（微生物学专业论文）酶法制备马铃薯淀粉磷酸寡糖及相关酶系的研究.pdf

摘要 磷酸寡糖( p h o s p h o r y lo l i g o s a c c h a r i d e s ，p o s ) 是指麦芽低聚糖中的某些葡萄糖残基 与磷酸根共价连接的一种新型的功能性低聚糖。马铃薯磷酸寡糖是从马铃薯淀粉酶解 液中得到的含有磷酸基团的麦芽低聚糖。除了具有一般低聚糖的生理功能外，还具有 促进钙，铁等矿物质吸收的功能。 本文阐述了以马铃薯淀粉水解液为原料，采用酶法制备磷酸寡糖。并且比较了马 铃薯淀粉水解法，马铃薯淀粉磷酸酯化水解法，玉米淀粉制备麦芽低聚糖酯化法等几 种不同的制备方法。其中玉米淀粉制备麦芽低聚糖酯化法所得到的磷酸寡糖得率为最 大( 3 9 8 9 ) 。 本文以纤维素阴离子交换树脂为柱材料，分离出了一组磷酸寡糖，对其组分进行 了研究，发现脱去磷酸根的p o s 主要是由麦芽三糖，麦芽四糖，麦芽五糖，麦芽六 糖等组成。计算出p 0 1 与p 0 2 部分的磷酸根聚合度分别为3 9 8 和5 7 8 。 除此之外，由于水解马铃薯淀粉存在所用的耐高温0 【淀粉酶、真菌q 淀粉酶、 普鲁兰酶所需的最适p h 、温度差异大，以及上述三种酶需由三种菌株产生、生产成 本较高等问题，我们对一组能同时产生酸性a 淀粉酶、糖化酶、异淀粉酶的黑曲霉菌 种进行了单因子试验。筛选到一株产酸性a 淀粉酶较佳的菌种p z 3 0 1 。并对其液态、 固态发酵进行了条件研究，确定最佳产酶因素，其中液态发酵的耐酸性0 【淀粉酶最高 酶活为3 8 2 9i u m l ，糖化酶活为5 7 5 8i u m l ，异淀粉酶活为4 7 6u m l 。固态发酵 的耐酸性a 淀粉酶最高酶活为7 7 9 9u g 干曲，糖化酶活为1 2 1 5 8i u g 干曲，异淀 粉酶活为3 5 7 u g 干曲。 采用上述黑曲霉产生的复合酶系发酵所得酶液，进行马铃薯淀粉水解，水解不存 在p h 、温度调节和多个产酶菌种等问题，所需反应时问相对传统制备磷酸寡糖工艺 减少。在加入实验室自制酶液5 0m l g 时，作用5h ，液化较完全。 磷酸寡糖是一组含有磷酸根的麦芽低聚糖，其分子量介于6 0 0 15 0 0 之间，因此 使用纳滤设备可以进行分离。实验室用制备的马铃薯淀粉酶解液进行纳滤，此种方法 较树脂有安全，量大的优点。淀粉水解液通过2 0 0 0 道尔顿分子量膜截留与5 0 0 道尔 顿分子量进行截留，一次浓缩，最终得到含有磷酸寡糖的麦芽低聚糖，其中麦芽低聚 糖中磷酸寡糖的含量约占1 1 0 。寡糖的回收率为8 9 2 3 。 最后对纳滤产物进行核磁共振氢谱的检测，证明纳滤产物中含有麦芽三糖，麦 芽四糖，麦芽五糖，麦芽六糖和麦芽七糖等寡糖组分。 关键词：马铃薯淀粉；磷酸寡糖；黑曲霉复合酶系；纳滤；核磁共振氢谱 ab s t r a c t p h o s p h o r y lo l i g o s a c c h a r i d ei san e w k i n do ff u n c t i o n a lm a l to l i g o s a c c h a r i d e ，w h o s e g l u c o s y lr e s i d u e sl i n k e st op h o s p h a t ec o v a l e n t l y p o t a t op h o s p h o r y lo l i g o s a c c h a f i d ei s a t y p eo fp h o s p h a t em a l t o o l i g o s a c c h a r i d e s i tc a np r o m o t et h ea b s o r p t i o n o fm i n e r a l s u b s t a n c e ss u c ha sc a l c i u ma n di r o ne t c ，b e s i d e st h eg e n e r a lf u n c t i o n so fo l i g o s a c c h a n d e s p r e p a r a t i o no fp h o s p h o r y lo l i g o s a c c h a r i d e sb yh y d r o l y z i n gp o t a t o s t a r c ha sr a w m a t e r i a lw a ss t u d i e d t h ed i f f e r e n c e sa m o n gp o t a t os t a r c hh y d r o l y s i sm e t h o d ，p o t a t o s t a r c hh y d r o l y s i sp h o s p h a t ee s t e r i f i c a t i o nh y d r o l y s i sm e t h o da n dm a i z es t a r c hp r e p a r e m a l t o o l i g o s a c c h a r i d e se s t e r i f i c a t i o nm e t h o dw e r ec o m p a r e d t h ey i e l do fp o sb ym a i z e s t a r c hp r e p a r e dm a l t o o l i g o s a c c h a d d e se s t e r i f i c a t i o nm e t h o di st h eh i g h e s t ( t h ey i e l di s 3 9 8 9 ) ag r o u po fp o sa r ei s o l a t e db yc e l l u l o s en e g a t i v ei o ne x c h a n g er e s i n ，a n dt h e i r c o m p o n e n t s a r e s t u d i e d d e p h o s p h o r y l a t e d p o sa r e c o m p o s e d o fm a l t o t r i o s e ， m a l t o t e t r a o s e ，m a l t o p e n t a o s e ，m a l t o h e x a o s ea n dm a l t o h e p t a o s e p h o s p h a t ep o l y m e r i z a t i o n d e g r e eo ff r a c t i o np o 1a n dp 0 2i s3 9 8a n d5 7 8r e s p e c t i v e l y b e c a u s eo ft h ed i f f e r e n c eo fo p t i m a lp ha n dt e m p e r a t u r ea m o n gt h ee n z y m e su s e df o r h y d r o l y z i n gp o t a t o s t a r c hs u c ha st h e r m o s t a b l eq a m y l a s e ，f u n g a l0 【a m y l a s e a n d p u l l u l a n a s e t h ep r o d u c t i o no f t h o s et h r e ee n z y m e sn e e d st h r e es t r a i n so fd i f f e r e n tm i c r o b s a n dt h eh i g hc o s t ，s e v e r a ls t r a i n so fa s p e r g i l l u sn i g e rw h i c hc a np r o d u c ea c i d t o l e r a n t 0 【a m y l a s e ，g l u c o a m y l a s ea n di s o a m y l a s es i m u l t a n e o u s l yw e r es c r e e n e db ys i n g l e f a c t o r e x p e r i m e n t sa n do b t a i n e das t r a i no fn a s pp z 3 0 1w i t ha c i d t o l e r a n tc t - a m y l a s e t h e c o n d i t i o nf o rl i q u i da n ds o l i df e r m e n t a t i o nw a so p t i m i z e d t h eh i g h e s te n z y m ea c t i v i t yo f a c i d t o l e r a n ta a m y l a s e g l u c o a m y l a s ea n di s o a m y l a s eo fs o l i df e r m e n t a t i o na r e7 7 9 9i u g ， 121 5 8i u ga n d3 5 7u gr e s p e c t i v e l y a n dt h ee n z y m ea c t i v i t yo fa c i d - t o l e r a n t0 【一a m y l a s e ， g l u c o a m y l a s e ，a n di s o a m y l a s eo fl i q u i df e r m e n t a t i o ni s3 8 3i u m l a c t i v i t yi s5 7 5 8i u m l a c t i v i t yi s4 7 6i u m l w h e nt h ep o t a t os t a r c hi sh y d r o l y z e db ye n z y m es o l u t i o np r o d u c e db yp z 3 01 ，i ti sn o n e e do fm u l t i p l es t r a i n so fm i c r o b ea n dn on e e do fp ha n dt e m p e r a t u r er e g u l a t i o n ，i tc a n s i m u l t a n e o u s l yc o m p l e t el i q u e f i e d ，s a c c h a r i f i e d a n dd e b r a n c h e di no n er e a c t i o ns y s t e m a l s ot h er e a c t i o nt i m ei sd e c r e a s e dr e l a t e dt ot r a d i t i o n a lp r e p a r a t i o n p o sa r eag r o u po fm a l t o o l i g o s a c c h r i d e sw i t hp h o s p h a t er a d i c a l s i t sm o l e c u l a r w e i g h ti sb e t w e e n6 0 0d a l t o n sa n d15 0 0d a l t o n s i tc a nb ei s o l a t e db yn a n of i l t e re q u i p m e n t w h i c hi ss a f e a n dc a nt r e a tl a r g es c a l eo fs a m p l e s t a r c hh y d r o l y s a t ei se n t r a p e da n d c o n c e n t r a t e db y2 0 0 0d a l t o na n d5 0 0d a l t o n f i l t r a t i o n m e m b r a n e ， a n dt h e m a l t o o l i g o s a c c h a r i d e sw i t h1 1 0p o si so b t a i n e d t h e r ea r em a l t o t r i o s e ，m a l t o t e t r a o s e ， m a l t o p e n t a o s e ，m a l t o h e x a o s ea n dm a l t o h e p t a o s ei nt h en a n o f i l t r a t i o np r o d u c tb yn m r h y d r o g e ns p e c t r u ma s s a y k e yw o r d s ：p o t a t os t a r c h ；p h o s p h o r y lo l i g o s a c c h a r i d e s ；a s p e r g i l l u sn i g e rc o m p l e x e n z y m e s ；a c i d - t o l e r a n ta - a m y l a s e ；n f ( n a n o f i l t r a t i o n ) ；n m rh y d r o g e ns p e c t r u m 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得安徽农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名：回盘敏 时间：加1 年月加日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解安徽农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意安徽农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名：旦盛熟 第一导师签名：蚤数功 时间：加7 年阳r 时间：印参7 年6 月i 口同 1 文献综述 1 1 低聚糖研究现状及作用 低聚糖又称寡糖，是由2 1 0 个单糖通过糖苷键连接形成的低度聚合糖。一般分 为两类，一类是如麦芽糖，蔗糖等的普通低聚糖；另一类是指具有促进双歧杆菌增值， 改善人和动物肠道环境，抑制体内毒素，预防便秘，增强机体免疫特性，抗肿瘤等特 殊生理功能中的一项或几项功能的低聚糖1 ，2 1 。功能性低聚糖是近年来研究的热点之 一。近年来主要研究的低聚糖功能见表1 1 。 在国际研究领域，日本为低聚糖的研发大国，在同本市场有已有低聚果糖，大 豆低聚糖，低聚木糖等数十种代表性的低聚糖商品。近年来，日本又开发出多种功能 性更好的低聚糖。我国仅开发出低聚果糖，异麦芽低聚糖，低聚木糖，环状糊精等少 数几个品种。 表1 - 1 主要低聚糖的作用 ! 堡q ! ：! ! ! 里坐i 2 旦2 1 巴型2 12 1 i 9 2 1 兰业坚i 垒! 低聚糖名称主要用途 麦芽低聚糖 异麦芽低聚糖 环状糊精 偶联糖、潘糖 海藻糖 低聚果糖 蔗糖低聚糖 低聚半乳糖 壳质低聚糖 人豆低聚糖 异构乳糖 低聚术糖 水苏糖 磷酸寡糖 低聚龙脾糖 甘露低聚糖 卡拉胶寡糖 低聚帕拉会糖 滋补营养，抗菌 防龋齿，促进双歧杆菌增值，1 9 8 5 年进入市场 低热值，防胆周醇蓄积 防龋齿，味质良好，具保湿性，日本于1 9 7 9 年上市 防龋齿，优质甜味，抗肿瘤 促进双歧杆菌坶么，龋齿，胰岛素小依赖性，血栓等改善，1 9 8 3 年进入市场 防龋齿，促进双蚓菌增殖 防龋齿促进穆干菌增殖，1 9 8 8 年进入市场 防龋齿，促主旷i 杆菌增殖，有多种壳质低聚糖制成的k a n i s t a r 保健品红f i 本1 - 市 促进双歧杆菌增殖，1 9 8 8 年进入市场 促进双歧杆菌增殖作用特征，慢性便秘的顶防和治疗，1 9 8 1 年进入市场 只需摄入少量就显现双歧杆菌增殖，水分活性调节，对睃、热稳定件强 显著促进双歧杆菌增殖。有“超强双歧凼子”称号 钙。铁等吸收促进剂 提神，双叉杆菌和乳酸杆菌增值 保护肠道，提高免疫力，吸附毒素 抗肿瘤活性，对放射线性损伤的保护作用，抗氧化 难消化性糖，具双歧杆菌增值作用和难腐蚀性，1 9 8 9 年i ：市 1 2 磷酸寡糖的研究现状 磷酸寡糖( p o s ) 是最新发展起来的一类功能性低聚糖。 1 2 1 早期对马铃薯淀粉酶解、磷含量和定位检测的研究 据美国学者h e i s l e re g 等( 1 9 5 2 ) 报导【3 】采用工业用淀粉酶，在自然p h ，5 5 条件下水解马铃薯淀粉，其主要产物为麦芽糖，同时产生变化量的寡糖。这种工业用 酶含有强力的a 淀粉酶，而d 淀粉酶活力较低，产物的组分随酶的浓度而变化。 同本h i z u k u r is 等( 1 9 7 0 ) 4 j 则利用德氏根霉( r h i z o p u sd e l e m a r ) 的葡萄糖淀粉酶 水解马铃薯淀粉制备磷酸寡糖，通过s e p h a d e x 凝胶层析，获得平均聚合度为2 7 的 分部，每一部分含等摩尔的磷和糖。t a b a t as 和h i z u k u r is ( 1 9 7 1 ) 5 j 又将马铃薯淀粉 的旺淀粉酶界限磷酸糊精，通过部分酸解和离子交换色谱，分离出三种糖的磷酸酯， 即4 o ( 0 【d6 磷酸葡糖基) d 葡萄糖，葡糖3 磷酸和葡糖6 磷酸。根据g 3 p 和 g 6 p 的定量，推断在马铃薯淀粉中酯化分布是3 8 在葡萄糖残基的c 3 位，6 1 在葡萄糖残基的c 6 位。 1 9 8 1 年h i z u k u r i 等【6 】继续采用假单胞杆菌的异淀粉酶，气杆菌的普鲁兰酶和甘 薯p 淀粉酶分别或联合作用于马铃薯淀粉，对淀粉的结构进行研究。1 9 8 2t a k e d a 和 h i z u k u r i 【7 】又进一步报导，对马铃薯支链淀粉中的磷酸基团的定位，支链淀粉被酶解 后的产物进行色谱分离，结果显示3 1 7 个葡萄糖残基中含有1 个磷酸基团，由此可 以估计马铃薯淀粉分子中平均每2 0 0 - 4 0 0 个葡萄糖基中含有1 个磷酸基团。 关于糖料作物淀粉中无机磷的含量，据食品科学手册记载1 8 j ，以马铃薯淀的 含量为最高。具体结果见下表1 2 。 表1 - 2 主要糖料作物淀粉的灰分和磷分布 ! ! ! ! ：2 i ：! ：i ! 坚! 1 2 翌2 1 箜! 竺! p 1 2 ：p 1 2 翌：! ! 竺型2 11 1 量竺p ! 竺! ：! 呈：! ! 原料马铃薯小麦玉米人米术薯 ”薯 l i ms - t 等( 1 9 9 4 ) 【9 】采用3 1 p - n m r 分析几种主要作物的有机磷含量及其特征， 结果也以马铃薯淀粉的含量最高，见表1 3 。所有淀粉的磷酸单酯主要位于葡萄糖残 基的6 位，少数脱水葡萄糖单位在3 位。 表1 - 3 几种主要作物淀粉的磷含量及j e 存在形式 ! 些! ：j 1 2 ：吐2 坐! 1 2 里! ! 坐竺12 1 1 1 1 1 塑! 12 1 ：! ：呈! ! 盘2 ：垡! ! 淀粉类型磷含量存确i 形式 马铃署0089磷睃甲凸 谷物淀粉0 0 2 0 0 6 磷脂 高直链淀粉002磷酸单酯：磷f t 旨= 1 ：4 ( 含量7 0 的玉米淀粉) e 他蜡质淀粉 0 0 1 磷睃甲酯 豆类淀粉 0 0 1 磷酸甲酯 叁盔塑：窭星鎏塑! ：i ：i 仑巴： 1 2 2 磷酸寡糖及其钙盐、作用 在上述一些学者研究的基础上，日本江崎格力高株式会社生化实验室的学者们对 马铃薯淀粉的酶解、磷酸寡糖的分离提取、结构和功能进行了系统的研究。k a m a s a k a 纠旧】于1 9 9 5 年提出研究报告，他们以细菌液化型q 淀粉酶( b l a ) ，根霉葡萄糖淀粉 酶( g a ) 和产气杆菌普鲁兰酶( 即脱支酶) 单独或联合水解马铃薯淀粉，并使用离子交换 色谱成功分离出一组磷酸寡糖。从马铃薯淀粉中提取出来的磷酸寡糖，通过离子交换 色谱时，被分成了两个部分：p o 1 和p o 2 。p o 1 部分主要是由磷酸麦芽三糖、磷 酸麦芽四糖、磷酸麦芽五糖组成，每个组分上只连接一个磷酸根；而p o 2 部分则主 要是由磷酸麦芽五糖、磷酸麦芽六糖组成，每个组分上至少要连接两个磷酸根。且这 两个部分脱磷以后的平均聚合度分别为4 0 2 和5 8 2 。利用细菌糖化型0 【淀粉酶( b s a ) 和葡萄糖淀粉酶( g a ) 处理p o 一1 部分，使p o 1 被水解成只有两个成分组成的样品， 通过1 3 c n m r 和其它一些实验分析方法确定了p o 1 部分的化学结构。结果发现j ， p o 1 部分主要是由3 一磷酸低聚糖( 3 3 磷酸麦芽四糖，3 4 磷酸麦芽五糖) 和6 磷酸低 聚糖( 6 3 - r 瞵酸麦芽三糖，6 2 磷酸麦芽三糖，6 3 磷酸麦芽五糖，6 4 磷酸麦芽六糖) 组成。 对于p o 2 部分，其精确的组成还没有文献报道。 钙质的吸收主要由十二指肠中的主动吸收和小肠中的被动扩散组成，由于小肠中 显弱碱性，钙离子与磷酸根容易形成沉淀，使钙离子在小肠中的吸收率很低。类似羧 酸盐和磷酸盐等这一类含有酸性基团的盐类，一般均可以和钙离子形成可溶性的复合 物，从而阻止磷酸钙的形成。多肽类如酪蛋白磷酸肽( c p p ) ，p o l y - l g l u t a m a t e ，蛋白 类p h o s v i t i n ，酸性化合物如柠檬酸盐和a t p ，多聚糖类如褐藻酸、硫酸软骨素，都 具有一定的促进钙质吸收作用。而磷酸寡糖的结构与c p p 相似，可以和钙离子形成 可溶性的复合物，提高小肠中有效钙离子的浓度，有效的促进钙的吸收 1 2 , 1 3 。 磷酸寡糖通过阴离子交换色谱时，被分成的p o 1 和p o 2 这两个部分都可以 和钙离子形成可溶性复合物，但是p o 一2 部分形成的复合物更为稳定，其可溶性也更 好，从而可以更为有效的阻止磷酸钙的形成，这一作用和c p p 相似。虽然c p p 有 助于钙离子的溶解，但由于价格昂贵，且带有苦味或迟发苦味，所以c p p 的使用受 到一定的限制。c p p 的苦味检测限为o 0 5 ，而磷酸寡糖浓度在1 时没有检测出 苦味。因此极具开发价值。 闩本学者基于磷酸寡糖与钙离子能形成可溶性复合物，能促进肠道对钙离子的吸 收，且不被口腔微生物发酵利用的特点，将磷酸寡糖作为一种功能性添加剂加入口香 糖中，实验证明磷酸寡糖确实起到了强化牙齿釉质的再矿化，防止齿质损害的效果。 江崎格力高株式会社开发的磷酸寡糖钙已进入动物或临床应用试验 z 3 , 1 4 j 。其特性是水 溶性强，易吸收，热稳定性高。 磷酸寡糖也可作为强化剂，提高无机铁的溶解性。实验表明l l2 p o 1 溶解当量 摩尔的铁，而p o 2 溶解1 0 倍当量摩尔以上的铁。前已叙述及【l o p o 2 结合的磷酸 基数目超过p o 1 ，由此推测寡糖分子结合的磷酸数量影响对铁的溶解性能。将磷酸 寡糖或磷酸寡糖钙应用于口腔护理的产品中，如牙膏，漱口液，含片，糖果等，可以 起到良好的口腔保健效果。 磷酸寡糖还具有抗淀粉老化的作用，因其结构上具有多个羟基，与水分子有较强 的结合能力，能够维持食品的水分活度，对淀粉的回生老化有一定的抑制作用。实验 结果表明，它的抗淀粉老化的能力，超过同本己上市的抗淀粉老化制剂“f u j i o l i g o ”。 因此可作为抗老化保鲜剂，添加到米团，年糕和面包等淀粉制品中，能够起抗回生， 防老化，保质，保韧的功效1 2 。 在农业和园艺上，磷酸寡糖也可能添加到液体或粉末状肥料及药剂中，对水果和 切花等起延长保质期的作用【2 2 1 。 k a m a s a k a 等【1 6 】还通过环化麦芽糊精葡聚糖转移酶( c y c l o m a l t o d e x t r i n g l u c a n o t r a n s f e r a s e 简称c g t a s e ，e c 。2 。4 。1 1 9 ) 的作用，使磷酸寡糖反应之后形成 c g t - p o s ，再经离子交换色谱后分为三个分部即c g t - p 0 1 ，c g t - p 0 2 a 和c g t - p 0 2 b 。 c g t - p 0 2 a 和c g t - p 0 2 b 是具有抑制磷酸钙形成的c g t - p o s 的主要组分，c g t - p 0 2 a 分部平均聚合度为7 8 9 的麦芽寡糖，它具有2 个磷酸基；c g t - p 0 2 b 的平均聚合度 为11 0 6 ，它连接3 个磷酸基。c g t - p 0 2 b 抑制磷酸钙形成的作用远超过 c g t - p 0 2 a 。 同时，k a m a s a k a 等又报导【1 7 】，用马铃薯淀粉水解物制备的p o 1 部分，与卵清 蛋l 兰t ( o v a l b u m i n ，简称o v a ) 通过美拉德反应形成的共轭物，经过肠道的模型试验， 它作为食品添加剂，抑制磷酸钙沉淀形成的抑制作用优于o v a - g 6 p 。 1 2 3 我国对磷酸寡糖的研究近况 我国对马铃薯磷酸寡糖的研究起步较晚。1 9 9 9 年谷利伟和赵金兰在一篇综述中 介绍了同本对磷酸寡糖的研究进展【1 8 j 。不久，陕西科技大学许牡丹，毛根年等也对磷 酸寡糖的检测方法和制备工艺进行研究【1 9 圳1 。该课题组考虑到k a m a s a k a 等实验室的 制备方法得率较低，因此设计了三条工艺路线，以期提高磷酸寡糖的回收率：即马铃 薯淀粉水解法( a ) ，马铃薯淀粉磷酸酯水解法( b ) 和玉米淀粉制备麦芽低聚糖酯化法 ( c ) 。试验结果表明，三种制备工艺的磷酸寡糖得率分别为0 1 0 8 ，1 8 0 7 和 4 3 0 2 。即b 法的产率比a 法提高了1 6 7 倍，c 法比a 法提高了3 9 8 倍。进 一步优化c 法工艺，最终得到的磷酸寡糖产率为7 5 ，即比从马铃薯淀粉中直接水 解的a 法产率提高了7 0 倍。 安徽农业大学杜先锋也开展马铃薯淀粉制备磷酸寡糖的研究【2 2 1 。采用喷射液化制 备低d e 值的麦芽低聚糖浆。再用h p l c 分析其组分，发现制备的样品中包括葡萄 糖及麦芽2 7 糖，其中以麦芽2 5 糖的组分居多。进一步用红外光谱对上述样品处 理后进行结构分析，在红外光谱上出现p o c 基团。五价磷的p o 以及d 葡萄糖 吡哺糖环c o c 等吸收峰，由此可以判定该样品是结合有机磷基团的糖类物质。 1 3 磷酸寡糖f l , 0 n 备 1 3 1 磷酸寡糖的制备方法 以马铃薯淀粉为原料，辅以耐高温q 淀粉酶与脱支酶，糖化酶结合，水解马铃薯 淀粉可以制备磷酸寡糖1 8 引。马铃薯淀粉酶解液中含有磷酸寡糖的麦芽低聚糖，然后经 过阴离子交换树脂，先洗脱出中性低聚糖，用氯化钠水溶液对磷酸寡糖进行沈脱。 制备麦芽低聚糖有马铃薯淀粉水解法【8 6 。，马铃薯淀粉磷酸酯水解法和玉米淀粉制 备麦芽低聚糖酯化法等方法【87 1 。本实验根据马铃薯淀粉水解中液化与糊化所需的温度 与p h 等因素，设计了耐酸性c t 淀粉酶水解马铃薯淀粉的方法，并有一定的可实施 性。 1 3 2 含磷酸寡糖的麦芽低聚糖的制备工艺及比较 基本工艺过程如下：首先用耐高温0 【淀粉酶对淀粉进行液化( 或加酸进行处理) 以 获得低d e 值、液化较彻底且在6 0 稳定透明、不出现老化的液化液。为进一步提 高转化率，防止淀粉老化，加快过滤速度再通过添加真菌0 【淀粉酶对液化液进行糖化 或者将脱支酶和真菌0 【淀粉酶混合使用，同时进行液化与糖化。 马铃薯淀粉水解法是采用传统的淀粉液化方法，这种方法要求使用喷射液化装 置，不适用于实验室的小规模的试验。并且耗酸，耗时，费力。马铃薯淀粉磷酸酯水 解法采用c t 淀粉酶进行马铃薯液化，与马铃薯淀粉水解法相比，具有省时，液化较彻 底的优点。玉米淀粉制备麦芽低聚糖酯化法是在马铃薯淀粉磷酸酯水解法的基础上， 对糖进行酯化反应，可以进一步提高磷酸寡糖的得率。 1 4 纳滤技术的应用 1 4 1 纳滤技术的简介 纳滤( n a n o f i l t r a t i o n ，n f ) 是8 0 年代末期问世的一种新型膜分离技术，其膜截留 分子量介于反渗透膜和超滤膜之间，约为1 0 0 1 0 0 0 4 4 o 它是以压力差为推动力，具 有纳米级孔径的超薄分离层对大分子和小分子物质进行分离，可通过同时完成渗透和 浓缩两个工艺过程。最初纳滤应用于水处理方面，但随着技术的不断成熟与改进，纳 滤己应用到更广泛的领域中1 47 。 1 4 2 纳滤技术在功能性低聚糖分离纯化中的应用 选择不同孔径的纳滤膜，可将单糖、二糖、三糖以至于五糖以上组分依次分丌， 因此对功能性低聚糖的分离可以达到很好的效果，并且具有不影响物质的活性等特 点。目前已有报道成功使用纳滤技术分离纯化功能性低聚糖悴引。 袁其朋等运用卷式膜组件d l 2 5 4 0 进行大豆低聚糖分离的试验【46 | ，在1 5m p a 操作压力，纯水通量2 2 7m 3 d ，膜有效面积2 51i n 2 的条件下进行纳滤浓缩，总糖 约有7 7 被截留，其中功能性低聚糖水苏糖和棉籽糖的截留率高达9 0 以上。 经过纳滤，浓缩液中的总糖含量达8 2 7 。董艳等采用不同截留相对分子质量超滤 再纳滤的工艺流程1 46 | ，结果两次超滤得到低聚糖，最佳操作条件为：料液质量浓度 为1 3 1 3 2m g m l ，操作压力为0 2 5 - 一0 2 7 5m p a ，温度2 0 - - - 4 0 。然后采用纳滤 膜对超滤液进行浓缩纯化，适宜工艺条件为：料温为2 0 - - 一4 0 ，操作压力0 5 9 - - 一 0 7 9 m p a ，浓缩倍数可达3 倍。毕可英等采用n f l 纳滤膜【4 7 j ，对1 ，6 一二磷酸果 糖氯化钠水溶液进行浓缩除盐试验，上样2 0 0 0m l ，开机运行1 3 0m i n ，共排出液体 1 4 7 0m l ，经检测，排出液中不含1 ，6 二磷酸果糖。实验证明，不加水循坏浓缩除 盐，可除去水和无机盐均在7 0 以上。若继续加入去离子水，可进一步除去水和无 机盐。应用微滤、超滤纳滤技术1 4 引，多糖得率为4 6 6 3 ，质量分数达到9 3 3 ，凝 胶过滤法验证低聚糖制品的相对分子质量低于6 0 0 0 。结论该工艺能有效分离纯化地 黄低聚糖，简单可行，操作简便。 纳滤应用于磷酸寡糖方面的研究，国内外尚未有文献报道。仅限于其他低聚糖方 面有使用纳滤设备进行分离的报道。 1 4 3 纳滤技术的优缺点 纳滤膜技术在水处理领域中有能耗低、效率高、工艺简单，具有膜组件简洁、紧 凑、易于自动化操作、维修方便等特点。纳滤设备使用的卷式膜，占有一定量的较大 体积，这在实验室的应用中受到制约，且其中的膜污染的处理以及清洗时费水费时等 是现在纳滤应用的主要问题。这也制约了膜分离技术在工业中的大规模应用。 1 5 相关酶系的研究现状 1 5 1 酸性q 一淀粉酶的应用及研究现状 a 淀粉酶( q a m y l a s ee c 3 2 1 1 ) 系统名为l ，4 - a d 葡聚糖葡聚糖水解酶。是一 种内切酶，能以淀粉分子的内部任意切丌a 1 ，4 键，而不能切开q 1 ，6 键。是研究较 6 多，应用较广的类淀粉酶。可以应用在酿造，制药，制糖，生物等领域。随着对酶 的性质，结构功能的深入研究，其中耐酸性0 【淀粉酶就是逐渐被人们认识，使用的一 种q 淀粉酶。淀粉的发酵过程一般分为糖化和液化两个阶段，传统淀粉水解过程般 使用高温a 淀粉酶和糖化酶等酶判6 1 】，但这些酶类所需要的温度，p h 均有差异。而 酸性a 淀粉酶的适用温度、p h 与糖化酶接近，因此在试验过程中有助于增加原材料 的利用率，减少对温度、p h 等因素调配所需时间与酸碱液，还减少对环境的污染。 自从1 9 6 3 年日本学者y a s u j im i n o d a1 2 6 j 发现黑曲霉可以生产耐酸性a 淀粉酶 后，人们对耐酸性g t 淀粉酶进行了广泛的研究，后来人们陆续发现枯草杆菌，河内氏 曲霉( 4 s p k a w a c h i i ) ，青霉，酵母均可以产生耐酸性a 淀粉酶1 27 1 。其中黑曲霉系是研 究较多，安全性较高的真菌。 1 5 2 高温o t 淀粉酶的应用及研究现状 高温o 淀粉酶是指热稳定性9 0 以上的q 淀粉酶。淀粉液化时希望在9 0 以 上进行的反应更好。近年来，高温a 淀粉酶几乎有完全取代解淀粉芽孢杆菌酶之势。 全世界高温淀粉酶年销售额达4 0 0 0 万美元。芽孢杆菌0 t 淀粉酶，尤其是耐热性菌株 的a 淀粉酶都比较耐热。生产耐热a 淀粉酶的菌种有地衣芽孢杆菌、枯草杆散嗜 热脂肪芽孢杆菌、凝聚芽孢杆菌、酸热芽孢杆菌、以及普通芽孢杆菌。不同菌株的酶 最适p h 介于4 5 8 o 之间。近年来研究高温0 【淀粉酶的研究者虽多，但是触每活 性低，耐热性差，对钙离子的依赖性强，故生产上鲜有使用。只有适温菌地衣芽孢杆 菌q 淀粉酶活力最强，稳定性在9 0 经6 0m i n 而不失活1 2 8 - 3 0 1 。 目前工业用高温a 淀粉酶的生产菌株几乎都是地衣芽孢杆菌的突变菌。毋麦 n o v o 公司o u t t r u p 等将地衣芽孢杆菌a t c c 9 7 9 8 为出发株，经过物理与化学方法 反复处理7 次，使a 淀粉酶活力提高了2 5 倍。日本丸尾等人以地衣芽孢杆菌 n y k 2 4 为出发株，选用亚硝基胍( n t g ) 为诱变剂，反复连续诱变及自然选育6 次， 挑选环丝氨酸抗性突变菌株，发现高温淀粉酶产量随抗药性计量增大而增加。在抗环 丝氨酸的突变株中，得到一株产酶比母株提高2 0 0 0 倍的菌株。但因出发株产酶微弱， 使用价值不大i j 卜j 。 国内外生产的商品高温0 t 淀粉酶均为液体型，国外有美国m i l c s 公司、丹麦 n o v o 公司、荷兰g i s tb r o c a d e s 公司等公司有高温0 【淀粉酶的商品面市【3 引。 1 5 3 异淀粉酶的应用及研究现状 异淀粉酶( i s o a m y l a s e ，e c 3 2 1 6 8 ) 系统名为糖原6 葡聚糖水解酶，是一种能够 专一性地切开支链淀粉分支点中的a 1 ，6 糖苷键形成直链淀粉的脱枝酶的【3 6 】。可 水解支链淀粉、糖原、及某些分枝麦芽糊精和寡糖的a 1 ，6 键。它与普鲁兰酶的最 大差异除了不易水解普鲁兰糖外，对于分枝密集的支链淀粉和糖原具有高速的水解 力，最好的底物是高分子的多糖，而普鲁兰酶最佳底物则是低分子量的，这种区别反 映了异淀粉酶需要真正的分枝结构的严格专一性。 微生物中能产生异淀粉酶的菌种非常广泛，酵母、细菌放线菌均能产生。现已有 报道利用假单胞菌属、地衣芽孢杆菌等产异淀粉酶的报道。主要由假单胞卡i 菌所产生。 较成功地应用于高葡萄糖浆、高麦芽糖浆、低聚寡糖和啤酒生产以及医药领域。异淀 粉酶和糖化酶协同作用时，可以加速淀粉糖化过程，提高糖化率。 1 5 4 普鲁兰酶的应用及研究现状 普鲁兰酶( p u l l u l a n a s e ，e c 3 2 1 4 1 ) ，又称茁芽多糖酶，系统名为淀粉6 葡聚糖水 解酶或普鲁兰6 葡聚糖水解酶，属于去分支酶的一种1 36 | 。可水解支链淀粉，但不能单 独水解分枝更密集的糖原。用一些植物与微生物可以生产普鲁兰酶，微生物丰要有产 气气杆菌似e r o b a c t e ra e r o g e n e s ) ，蜡状芽孢杆菌蕈状变株( b c e r e u sv a rm y c o i d e j ) 和 酸性 解普鲁兰芽孢杆菌( b a c d o p u l l u l y t i c u s ) 。此外，放线菌、黄杆菌、地衣芽孢卡t 菌中也 发现了活力很强的普鲁兰酬6 0 】。来自植物的普鲁兰酶又叫r 一酶。1 9 8 3 年由丹麦n o v o 公司生产，具有耐热、耐酸的特点，且其中不含糖化酶、d 淀粉酶与0 【一淀粉酶，故 更适合于高麦芽糖浆的制造。 1 5 5 糖化酶的应用及研究现状 糖化酶，又称葡萄糖淀粉酶、外切1 ，4 - a d 葡萄糖苷酶、y 淀粉嗨( g l u c o a m y l a s e e c 3 2 1 3 ) ，系统名为1 ，4 - a d 葡聚糖葡萄糖水解酶【3 6 j 。是一种外切型淀粉酶。能从 淀粉分子非还原端依次水解0 l 1 ，4 键切下葡萄糖单位。也能缓慢水解0 【1 ，6 葡萄糖苷 键。但速度仅为水解0 c 1 ，4 键的1 1 0 。 因为在发酵行业中主要用作将淀粉转化为葡萄糖，所以习惯上被称为糖化酶，是 一种单链的酸性糖苷水解酶，具有外切酶活性。糖化酶是淀粉糖化发酵生产酒精、葡 萄糖浆的主要酶类。现在糖化酶不仅用于酒类和酒精生产及制取葡萄糖浆，还广泛地 用于抗生素、氨基酸、有机酸的生产。糖化酶是我国产量最大、应用范围最广的酶制 剂【9 2 l 。 糖化酶仅存在于微生物界。目前，国内外学者已经报道了黑曲霉、根酶、内生真 菌、青霉、芽孢杆菌和赤霉菌等微生物能够产生糖化酶。工业上生产糖化酶的菌种主 要是黑曲霉和根霉通过固体发酵和液态发酵法生产糖化酶。各国使用的产糖化酶菌株 有所不同，我国主要使用根霉、黑曲霉及其变异株；有的国家用红冬酵母、双孢拟内 孢霉、裂褶菌、泡盛曲霉及其变异株生产糖化酶。我国糖化酶的研究始于5 0 年代。 先用黑曲霉，6 0 年代使用的是黑曲霉n r r l 3 3 0 ，酶活力甚低，仅为3 0 0u m l 。改革 开放以后，中科院微生物研究所经研究，以u v 一1 l 为出发株，是糖化酶活力提高到 1 0 0 0 0u m l 。近几年达到2 0 0 0 0 单位以上。全国糖化酶的总产量估计至少在7 0 0 0 0t 以 上，几乎占我国酶制剂生产量的8 0 。糖化酶在制酒也上的应用，对于增加出酒率、 节约粮食、降低成本发挥了显著的作用1 9 2 j 。 1 6 课题研究的目的及意义 我国是马铃薯生产大国，常年种植面积约5 0 0 万公顷，产量约6 0 0 0 多力吨，居 世界之首，主要分布在华北，西北，东北和西南各省。但是加工水平比较落后，工业 化加工转化率不到5 ，而发达国家高达8 0 以上，我国需求的高质量马铃薯淀粉 有5 0 左右还依赖进1 2 1 2 3 - 2 5 j 。因此大力发展马铃薯产业是农业结构调整和增加农业 收入的重要途径。马铃薯淀粉及其变性淀粉具有很多优良特性，在各行业中得到广泛 的应用。 磷酸寡糖作为一种来源于马铃薯淀粉的功能性食品，在促进钙，铁的吸收上有独 特的优势，功能性食品的研究与素材的开发被认为是2 1 世纪的重要课题之一，人们 对健康的f 1 益关注以及对功能性食品的需求量同益增加，这为磷酸寡糖的研究、开发 和综合利用创造了一个良好的途径，因此磷酸寡糖的开发仍有较大的发展空间。 9 2 引言 随着人们物质生活水平的日益提高，因功能性低聚糖的独特作用，越来越受到人 们的重视与青睐。功能性低聚糖从发现、研究功能等方面逐渐过渡到工业化生产、酶 法生产的方向。磷酸寡糖与传统的功能性低聚糖相比，在促进人体对钙，铁的吸收上 有独特的优势。本试验中磷酸寡糖是以马铃薯淀粉为原料，采用微生物酶法制备，经 过阴离子交换树脂，或通过纳滤方法，最终得到磷酸寡糖成品。并对其组成成分进行 核磁共振的氢谱试验，最终得出结论与日本学者k a m a s a k a 等对磷酸寡糖组分的研究 基本一致。 传统的酶法制备磷酸寡糖需用细菌的高温a 淀粉酶、真菌糖化酶和去分支酶，这 三种酶分别由三种菌产生，生产工艺流程较长，随之也增加生产成本。根据制备磷酸 寡糖酶类的作用原理、条件，进一步将菌种和酶类转向由黑曲霉产生的酸性0 【淀粉酶、 糖化酶、去分支酶等的复合酶系。耐酸性0 【淀粉酶有近五十年的研究历史，已报道可 产耐酸性0 【淀粉酶类的菌种范围广，由于黑曲霉具有较高的安全性，本文从四株黑曲 霉p z 3 0 1 、a 3 、a 3 2 、b 9 产酶菌种中，筛选出一株产酶量教齐全，较高的菌株 p z 3 0 1 分别从液态发酵单因子试验、固态发酵单因子试验摸索出较佳的产酶菌株，再 进行正交试验以确定最佳产酶条件。 传统分离功能性低聚糖，通过大孔吸附树脂、离子交换树脂等进行沈脱，分离、 纯化。但用树脂进行分离、纯化物质的安全性受到质疑，并且层析柱的交换容量有限， 流速也较慢。因此选用纳滤膜对水解产物进行分子量的截留，可以得到磷酸寡糖。这 为以后进行放大实验，工业化生产提供了良好的依据。 在国家科技政策的支持下，课题“