电动色谱( m e k c ) ，成功分离 了目标样品。他们还考察了高、低p h 下不同自由溶液分离模式的分离情况，发现高p h 分离的峰形比较对称【1 8 1 。l u r i e 等还研究了2 ，3 ，4 ，6 四( o 乙酰) p d 吡喃葡萄糖基异 硫氰酸盐反应产物的m e k c 分离，发现高浓度s d s 能产生好的分离效果，但代价是延长 分离时削例。 消除法的优点是可将手性消除和检测衍生反应结合考虑，缺点是手性消除反应需要 昂贵的手性反应试剂，并且试剂难以寻找；有时反应条件复杂，不易控制，而且产物的 手性可能不能恢复；大的衍生试剂会缩小样品物理化学性质的差异，造成分离困难；另 外，消除反应并非总能进行，许多样品也可能承受不了所需的反应条件。所以这种方法 使用的不多。 1 4 2 构建手性环境【0 7 】 在非手性环境中，对映体的物理化学性质( 如熔点、沸点、折射率、蒸气压、溶解 度、红外、核磁谱和质谱等) 大都相同，这就造成对映体分离的困难，这就需要我们构 建手性环境。 手性环境可以通过三种方法来构建，即使用手性添加剂、使用手性填充毛细管或使 用手性涂层毛细管。其中手性填充或手性涂层毛细管需要特别的制作技术，一般较少采 用。添加剂法只需要向电泳缓冲液中加入合适的手性试剂，与对映体溶质通过静电引力 和氢键等非共价键结合方式，形成可逆的稳定性不同的非对映体配合物，在非手性分离 器中经过一定的分离条件优化实现对映异构体的分离。因此手性添加剂必须能提供有效 的基团和位置以便与溶质对映体形成非对映的配合物，也必须具有合适的结构以改善分 离性能和提高其立体选择性。 手性添加剂法是一种直接拆分法，其优点在于不需要化学衍生，也不需要特殊的手 6 东北师范大学硕士学位论文 性固定相。这种方法不触及样品本身，具有简单、快速、高效、发展空间大等特点，已 被普遍采用并迅速发展。 适合于c e 的手性添加剂有许多，将在下面介绍。不同的分离模式需要构建不同的手 性环境，从而使对映异构体的性质产生差异，并由此分离对映异构体，这是c e 手性分离 的主要方法。 1 5 手性添加剂 对映异构体具有相同的分子量和电荷数，它们的电泳迁移速率也相同，采用普通的 电泳缓冲溶液无法实现分离。一般通过在电解质溶液中添加手性选择剂，提供一定的手 性环境，然后根据对映体与选择剂之间相互作用的不同使对映异构体的迁移速度产生差 异达到手性分离。在构建手性环境，实现对映体的分离的时候，常用的手性添加剂有环 糊精( c d ) 、大环抗生素、粘多糖、冠醚、手性表面活性剂、蛋白质、金属螯合物等。 在这些种类繁多的手性添加剂中最常用的，也是研究最多的是环糊精。因为用环糊精作 为手性添加剂分离对映体，简便易行，并且环糊精种类很多，应用范围广泛，所需控制 的主要实验条件为所用环糊精的种类及浓度，缓冲溶液的组成及p h 值及外加试剂( 如甲 醇或乙腈) 的作用等。本文章重点介绍一下环糊精在手性分离中的应用。 1 5 1 环糊精的简介 环糊精的基础研究早在3 0 年代就开始了，并证实了环糊精能形成包合物，但直n - 十世纪五十年代环糊精包合物的研究才趋于成熟，并且发现环糊精在一些反应中具有催 化作用f 2 0 1 。环糊精是h p c e q b 使用最多的一类手性添加剂【2 1 - 2 6 ，它是由多个吡喃葡萄糖 单元以1 ，4 糖苷键首尾相连形成的环状低聚糖。用于手性拆分的天然环糊精有0 【- 、p - 和y c d ，它们分别含有6 、7 和8 个葡萄糖单元及3 0 、3 5 和4 0 个手性中心，具有桶形结构， 腔内疏水，腔外亲水，内腔平均直径分别为0 5 ，o 6 3 和0 8 0 r i m 。其中p c d 的产率最高， 应用也最广泛。f i g u r e l 2 即为p c d 的结构图【2 7 1 。f l - c d 分子的立体结构呈网筒形，一端 大，一端小。小端口处是由c 6 的上的7 个伯羟基组成，大端口处是由c 2 ，c 3 上的1 4 个仲 羟基组成，因此环糊精的外壁具有很强的亲水性。b c d 的内腔是由c 3 和c 5 上的氢原子与 c 4 上的氧原子组成，由于于c 3 和c 5 上的氢原子对c 4 上的氧原子的覆盖作用，使得环糊精 的内腔具有强烈的疏水性。因此，可以利用其疏水空腔包合客体分子( 被包合物质) ，形 成包合物 2 8 1 。 东北师范大学硕士学位论文 o h f i g u r e l - 2 p l a n a rs 仃u c t u r ea n ds t e r e o s c o p i cs 协l c t u r eo fp - c d 1 5 2 环糊精对对映体的识别机理 不同的环糊精具有不同直径的疏水内腔和不同类的亲水性外缘，可以和不同的物质 形成不同的包合物。包合作用主要是一种物理过程，它是指一种分子被包嵌于另一种分 子的孔穴结构中，从而形成一类独特形式的结合物 2 9 】。此种结合物主要由主体分子和客 体分子( 被包合物质) 两部分组成，经包合后可以改变客体分子的某些理化性能，如溶解 度、稳定性等。环糊精与客体分子之间存在范得华引力、库仑力、氢键和疏水力，包合 过程的主要推动力是疏水力。包合物的形成主要取决于环糊精与客体分子的立体结构和 两者作用力的大小。环糊精对手性物质的识别实际上就是可以与手性物质的对映形成不 同性质的包合物。 一般认为手性识别作用包括以下几剧刈： ( 1 ) 客体分子的大小要与环糊精的内径相匹配，这样客体分子才有可能进入到环糊 精的空腔中主体。 ( 2 ) 某些客体分子与c d 羟基之间的氢键作用，疏水客体与c d 之间的非极一非极作用 力，客体与主体之间的范德华力。 ( 3 ) 端口羟基的衍生化不仅可以改变c d 的亲水性，而且对c d 空腔的形状也有很大 的影响。一些衍生化c d 的外缘取代基带有电荷，能与离子化的对映体产生静电相互作 用。 上面几种作用可以使c d 与客体之间产生三点( 或多点) 相互作用，形成具有不同 稳定常数的包合物，从而实现手性分离。并且c d 结构及性质的改变更加扩大y c d 的应 用范围。 1 5 3 环糊精在手性分离中的应用 环糊精的种类可以分为天然环糊精和环糊精衍生物。所谓的环糊精衍生物是指在保 8 东北师范大学硕士学位论文 持环糊精大环基本骨架不变情况下引入修饰基团，得到具有不同性质或功能的产物。到 目前为止已经有大量的c d 及其衍生物用于c e 手性分离，其中主要有两种方式：一是把 手性选择试剂c d 直接添加到缓冲溶液里，作为准固定相，c d 与对映体物质相互作用， 产生稳定性不同的两种包合物而达到分离；二是把合成的环糊精材料作为固定相或将其 涂覆固定在毛细管壁上，对物质进行手性分离。 天然c d 中i b - c d 因为价廉易得，其空腔与大部分对映体体积相匹配而使b - c d 得 到较多应用。f a n a l i 最早开始用c d 为添加剂分离生物碱【3 1 1 。后来证明，在c d 环的某 一特定的位置引入如氨基、磷酸基、磺酸基等具有离子化特性的功能团，产生的c d 衍 生物可用于分离多种不同类型的对映异构体，如丹酰化氨基酸【3 卜蚓、肾上腺素及它手性 药物【3 5 卅等。这些c d 衍生物不但能溶于水且在一定p h 条件下以离子形态稳定的存在， 它们在普通的c z e 条件下，既可以分离带有电荷的手性化合物，也可分离非离子性的 化合物【4 7 5 1 】。因为衍生化改变了c d 的水溶性、立体选择性【加】和荷电性质等，所以c d 的衍生物扩大了c d 的应用范围。 随着c d 应用研究的不断深入，人们又发现可以把各种功能化的环糊精与纳米材料 结合在在一起，利用毛细管电泳技术实现对物质的手性分离。 1 6 纳米材料在毛细管电泳应用中的研究 由于纳米材料的特殊性，如独特的稳定性、小尺寸效应、表面效应和量子效应等特 点，使得纳米材料的应用范围日益广泛。将纳米颗粒应用于毛细管电泳实现手性物质的 的分离已经有很多了报导。二氧化硅和聚合物纳米颗粒在毛细管修饰中已经被用到【5 2 5 4 | 。 l u o n g 等【5 5 】用碳纳米修饰的毛细管电泳，在1 0 m i n 内分离了7 种苯胺类衍生物。 随着纳米材料应用研究的进展，特别是纳米金的应用在分离科学中引起了广泛的注 意，有人报导将烷基修饰的金纳米颗粒用在开管毛细管电色谱中【5 6 - 5 7 。g w e n 等【5 8 用十 二烷基保护的金纳米颗粒作为气相色谱的固定相。由于含巯基( s h ) 或氨基( n h 2 ) 的化合 物可以和金纳米自动键合，扩大纳米金的应用范围。 由于巯基环糊精修饰的纳米金具有很好的水溶性及稳定性，且在水中有很宽的浓度 范围；而且其表面的超分子结构，还可以用作多部位主体对有机小分子客体进行包合， 其特殊的分子识别能力，在手性分离中具有很好的应用前景。随着研究的不断深入，并 且结合毛细管电泳的高效分离能力，环糊精修饰的纳米金在分离科学中的应用将日益广 泛。 本文则采用巯基环糊精修饰的纳米金( p s h c d m o d i f i e dg n p s ) 为手性分离的 准固定相，采用毛细管电色谱( c e c ) 实现了几种典型氨基酸和药物的手性分离。 1 7 展望c e 手性分离技术 近年来，高效手性分离技术的发展，导致与有机立体化学相关的手性药物学、分子 生物学、材料化学、地球化学、天然有机化学等前沿领域取得许多突破性的发展和发现。 9 东北师范大学硕士学位论文 人们根据欲分离化合物的结构特点有目的的合成或选择相应手性添加剂，己成为当今色 谱领域研究的热点。c e 手性分离将会在更多手性选择剂，分离机理等方面开展更多研究。 在新的世纪中，c