（微生物学专业论文）海绵细菌的分离培养以及菌株hb09009、hb09012的分类鉴定.pdf

谳懈0 啼翎一鄹1 渊 原创性声明 本人郑重声明： 所呈交的学位论文。是本人在导师的指导下。独立进行研究工作所取 得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写 过的作品或成果对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。 本声明的法律结果由本人承担 论文作者签名：羽、蔻海 日期：j p 年多月7 日 学位论文版权使用授权说明 本人完全了解海南大学关于收集、保存、使用学位论文的规定即：学校有权保留并向 国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权海南大 学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存和汇编本学位论文本人在导师指导下完成的论文成果。知识产权归属海 南大学。 保密论文在解密后遵守此规定 论文作者签名：孑j 、慈涪 日期：2 0 o 年月7 日 导师签名矗丢殊 日期：卅一年6 月7 日 本人已经认真阅读“c a l l s 高校学位论文全文数据库发布章程 ，同意将本人的学位论 文提交“c a l l s 高校学位论文全文数据库”中全文发布，并可按“章程”中规定享受相关 权益。回意途塞握銮庭进丘；旦坐生i 旦= 生i 畦生蕉盔。 论文作者签名：捌、瑟涪 日期：动年6 月7 日 导师签名：莎各零 醐：圳。年6 月7 日 海南大学2 0 1 0 硕士学位论文 摘要 绵属于底栖滤食动物，其独特的滤食系统使其体内蕴藏了丰富的微生物，这些微 仅对海绵的生存具有重要意义，也是人类有待开发的重要海洋微生物资源我国 域辽阔，海绵多样性与生物量极其丰富。为从海绵微生物中挖掘新的细菌菌种， 本文对培养时间、培养基种类、培养基中添加海绵提取物、调整培养基中无机氮、磷源 以及采用二次分离法对海绵细菌可培养性的影响进行了研究，并对获得的两株菌进行了 多相分类，结果如下： 在平板培养实验过程中，发现培养第一周平板表面菌落数、菌落种类数形成较快， 之后菌落数、菌落种类数增加缓慢，但仍有新的菌落形成 培养基成分对海绵细菌的分离培养有较大影响。在2 2 1 6 e 和r 2 a 两种培养基中， r 2 a 培养基上获得的菌落数和菌落种类数均最多以r 2 a 作为基础培养基，添加海绵 提取物、无机氮源和无机磷源均有利于海绵样品中细菌的分离培养。 本论文还首次建立了二次分离法二次分离法的基本思想是：首先通过常用的细菌 培养基把样品中部分细菌分离出来，然后将在常用细菌培养基上难以形成菌落的细菌转 至另一培养基进行分离培养该方法使用2 2 1 6 e 培养基作为第一次分离的培养基，使用 s r a 培养基作为第二次分离的培养基，通过此方法从海绵中分离到1 8 株细菌。 将分离到的菌株进行1 6 sr d n a 测序分析，其中，菌株h b 0 9 0 0 9 与b a c i l l u s c a r b o n i p h i l u s 同源性最高，仅为9 7 1 ；菌株h b 0 9 0 1 l 与c o x i e l l ab u r n e t i i 同源性最高， 仅为9 5 4 ；- 菌株h b 0 9 0 1 2 与p l a n c t o m y c 嚣m a r i a 同源性最高，为9 7 4 三株菌在 g e n b a n k 的登录号分别为g u 2 6 3 8 3 3 、g u 319 8 8 6 和g u 2 6 3 8 3 4 对其中2 株细菌进行多 相分类鉴定菌株h b 0 9 0 0 9 具有芽孢杆菌属的典型特征，与系统发育树上亲缘关系最 近的且c a r b o n i p h i l u s 相比，二者在生长条件、培养特征和生理生化等方面存在较大的差 异，可能是b a c i l l u s 属的一个新种，暂定名为b a c i l l u ss p h b 0 9 0 0 9 。菌株h b 0 9 0 1 2 具有 浮霉菌属的典型特征，与系统发育树上亲缘关系最近的只m a r l s 相比，二者在生长条件、 培养特征和生理生化特性等方面也存在较大的差异，可能是p l a n c t o m y c e s 属的一个新 种，暂定名p l a n c t o m l y c e 墨s p h b 0 9 0 1 2 关键词：海绵，细菌，分离，二次分离法，鉴定 海绵细菌的分离培养以及菌株h b 0 9 0 0 9 、h b 0 9 0 1 2 的分类鉴定 a b s t r a c t m a r i n es p o n g e s ，ak i n do fm a r i n eb e n t h i cf i l t e r - f e e d i n ga n i m a l s ，h a v ec o n t a i n e dav a s t r e s e r v o i ro fm i c r o o r g n i s m st h a ta r ev i t a lf o r t h es u r v i v a lo ft h e m s e l v e so r f o rh u m a n e x p l o r a t i o n d u et ot h e i ru n i q u ef i l t e r - f e e d i n gs y s t e m n em a l i n es p o n g ed i v e r s i t yi s e n o r m o u sa n dt h eb i o m a s si sh u g ei nt h es o u t hc h i n as e a f o rd i s c o v e r i n gn e ws p e c i e so f s y m b i o t i ca n de p i p h y t em i c r o o r g a n i s m si nm a r i n es p o n g e s ，t h i sp a p e rf o c u s e do nt h ee f f e c to f c u l t u r et i m e ，m e d i u m ，m a r i n es p o n g ee x t r a c t ，i n o r g a n i c n i t r o g e na n dp h o s p h o r u s ，s e c o n d a r y i s o l a t i o nm e t h o do nt h ec u l t u r a b l ea b i l i t yo fs p o n g e a s s o c i a t e db a c t e r i a ，a n db a s e do nt h e p r i n c i p l eo fp o l y p h a s i ct a x o n o m y , as y s t e m a t i cs t u d yw a sc o n d u c t e do nt h et a x o n o m yo f 8 t r a l nh b 0 9 0 0 9a n dh b 0 9 0 1 2 1 1 l er e s u l t sw e r ea sf o l l o w s i tw a sf o u n dt h a tf o r m a t i o n so ft h ea m o u n t so fc o l o n ya n dt h ev a r i e t i e sw e r er a p i da tt h e f i r s tw e e k , h o w e v e r , a f t e ro n ew e e kt h ea m o u n t sa n dv a r i e t i e si n c r e a s e dm o r es l o w l yb u tn e w c o l o n i e ss t i l lf o r m e d 1 1 l cr e s u l t ss h o w e dt h a t ，m e d i u mc o m p o s i t i o nh a ds i g n i f i c a n te f f e c to nt h ei s o l a t i o no f b a t e r i a w en o t i c 燃lt h a tt h er 2 am e d i u mc o u l do b t a i nt h em o s tc o l o n i 鹤a n dv a r i e t i 鹤 b e t w e e n2 216 ea n dr 2 aa g a r a l s o ，r 2 am e d i u ma d d e dm a r i n es p o n g ee x t r a c t , i n o r g a n i c n i t r o g e na n di n o r g a n i cp h o s p h o r u sw a sb e n e f i c i a lf o ri s o l a t i o n o u rs t u d ye s t a b l i s h e ds e c o n d a r y - i s o l a t i o nm e t h o df o rt h ef i r s tt i m e i tb a s e do nt h ef a c t t h a tt h ec o l o n i e sf o r m e d0 1 1t h ec o m m o nm e d i u mw c i es e p e r a t e df i r s t l y , a n dt h e nt h ec o l o n i e s w h i c hc o u l dn o tb es e e nb yn a k e de y e sw e r et r a n s p l a n t e dt oo t h e rm e d i ao nw h i c ht h e yc o u l d g r o wt os e e n t h i sm e t h o du s e d2 216 e 船t h ef i r s ts e p a r a t i o nm e d i a , a n dt h e nu s e ds r a a st h e s e c o n ds e p a r a t i o nm e d i a e i g h t e e ns t r a i n sw e r ei s o l a t e db yt h i sm e t h o d b y 16 sr d n as e q u e n c i n ga n db l a s ta n a l y s i s ，s t r a i nh b 0 9 0 0 9h a dt h eh i g h e s ts e q u e n c e s i m i l a r i t yw i t hb a c i l l u sc a r b o n i p h i l u sj c m 9 7 3 l t ( a b 0 2 1 1 8 2 ) a n dt h es i m i l a r i t yv a l u ew a s o n l y9 7 1 ，s t r a i nh b 0 9 0 1lh a dt h eh i g h e s ts e q u e n c es i m i l a r i t yw i t hc o x i e l l ab u r n e t i i ( a y 3 4 2 0 3 7 ) a n dt h es i m i l a r i t yv a l u ew a s9 5 4 ，s t r a i nh b 0 9 0 1 2h a dt h eh i g h e s ts e q u e n c e s i m i l a r i t yw i t hp l a n c t o m y c e sm a r i ad s m 8 7 9 7 1 ( n r 0 2 5 3 2 7 ) 龇l dt h es i m i l a r i t yv a l u ew a s9 7 4 n e16 sr d n as e q u e n c e sw e r er e g i s t e r e di ng e n b a n ka n dt h ea c c e s s i o nn u m b e r sw e r e g u 2 6 3 8 3 3 、g u 319 8 8 6a n dg u 2 6 3 8 3 4 。n ep o l y p h a s i cc l a s s i f i c a t i o ns t u d i e so ft w os t r a i n s w e r ec o n d u c t e d n er e s u l t ss h o w e dt h a ts t r a i nh b 0 9 0 0 9h a dt y p i c a lc h a r a c t e r i s t i c so fg e n u s b a c i l l u ss h a r e dah i g hh o m o l o g yw i t hb a c i l l u sc a r b o n i p h i l u s ，s t r a i nh b 0 9 012h a dt y p i c a l c h a r a c t e r i s t i c so fg e n u sp l a n c t o m y c e ss h a r e dah i g hh o m o l o g yw i t hp l a n c t o m y c e sm a r i a h o w e v e r , t h e r ew e r eo b v i o u sd i f f e r e n c e sb e t w e e np h e n o t y p i ca n d c h e m o t a x o n o m i c c h a r a c t e r i z a t i o n r e s u l t si n d i c a t e dt h a th b 0 9 0 0 9m i g h tb ean o v e lb a c i l l u ss p e i c e sa n d n 海南大学2 0 1 0 硕士学位论文 p r e l i m i n a r i l yi d e n t i f i e da sb a c i l l u ss p h b 0 9 0 0 9 ，耶0 9 0 1 2m i g h tb ean o v e lp l a n c t o m y c e s o n ea n di d e n t i f i e d8 8p l a n c t o m y c e ss p h b 0 9 0 1 2 ， ，一 ： 、， k e y w o r d s ：s p o n g e , b a c t e r i a , i s o l a t e , s e c o n d a r y - i s o l a t i o nm e t h o d ，i d e n t i f i c a t i o n m 海南大学2 0 1 0 硕士学位论文 目录 ：i i i 】【 月i j ；i i i ：1 1 1 海绵及其微生物：1 1 1 1 海绵生物学简介。l 1 1 2 海绵微生物l 1 1 3 海绵微生物的分布及特点。l 1 1 4 海绵微生物的多样性2 1 2 微生物难以培养的原因3 1 3 微生物培养的研究技术一4 1 3 1 微生物培养的新方法4 1 3 2 分子生物学方法对未培养微生物的研究7 1 4 微生物资源开发利用的前景。8 1 5 本课题的研究目的及意义9 2 材料与方法l o 2 1 实验材料l0 2 1 1 主要试剂。1 0 2 1 2 主要溶液。l0 2 1 3 仪器设备“ 2 1 4 培养基l l 2 2 海绵细菌的分离与培养1 2 2 2 1 样品的采集与处理。1 2 2 2 2 培养时间对海绵细菌可培养性的影响1 3 2 2 3 培养基种类对海绵细菌可培养性的影响1 3 2 2 4 培养基组分对海绵细菌可培养性的影响1 3 2 2 5 海绵细菌的分离培养1 4 2 2 6 菌种的保存1 4 2 3 细菌1 6 sr d n a 序列测定及系统发育分析1 5 2 3 1 细菌基因组d n a 的制备1 5 2 3 21 6 sr d n a 的p c r 扩增15 2 3 3p c r 产物的回收1 5 2 3 4 连接反应i6 2 3 5d h 5 a 感受态细胞的制备。1 6 2 3 6 连接产物的转化l6 l 海绵细菌的分离培养以及菌株h b 0 9 0 0 9 、衄0 9 0 1 2 的分类鉴定 2 3 7 重组质粒的p c r 鉴定1 7 2 3 8 系统发育树分析1 7 2 4 细菌的分类鉴定l7 2 4 1 形态学特征l7 2 4 2 生理生化特征18 2 4 3d n ag + cm 0 1 测定l9 3 结果与分析2 1 3 1 培养时间对海绵细菌可培养性的影响2 l 3 2 培养基种类对海绵细菌可培养性的影响2 l 3 3 培养基组分对海绵细菌可培养性的影响2 2 3 3 1 无机氮源对海绵细菌可培养性的影响。2 2 3 3 2 无机磷源对海绵细菌可培养性的影响。2 2 3 3 3 海绵提取物对海绵细菌可培养性的影响2 2 3 4 海绵细菌的分离培养2 3 3 4 1 传统平板分离2 3 3 4 2 二次分离法2 3 3 5 细菌1 6 sr d n a 序列测定及系统发育分析2 4 3 6 菌株的分类鉴定2 6 3 6 1 形态学特征2 6 3 6 2 生理生化特征2 7 3 6 3d n a ( g + c ) m 0 1 测定2 7 3 6 4 菌株的鉴定结果：2 9 4 讨 仑“3 0 4 1 培养时间对海绵细菌可培养性的影响3 0 4 2 培养基种类对海绵细菌可培养性的影响3 0 4 3 培养基组分对海绵细菌可培养性的影响3 0 4 4 二次分离法：3 l 4 5 海绵细菌的分离培养3 2 4 6 细菌的分类鉴定3 2 5 结论3 4 参考文献3 5 附录3 9 缩略词4 2 致谢4 3 2 厂二 1 前言 海南大学2 0 1 0 硕士学位论文 1 1 海绵及其微生物 1 1 1 海绵生物学简介 海绵属于多孔动物门，是最原始的无脊椎生物，由一群原始的多细胞生物构成，在 演化中形成独立的一个分支。海绵约占海洋物种总量的1 1 5 ，是热带海洋中除珊瑚外的 第二大生物量，全世界约有1 0 0 0 0 1 5 0 0 0 种。海绵的生理构造系统很简单，且处于未形 成器官的阶段，体制仍保持在组织的层次。海绵的腔体由内皮层和外皮层两个细胞层组 成，它们的内骨骼称为“骨针 或“海绵质 。 海绵固定地附着于海底生活，它们利用内侧体壁上的鞭毛运动，在水中产生水流， 水流由海绵多孔外表上的无数入水孔进入海绵体内，将水中所含的食物过滤吸收以后再 由出水孔排出体外。海绵就是利用其独特的遍布全身的腔状管道结构，依靠过滤海水中 的微生物为食，其过滤微生物的效率达7 5 9 9 。 1 1 2 海绵微生物 海绵微生物包括古细菌、细菌、蓝细菌、藻、异养型真核生物和真菌等海绵和微 生物间的共附生关系可分为义务性共生( 寄主在宿主的代谢中有重要的作用) 、非义务 性共生( 寄主和宿主有互利关系) 以及简单的共栖关系( 寄主对宿主无利也无害) ( 薛 松等，2 0 0 3 ) 。海绵中的微生物是通过海水流动进入海绵体内的，与海绵的通道体系成 反比关系如果海绵的通道体系不发达，则海绵组织中含有的微生物数量较多，反之， 如果它的通道体系发达，则其组织中含有的微生物数量较少。 1 1 3 海绵微生物的分布及特点 根据微生物在海绵中的分布位置，可将其中的微生物分成三类( 见图1 1 ) ：c a ) 附 生微生物：这类微生物附着在海绵表面或内腔表面，随意性较大，会随着海水的流动产 生很大变化。( b ) 海绵细胞外微生物：由海水进入海绵体内的大多数微生物直接进入了 海绵细胞间中质层而躲过了海绵细胞的吞噬作用，从而在细胞外存活了下来。这类幸存 下来的微生物对中质具有特异性，占了海绵体内微生物的大多数。c o ) 海绵细胞内微生 物：即被海绵细胞吞噬的微生物，可为海绵细胞提供营养。微生物在海绵中的这种分布 特点是由海绵独特的腔状、多孔、多管道的组成特点以及依靠过滤海水摄取营养的方式 决定的。 海绵共附生微生物的特点：( 1 ) 共附生微生物数量多；( 2 ) 共附生微生物的形态与 宿主存在相对稳定性；( 3 ) 共附生微生物在时间上相对稳定；( 4 ) 共附生微生物群落结 构的多样性和相对一致性。 海绵细菌的分离培养以及菌株h b 0 9 i ) 0 9 、h b 0 9 0 1 2 的分类鉴定 a bc d 附生息，h 眭 棱内共生 图1 - 1 海绵共附生微生物( l e ee ta 1 ，2 0 0 1 ) f i g 1 - 1m i c r o o r g a n i s m sa s s o c i a t e dw i n im a r i n es p o n g e s a ：附生在体表的微生物；b ：寄生在细胞间中质层的微生物； c ：位于细胞内( 核外) 的微生物；d ：分布在细胞核内的微生物 1 1 4 海绵微生物的多样性 近年来人们逐渐认识到海绵体内微生物具有丰富的多样性。早期对海绵微生物多样 性的研究主要是通过形态观察，然而在对海绵微生物关系的研究中，很多微生物是没 有被培养过或不可培养的，对微生物的描述也就常常局限于微生物的形态学，大大限制 了鉴定微生物的种类数目，因此海绵中微生物的多样性远远高于传统分离培养条件下培 养出的微生物所表现的多样性。 由于海绵内复杂的微生物群落组成处于未知状态，因此通过分子生物学手段对海绵 中微生物的多样性进行研究，人们不但发现了海绵微生物新的种群，而且发现海绵中存 在着丰富的微生物多样性。随着现代分子生物学技术，如1 6 sr d n a 技术、变性梯度凝 胶电泳技术( d e n a t u r i n gg r a d i e n tg e le l e c t r o p h o r e s i s ，d g g e ) 和荧光原位杂交( f l u o r e s c e n c e i ns i t uh y b r i d i z a t i o n ，f i s h ) 等的应用，研究人员对未可培养海绵微生物的研究取得了重 大进展。w e b s t e r 等( w e b s t e r , 2 0 0 1 ) 利用荧光原位杂交技术( f i s h ) 研究发现海绵 r h o p a l o e i d e so d o r a b i l 中的细菌具有丰富的多样性，其中3 0 属于放线菌，4 1 属于变 形纲的y 亚纲，还发现了两个亚群的新古菌。l a r sf i e s e l e r 等( l a r sf i e s e l e r , 2 0 0 4 ) 使 用特异的p c r 引物构建了海绵a p l y s i n aa e r o p h o b a 共生细菌的1 6 sr r n a 基因文库，通 过对1 6 sr d n a 的酶切多态性分析、测序以及系统发育分析发现，有一类群细菌的1 6 s r r n a 基因与已知门的细菌相比，同源性 7 0 ) ，室温或3 7 放置2m i n ： ( 8 ) 1 2 0 0 0r m i n 室温离心2m i n ，离心管中的液体即为回收的d n a 片段，可立即 使用或保存于2 0 c 备用： ( 9 ) 取4i x ld n a ，l 琼脂糖凝胶电泳检测。 2 3 4 连接反应 采用p g e m - te a s yv e c t o r 为测序载体，将p c r 产物与t - 载体连接，具体操作步骤 详见产品说明书。在o 5m l 离心管中依次加入以下成份：2 l i g a s er e a c t i o nb u f f e r5 0 p l ，t v e c t o r ( 5 0n g h t l ) 1 0p l ，p c r 回收产物( o 1 0 3p m 0 1 ) 3 0g l ，t 4d n al i g a s e ( 3 0u 4 t l ) 1 0p l 。各组份混匀后瞬时离心，于1 6 连接过夜。 2 3 5d h 5d 感受态细胞的制备 采用c a c l 2 制备法制备d h 5a 感受态细胞( 萨姆布鲁克等，2 0 0 3 ) ，具体操作步骤 如下： ( 1 ) 将保存的e c o l id h 5q 菌种涂布于l b 培养基平板上，3 7 培养1 2 1 6h ； ( 2 ) 从l b 琼脂平板上挑取e c o l id h 5q 的单菌落，接种到2 0m ll b 培养液中， 3 7 ，3 0 0r p m 振荡培养3 h 左右至菌液o d 6 0 0 值在0 3 - 0 5 之间； ( 4 ) 将培养液转入1 s m l 无菌离心管中，置于冰浴冷却3 0m i n 。4 c ，6 0 0 0r p m 离 心5 r a i n ，倒尽上清液； ( 5 ) 向沉淀中加入4 0 0p l 预冷的o 1mc a c l 2 溶液重悬菌体，避免剧烈振荡，冰 上放置1 5 3 0 m i n ； ( 7 ) 4 c ，4 0 0 0r p m 离心5r a i n ，弃上清液。加1 0 0p l 冰上预冷的o 1mc a c l 2 ， 重悬菌体，即成为感受态细胞，置于4 c 保存2 纠8h ，转化效率最高。 注：感受态细胞在4 c 保存的时间不易太久( 一周内有效) ，以免影响转化效率。大 批量制备感受态，可于8 0 保存半年。 2 3 6 连接产物的转化 ( 1 ) 取1 0p l 连接产物转移至1 0 0 $ t l e c o l id h 5q 感受态细胞，混匀后冰浴3 0m i n ； ( 2 ) 4 2 水浴中热激9 0s ( 注意：不要振荡) ，迅速置冰浴2r a i n ； 1 6 海南大学2 0 1 0 硕士学位论文 ( 3 ) 转入0 8m l 不含抗生素的l b 液体培养基，混匀； ( 4 ) 混合物于3 7 ，2 0 0r m i n 振荡培养lh ； ( 5 ) 取2 0 0t t l 培养物涂布到含1 0 0t t g m l a m p 的l b 平板上，平板正面放置，直 至液体被吸收： ( 6 ) 倒置平板，3 7 培养1 2 1 6h 至菌落出现。 2 3 7 重组质粒的p o r 鉴定 根据p g e m 辔- te a s yv e c t o r 克隆位点两端的碱基序列，设计并合成引物t 7 与s p 6 ， 序列分别是： t 7 引物：5 t a 触r a c g a c t c a c t a t a g g g a g a 3 ； s p 6 引物：5 - c a t a c g a t i t a g g t g a c a c t a t a g 3 从转化平板上挑取菌落，转接含抗生素的l b 液体培养基，振荡培养过夜，以培养 液直接作为p c r 模板。p c r 反应体系为：5t t l1 0 x p c r b u f f e r ，5p l 2m m o l l d n t p ，3 p l2 5m m o l lm g c l 2 ，li i l2 0t t m o l l 弓i 物s p 6 ，lp l2 0t t m o l l 弓i 物1 7 ，0 4t t lt a q p o l y m e r a s e ( 5u p l ) ，l 此模板d n a 和3 3 6t t l 纯水。p c r 扩增条件：9 4 预变性5m i n ， 9 4 变性3 0s ，6 0 退火lm i n ，7 2 延伸1 5m i n ，3 5 个循环，最后7 2 延伸1 0m i l l 。 p c r 产物经l 琼脂糖凝胶电泳检测，紫外灯下观察，在1 4 k b 位置若有一明显的电泳 带则表明p c r 产物成功连接到b 载体上取4 0 0p l 阳性克隆菌菌液寄往上海生工生物 工程有限公司进行测序。 2 3 8 系统发育树分析 经测序获得菌株1 6 sr d n a 序列，将该序列与g e n b a n k 中核酸数据进行b l a s t 比对， 选取同源性高的菌株的1 6 sr d n a 序列用于系统发育学分析。使用c l u s t a lx 1 8 软件包 进行多序列匹配排列( t h o m p s o ne ta 1 ，1 9 9 7 ) ，用m e g a 2 软件包中的k i m u r a 2 - p a r a m e t e r d i s t a n c e 模型计算进化距离( k u m a re ta 1 ，2 0 0 1 ) ，用n e i g h b o r - j o i n i n g 法构建系统发育树 ( s a i t o u & n e i ，1 9 8 7 ) ，1 0 0 0 次随机抽样，计算自引导值( b o o t s t r a p ) 评估系统发育树 的置信度。 2 4 细菌的分类鉴定 2 4 1 形态学特征 ( 1 ) 形态特征 选择适宜的培养基，接种后置于2 5 培养箱中倒置培养。观察菌落形状和大小、边 缘、表面、隆起形状、透明度、菌落及培养基的颜色等。同时挑取单菌落，用显微镜观 察菌株的细胞形态。 ( 2 ) 革兰氏染色 挑取菌体涂片、干燥、固定；加结晶紫的混合液染lm i n ，水洗；滴加碘液覆盖lr a i n ， 海绵细菌的分离培养以及菌株h b 0 9 0 0 9 、h b 0 9 0 1 2 的分类鉴定 水洗；用9 5 乙醇滴洗至洗脱液无紫色，约2 0 - 3 0s ，立即用水冲净；用番红液染2 3r a i n ， 水洗、风干。深紫色为革兰氏染色阳性细菌，红色为革兰氏染色阴性细菌。 ( 4 ) 运动力 用直针穿刺接种试验菌于s r a 半固体培养基内，置2 5 培养箱中培养7d 。如生长 物只生长在穿刺线上，边缘清晰，则表示试验菌无运动性；如生长物由穿刺线向四周呈 云雾状扩散，则表示试验菌具有运动性。 2 4 2 生理生化特征 参考东秀珠( 东秀珠，2 0 0 1 ) 的方法测定细菌的生理生化特征。 ( 1 ) 生长温度 将纯化菌株接种于s r a 培养基平板，培养温度为4 、1 2 ( 2 、2 0 ( 2 、2 5 1 2 、3 0 、 3 7 、3 9 、4 l 、4 5 、6 5 ，倒置培养7d ，测定菌株的最适生长温度。 ( 2 ) 耐盐性 配制s r a 培养基平板( 淡水) ，n a c l 浓度( w v ) 分别为0 、2 、5 、7 、 1 0 ，接种后2 5 倒置培养，测定菌株的最适生长盐度。 ( 3 ) p h 值 配制s r a 培养基平板，p h 值梯度设为3 0 、3 5 、4 0 、4 5 、5 0 、5 5 、6 0 、6 5 、7 0 、 7 5 、8 0 、8 5 、9 0 ，接种后2 5 c 倒置培养，测定菌株的最适生长p h 值。 海南大学2 0 1 0 硕士学位论文 ( 8 ) v - p 测定 接种试验菌于s r a 液体培养液中，置2 5 培养箱中培养7d 。取培养液和4 0 氢氧 化钠等量相混。加少许肌酸，1 0m i n 如培养液出现红色，即为试验阳性反应，有时需要 放置更长时间才出现红色反应。 ( 9 ) 淀粉水解 取菌种接种于淀粉水解平板，形成明显菌落后，在平板上滴加卢哥氏碘液。平板显 蓝黑色，菌落周围如有不变色透明圈，表示淀粉水解阳性，否则为阴性。 ( 1 0 ) 纤维素分解 灭菌前将培养基分装试管，选用新华一号滤纸为试验纤维素。滤纸条一半浸在培养 液中，一半露在培养液外。将菌种接种到露在培养液外的一段滤纸上，并设置不接种的 空白对照，2 5 培养l _ 4 周观察若菌落生长则表明该菌株产生纤维素酶，反之为阴性。 ( 1 1 ) 硝酸盐还原 将测定菌接种于硝酸盐液体培养基中，置2 5 培养7d ，设2 个重复，另留两管不 接种作对照。当培养液中滴入格里斯氏试剂后，溶液如变为粉红色、玫瑰红色、橙色、 棕色等表明亚硝酸盐存在，为硝酸盐还原阳性。如无红色出现，则可加i 2 滴二苯胺试 剂，此时如星蓝色反应，则表示培养液中仍有硝酸盐，又无亚硝酸盐反应，表示无硝酸 盐还原作用；如不呈蓝色反应，表示硝酸盐和形成的亚硝酸盐都已还原成其他物质，故 仍应按硝酸盐还原阳性处理。 ( 1 2 ) 明胶液化 将菌种穿刺接种于明胶液化培养基，并设空白对照。2 5 培养，分别于5d 、1 0d 、 1 5d 、2 0d 、3 0d 时观察明胶液化情况。观察前将试管放入4 冰箱或冷水中降温，待空 白对照管凝固时观察培养基液化情况。若液化，说明该菌株产生蛋白酶，反之不产生。 ( 1 3 ) 脂酶 待s r a 培养基冷却于4 0 5 0 时，加t w e e n8 0 至终浓度为1 ，倒平板。划线接种 培养物于平板，2 5 培养7 d 。在菌落周围有模糊晕圈者为阳性，没有晕圈者为阴性。 2 4 3d n ag + cm o i x 测定 2 4 3 1 色谱条件 色谱柱：依利特o d s b p ( 4 6m i n x 2 5 0t o n i ，f 5p m ) ；流动相：2 0m m o l lk h 2 p 0 4 缓 冲液( p h5 6 ) ：甲醇( 9 0 ：1 0 ，v v ) ：检测波长：2 6 01 3 m l 柱温：室温；流速：lm l m i n ： 进样量：1 0 此。 2 4 3 2 标准碱基储备液及混合液的配制 分别用流动相配制四种碱基储备液，c 、g 、t 、a 的浓度分别为l m m o l l 、0 3m m o l l 、 lm m o l l 和lm m o l l ( 其中g 应先用数滴磷酸溶解后再用流动相定容) 。分别准确吸取 各碱基储备液2m l 混合，用o 2m o l l n a o h 溶液调节p h 约7 0 左右，定容至1 0m l ， 1 9 海绵细菌的分离培养以及菌株h b 0 9 0 0 9 、h b 0 9 0 1 2 的分类鉴定 摇匀即可。 2 4 3 3 细菌基因组d n a 的提取 ( 1 ) 取1 0m l 培养液8 0 0 0r m i n 离心2m i n ，收集菌体转至1 5m l 离心管中，用 无菌d d h 2 0 和t e 缓冲液各洗2 次； 。 ( 2 ) 向沉淀物加入5 6 7p l 的t e 缓冲液，用吸管反复吹打使之重悬。加入3 0l a l1 0 的s d s 和3i 1 l2 0m l m g 的蛋白酶k ，混匀，于3 7 0 温育lh ； ( 3 ) 加入1 0 0 “l5m o f lk a c ，充分混匀。1 2 0 0 0 r m i n 离心1 5 m i n ，将上清液转移 至新管； ( 4 ) 加入等体积的酚氯仿异戊醇( 2 5 2 4 1 ) ，混匀，1 2 0 0 0r r a i n 离心1 0m i n ，取 上清液； ( 5 ) 加入等体积的氯仿异戊醇( 2 4 1 ) ，再抽提一次； ( 6 ) 加入o 1 倍体积3m o l l n a a c ( p h 5 2 ) ，混匀后加入2 倍体积2 0 ( 2 预冷的无 水乙醇，混匀，2 0 沉淀3 0m i r a ( 7 ) 1 0 0 0 0r r a i n 离心1 0m i n ，d n a 沉淀用7 0 的酒精清洗2 次，吹干； ( 8 ) 加入5 0 0i l lt e 缓冲液，溶解d n a ； ( 9 ) 加入r n a s e 至终浓度2 0g g m l ，混匀，3 7 ( 2 温育3 0m i n 。 ( 1 0 ) 加入等体积的酚氯仿异戊醇( 2 5 2 4 1 ) 抽提一次，再用等体积的氯仿异戊 醇( 2 4 1 ) 抽提一次； ( 1 1 ) 加入o 1 倍体积3m o f l n a a c ( p h 5 2 ) ，混匀后加入2 倍体积的一2 0 ( 2 无水乙 醇，2 0 沉淀3 0m i r a ( 1 2 ) 1 2 0 0 0r m i n 离心1 0 m i n ，d n a 沉淀用7 0 乙醇洗涤2 次后，吹千，置于一2 0 保存。 2 4 3 4d n a 溶解 用高氯酸在沸水浴中水解d n a lh ，每毫克d n a 加1 5p g 高氯酸，加水5 0 肛l ，离 心取上清。 2 4 3 5 进样 用流动相平衡色谱柱lh 。取2 0i l l 样品注入色谱柱，记录色谱图，用峰面积定量。 海南大学2 0 1 0 硕士学位论文 3 结果与分析 3 1 培养时间对海绵细菌可培养性的影响 培养时间是影响海绵细菌可培养性的重要因素之一，为了寻找适合海绵细菌的培养 周期，对三批次海绵样品进行了实验。发现培养第一周时平板表面菌落快速形成。之后， 菌落数目虽增加缓慢，但仍陆续有菌落生成( 见图3 1 ) 通过观察发现菌落种类也随着 培养时间的适当延长而增加。 i - - 4 - - - 海绵样品l l l + 海绵样品2 i i 墨缦搓昌i 图3 - l 不同时间平板菌落计数 f i g 3 - 1p l a t ec o u n t so fb a c t e r