（微生物学专业论文）甲基对硫磷降解菌的分离、鉴定及水解酶基因的克隆.pdf

甲基对硫磷降解菌的分离、鉴定及水解酶基因的克隆 英文缩略词 a m p ：a m p i c i l l i n ，氨苄青霉素 a c r ：a c r y l a m i d e ，丙烯酰胺 b i s ：n ，n - m e t h y l e n e b i s a c r y l a m i d e ，n ，n - i i f 甲双丙烯酰胺 c l a p ：c a l f i n t e s t i n a la l k a l i n ep h o s p h a t a s e ，牛小肠碱性磷酸酶 e d t a ：e t h y l e n e d i a m i n e t e t r a a c e t i ca c i d ，乙二胺四乙酸 i p t g ：i s o p r o p y l b d t h i o g a l a c t o p y r a n o s i d ，异丙基b 一硫代半乳糖苷 k b ：k i i ob a s e ，千碱基对 k d a ：k i l od a l t o n ，千道尔顿 l b ：l u r i a - b e r t a n im e d i u m ，l b 培养基 0 p s ：o r g a n o p h o s p h o r a s ，有机磷农药 o d ：o p t i c a ld e n s i t y ，光密度，吸光度 p a g e ：p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s ， 聚丙烯酰胺凝胶电泳 p c r ：p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ， 聚合酶链式反应 s d s ：s o d i u md o d e c y ls u l f a t e ，十二烷基硫酸钠 i r i s ：t r i s ( h y d r o x y m e t h y l ) a m i n o m e t h a n e ，三( 羟甲基) 氨基甲烷 t c a ：t r i c h l o r o a c e t i ca c i d ，三氯乙酸 t e m e d ：n ，n ，n ，n 一t e 仃am e t h y le t h y l e n ed i a m i n e n ，n ，n ，n - 四甲 基乙二胺 d d h 2 0 ：d o u b l ed i s t i l l e dw a t e r ，双蒸水 r p m ：r e v o l u t i o np e rm i n u t e ，每分钟转速 f p d ：f l a m ep h o t o m e t r i cd e t e c t o r ，火焰光度检测器 m p ：m e t h y lp a r a t h i o n ，甲基对硫磷 p n p ：p - n i t r o p h e n o l ，对硝基苯酚 x - g a k 5 一b r o m o - 4 一c h l o r o 一3 一i n d o l y l - b e t a - d - g a l a c t o p y r a n o s i d e ，5 一溴一4 一氯一3 一 吲哚一d _ 半乳糖营 3 关于学位论文原创性和使用授权的声明 本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行科学研 究所取得的成果。对在论文研究期间给予指导、帮助和做出重要 贡献的个人或集体，均在文中明确说明。本声明的法律责任由本 人承担。 本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的规 定，同意学校保留和按要求向国家有关部门或机构送交论文纸质 本和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权山东农业大学可 以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可 以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。 保密论文在解密后应遵守此规定。 论文作者签名：擞 导师签名：逊条 日 期：碑塑”t ， 甲基对硫磷降解菌的分离，鉴定及水解酶基因的克隆 摘要 利用微生物对有机磷农药的降解性能消除其在环境中的残留，是治理 环境污染的一项有效手段。甲基对硫磷( m e t h y l p a r a t h i o n ，以下简称m p ) 又称甲基1 6 0 5 ，是一类目前广泛使用的高毒有机磷农药，其主要中间代 谢产物为对硝基苯酚( p - n i t r o p h e n o l ，以下简称p n p ) ，易溶于水，具 有中等毒性。由于二者都具有苯环结构，残留期很长，给人类健康造成潜 在威胁。本文从华阳农药厂污水处理曝气池中分离，筛选到了多株能降解 甲基对硫磷的菌株。其中菌株y w l 2 ，y w l 5 ，y w l 8 ，y w 2 8 具有较好的降解 性能。 y w l 2 能以甲基对硫磷为唯一碳源，磷源，对硝基苯酚为唯一碳源生 长，经鉴定，为根癌农杆菌( a g r o b a c t e r i u m t u m e f a c e e n s ) 。 y w l 5 ， l w 1 8 ，y w 2 8 ，能以甲基对硫磷和对硝基苯酚为唯一碳源生长，经鉴定， 为苍白杆菌( o c h r o b a c t e r u ms p ) 四株菌的1 6 sr d n a 序列在g e n b a n k 中 的注册号分别为d q 4 6 8 1 0 0 ，d q 4 6 8 1 0 1 ，d q 4 6 8 1 0 2 和d q 4 6 8 1 0 3 。并对四 株菌进行了系统发育分析。 分别用气相色谱法和分光光度法对四株菌的降解性能进行了研究，结 果表明四株菌在0 5 小时内对5 0 m g l 甲基对硫磷的降解率达9 0 以上； 在8 小时内能将5 0 m g l 对硝基苯酚完全降解。四株菌也同时能够在以甲 胺磷，辛硫磷，毒死蜱，克百威，溴氰菊酯，阿特拉津为唯一碳源的基础 培养液中生长，表明四抹菌具有广泛的农药降解谱。 用多种方法提取四株野生型菌的质粒，只有用碱法大量提取时发现有 比其基因组大的条带出现，根据国内外报道有的野生型菌株的质粒大于其 基因组，推测y w l 5 ，y w l 8 ，y w 2 8 三株菌中可能存在大质粒，但用紫外线， 电穿孔，变温s d s 等质粒消除的方法均没消除掉，可能条件有待于改进。 以四株菌基因组为模板，用p c r 法克隆其水解酶基因m p d 。将克隆到 的菌株y w l 2 ，y w l 5 ，y w l 8 ，y w 2 8 的m p d 基因进行测序，其结构基因全长 为9 9 8 b p ，9 9 9 b p ，9 9 8 b p ，9 9 9 b p 。基因注册号分别为：d q 8 4 3 6 0 5 ，d q 8 4 3 6 0 6 ， d q 8 4 3 6 0 7 ，d q 8 4 3 6 0 8 。测序结果在g e n e b a n kn u c l e i c n u c l e i cb l a s t 进 行比对，发现它们与其它甲基对硫磷降解菌的m p d 基因同源性高达9 9 ， 说明甲基对硫磷水解酶结构基因m p d 具有非常高的保守性，四株菌的m p d 4 山东农业人学硕士学位论文 基因可能是甲基对硫磷水解酶基因的同源基因。 四株菌全细胞粗酶液s d s p a g e 电泳表明，其甲基对硫磷降解酶在菌 体中呈组成型表达，且初步确定四株野生型菌株m p d 水解酶属于胞内酶。 关键词：甲基对硫磷，对硝基苯酚，生物降解水解酶基因 甲基对硫磷降解菌的分离、鉴定及水解酶基因的克隆 a b s t r a c t m i c r o b i a l d e g r a d a t i o n i sn o t o n l y t h em a i np a a e mo fd e g r a d i n g o r g a n o p h o s p h o r o u sp e s t i c i d e s b u ta l s oo n eo fp o w e r f u lm e a n st ot r e a t p o l l u t i o ni ne n v i r o n m e n t 。m e t h y l p a r a t h i o n ( m p ，a l s ok n o w na sm e t h y l 1 6 0 5 ) i sak i n do fh i g ht o x i c i t y o r g a n o p h o s p h a t ep e s t i c i d e s a n du s e dw i d e l ya t p r e s e n tt h r o u g h o u tc h i n a i t sm a j o ri n t e r m e d i a t ed u r i n gm e t h y l l ) a r a t h i o n d e g r a d i n gp r o c e s si sp - n i 仃o p h e n o l ( p n p ) ，w h i c hi s s o l u b l ea n dm i d d l i n g t o x i c i t y h u m a nh e a l t hc o u l db et h r e a t e n e dp o t e n t i a l l yb e c a u s eb o t hm pa n d p n ph a v ep h e n y lr i n g 。f o u rs t r a i n si nt h i sr e s e a r e h , y w l 2 ，y w l 5 ，y w l 8 ， y w 2 8 ，w i t l l p o t e n t i a la b i l i t yo f d e g r a d a t i o nf o ro r g a n o p h o s p h o r u sp e s t i c i d e s w e r ei s o l a t e df r o mt h ea c t i v a t e d s l u d g ep o l l u t e db yo r g a n o p h o s p h o r u s p e s t i c i d e s m e t h y lp a r a t h i o nw a su s e da st h es o l es o u r c eo fc a r b o n , p h o s p h a t ea n d p - n i t r o p h e n o tw a su s e da st h es o l es o u r c eo fc a r b o nb yy w l 2 ，a n di tw a s i d e n t i f i e da sa g r o b a c t e r i u m t u m e f a c i e n s m e t h y lp a r a t h i o na n dp - n i t r o p h e n o l w e r eu s e da st h es o l es o u r c eo f c a r b o nb yy w l 5 ，y w l 8 ，y w 2 8 ，a n dt h e yw e r e i d e n t i f i e da so c h r o b a c t e r u ms p , t h eg e n b a n ka c c e s s i o nn u m b e ro ft h e1 6 s r d n a s e q u e n c eo f y w l 2 ，y w l 5 ，y w l 8 ，y w 2 8 a r ed q 4 6 8 1 0 0 ，d q 4 6 8 1 0 1 ， d q 4 6 8 1 0 2a n dd q 4 6 8 1 0 3 ，r e s p e c t i v e l y a tt h es a m et i m e ，p h y l o g e n e t i c a n a l y s i so f y w l 2 ，y w l 5 , y w l 8a n dy w 2 8w e r ec a r r i e do u t t h ef o u rs t r a i n sc a nd e g r a d e5 0 m g lo fm e t h y lp a r a t h i o n , p - n i t r o p h e n o l r a p i d l ya n dc o m p l e t e l yi no 5 ha n d8 hr e s p e c t i v e l y , a sd e m o n s t r a t e dw i t hg a s c h r o m a t o g r a p h y ( g c ) a n ds p e c t r o p h o t o m e t e ra n a l y s i s a tt h es a m et i m e ，t h e yc a na l s ou t i l i s em e t h a m i d o p h o s ，p h o x i m ，c h l o r p y r i p h o s ， c a r b o f u r a n , d e l t a m e t h r i n ，a t r a i z i n e ，a st h es o l es o u r c eo fc a r b o n ，w h i c h i n d i c a t e st h a tt h e yh a v et h ea b i l i t yt od e g r a d em a n i f o l dp e s t i c i d e s m a n ym e t h o d sw e r eu s e df o ri s o l a t i n gp l a s m i do ft h ef o u rs t r a i n s ，a n d o n l yt h ea l k a l i n ei s o l a t eab i gp l a s m i dw h i c hi sb i g g e rt h a nt h ec h r o m o s o m e i t w a sr e p o r t e dt h a tt h ep l a s m i do fm a n yw i d es t r a i n si s b i g g e rt h a n i t s 6 山东农业大学硕 一学位论文 c h r o m o s o m e ，s ow es p e c u l a t et h a tt h e r ea l ep l a s m i di ny w l5 ，y w l8 ，a n dy w 2 8 w h e r e a s , w ei n t r o d u c e dm a n ym e t h o d sf o rc u r i n gt h ep l a s m i d ，b u tf a i l e d t h em p dg e n eo ff o u rs t r a i n sl o c a t e di nc h r o m o s o m ew a sc o l o n e db y p c i lt h es i z esi s9 9 8 b p ，9 9 9 b p ，9 9 8 1 r p ，9 9 9 b p ，r e s p e c t i v e l ya n dt h ea c c e s s i o n n u m b e ri ng e n e b a n ki s d q 8 4 3 6 0 5 ，d q 8 4 3 6 0 6 ，d q 8 4 3 6 0 7 ，d q 8 4 3 6 0 8 r e s p e c t i v e l y t h es e q u e n c e r e s i l l tw a sb l a s t i ng e n e b a n kn u c l e i c n u c l e i c b l a s t , a n dt h ef o u rk f f a i n s 删g e n eh a v e9 9 h o m o l o g o u sw i t ho t h e r m e t h y l p a r a t h i o nd e g r a d a t i o ns t r a i n s ，w h i c hi l l u m i n a t e st h a tt h em p dg e n ea l e v e r yc o n s e r v a t i v e t h ew h o l e - c e l lp r o t e i ns d s p a g es h o w e dt h a tt h em p dw a sc o m p o n e n t e x p r e s s e di nf o u rs t r a i n s ，a n dt h em p dh y d r o l a s em a yb e l o n g st oe n d o e n z y m e t h i si st h ef i r s tr e p o r tt h a ta g r o b a c t e r i u m t u m e f a c i e n sy w l2c a nd e g r a d e m e t h y lp a r a t h i o na n dp - n i t r o p h e n o lt i l ln o w a n dt h ef o u rs t r a i n ss h o w st h e p o t e n t i a la b i l i t yt ob eu s e di nab i o r e m e d i a t i o na p p l i c a t i o nf o rt h et r e a t m e n to f m e t h y l p a l a t h i o nr e s i d u e sa n dw i t hf i l l t h e rr e s e a r c hc o u l dl e a dt oa na l t e r n a t i v e r o u t eo f d i s p o s a lf o ru s ei na g r i c u l t u r eo ri n d u s t r y k e y w o r d s ：m c t h y l p a r a t h i o n , p - n i t r o p h e n o l ，b i o d e g r a d a t i o n ，h y d r o l a s eg e n e 7 山东农业大学硕士学位论文 1 引言 1 1 农药及农药的危害 农药是是指用于预防、消灭或者控制危害农业、林业的病、虫、草害 等有害生物，以及有目的地调节植物、昆虫生长的化学药品，或者来源于 生物、其他天然物质的一种物质或者几种物质的混合物及其制剂，包括化 学农药和生物农药，我们通常所说的农药一般指化学农药。化学农药自诞 生之日就在人类生产、生活中发挥了极其重要的作用，利用化学农药防治 病虫草害是人类生产、生活中提高产量的一项重要手段。目前生产上广泛 使用的化学农药按其主要用途可以分为：杀虫剂、杀菌剂、杀螨剂、杀鼠 剂、杀线虫剂、除草剂、植物生长调节剂以及土壤处理剂。按其化学结构 类型可以分为：有机磷农药、有机氯农药、氨基甲酸酯类农药、拟除虫菊 酯类农药等。 农药的使用是农业增产的重要因素，是解决世界上6 0 亿人口温饱问题 的有力措施。2 0 世纪6 0 年代出现的第一次“绿色革命”为人类的粮食安全 做出了重大贡献，其中作为主要技术之一的农药为粮食的增产起到了重要 的保障作用。因为农药具有成本低、见效快、省时省力等优点，因而在世 界各国的农业生产中被广泛使用，但农药的过分使用产生了严重的负面影 响。仅1 9 8 5 年，世界的农药产量为2 0 0 多万t ；在我国，仅1 9 9 0 年的农药产 量就为2 2 6 6 万t ，其中甲胺磷一种农药的用量就达6 万t 。近年来中国农药 工业发展十分迅速，在l o 年左右的时间里，农药产量几乎翻了一番，农药 品种成倍增长。2 0 0 6 年，全国化学农药原药累计产量( 折1 0 0 9 6 ) 1 2 9 6 万 吨，同比增长2 0 2 ，增幅基本与上年持平。其中，杀虫剂产量5 0 5 2 9 吨， 同比增长1 0 ：杀菌剂产量儿2 万吨，同比增长1 1 7 ；除草剂产量3 8 7 万吨，同比增长2 9 ，增幅较上年提高4 2 个百分点。2 0 0 7 年全国农药需求 总量( 有效含量) 预计为2 9 7 2 万吨，预计2 0 0 7 年杀虫剂需求总量为1 4 5 l 万吨，杀菌剂需求总量约为7 5 5 万吨，除草剂需求总量为7 2 8 万吨，植物 生长调节剂需求量2 9 3 8 吨，去年底，世界气象组织在其发表的全球气候年 度报告中指出，2 0 0 7 年有望成为1 8 6 1 年有气象观测记录以来全球气温第4 高的年份，预计全球地表平均温度要比1 9 6 1 1 9 9 0 年间的年平均温度高出 9 甲基对硫磷降解菌的分离，鉴定及水解酶基因的克隆 0 4 4 。报告同时认为，因人为因素造成的温室气体排放量继续增加，全 球气候变暖趋势短期内不会减缓。气候变暖现象在我国也十分明显。目前， 我国已是世界第二大二氧化碳( 温室气体) 排放国，且已经连续出现了第 1 8 个暖冬。专家预计，2 0 5 0 年我国平均气温将上升2 2 c 。而科学研究表 明，随着气候变暖，作物生长季延长，昆虫繁衍代数将增加，冬季温度较 高也有利于幼虫安全越冬，温度高还为各种杂草的生长提供了优越条件。 这就是说，气候变暖将加剧农作物病虫害的流行和杂草蔓延，从而创造出 更多的农药需求。 然而，化学农药既是农业的保护神，又是危及人类健康和破坏人类生 存环境的瘟神。化学农药的使用会对环境产生一系列不利影响，进而对人 体健康造成损害，其中最可怕的是农作物中农药残留对人体健康造成的影 响。新世纪人类更加关心环境与健康，环境与食品，特别是瓜果蔬菜的农 药残留，越来越严重的影响着人类的身体健康，越来越引起社会的关注， 保护环境已成为政府的主要任务之一，成为社会关注的焦点，绿色食品和 无公害蔬菜成为人们消费的追求，而农药残留，残留农药的生物降解仍是 全世界都关注的焦点话题，因此，怎样更好的解决环境中的农药残留对人 体产生的不利影响问题，也越来越受到社会的关注。因此，加强农药的生 物降解研究、解决农药对环境及食物的污染问题，是人类当前迫切需要解 决的课题之一。 1 2 化学农药与环境污染 目前，全世界农药原药品种达1 3 0 0 余种，而广泛使用的农药有4 0 0 多 种，我国常用的有1 5 0 1 6 0 种，农药的平均使用量8 0 - 1 0 0 万吨( 华小梅， 1 9 9 6 ) ，居世界首位，农药自生产以来曾在人类防治病、虫害以及预防疾 病方面，发挥了不可磨灭的作用，据不完全统计全世界农业由于病、虫、 草三害造成的粮食损失占总量的一半左右，在挽回损失中，化学农药的作 用达7 0 一8 0 ，而其它防治方法总共才占2 0 一3 0 。特别是当病虫害成为限 制产量的主要因索时，采用化学农药防治可以防止大的灾害发生或迅速提 高收获量，但是近几十年来，由于农药的大量使用，在带给人们巨大经济 效益的同时，也带来了严重的环境污染问题，如水体污染、大气污染、土 壤污染、农产品、食品污染，面对人畜健康造成的危害也越来越大( 胡宏 l o 山东农业人学硕t 学位论文 韬，2 0 0 0 ) 。据统计，我国不同程度遭受农药污染的农田面积已达9 3 3 a m ， 严重污染的耕地被迫弃耕，加重了耕地减少的局面。 有机磷农药是当今农药的主要类别之一，一直在国内外大量生产和广 泛使用，但由于其对非靶标生物的毒性高和某些有机磷农药存在潜在迟发 性神经毒性( 张一宾，1 9 9 9 ；马瑾，2 0 0 3 ) ，有机磷中毒事件在我国经常 发生。该类农药化学结构的共性是均具有一个五价磷原子，中毒机理是磷 原子与乙酰胆碱酯酶( a c h e ) 共价结合形成磷酰化酶( 蔡道基，1 9 9 9 ) ， 从而阻断了乙酰胆碱的水解，乙酰胆碱在神经系统中的积累引起突触的过 度兴奋，抑制神经冲动传导，引起一系列神经综合症，因此对于人畜可造 成极大危害( s i d d a v a t t a md ，2 0 0 3 ：s h e r k e n h o f f ，e t a l ，2 0 0 4 ) 。国 内外文献显示，二十世纪八十年代以来，每年大约3x1 07 公斤的有机磷 农药被大量使用，导致每年有数千例农药中毒事件发生，直接死亡数为 8 0 0 余人( d a v ek i ，1 9 9 4 ) 。有机磷农药产生的食品、水体污染，尤其是 大量的杀虫剂废物，已经造成了严重的全球性环境污染和生态破坏。有机 磷农药残留问题直接威胁到人类的生存和可持续发展，并成为发达国家设 置绿色贸易壁垒的重要手段，因此解决环境中存在的农药残留问题仍是世 界各国的研究热点。 生物修复( b i o r e m e d i a t i o n ) ( 尤民生，2 0 0 4 ) 是近年来发展起来的用 于治理环境污染的- - 1 3 新技术，它主要是通过微生物的作用，将环境中的 有机污染物转化为c o ：和h 。o 等无毒无害或毒性较小的物质。生物修复特 别是微生物对残留农药的去毒降解，是目前治理环境污染特别是农药污染 的有效途径。因此大力开发有机磷农药降解菌资源，对降解菌进行鉴定， 并深入了解其降解机理和代谢途径，构建工程菌及利用混合菌制剂和酶制 剂降解有机磷农药，具有重要的现实意义。 1 3 微生物降解有机磷农药的研究进展 1 3 1 降解有机磷农药微生物的多样性 目前，已经分离的降解o p s 的微生物，有邻单胞菌属，假单胞菌属， 黄杆菌属，大比目鱼黄杆菌，微藻，藻青菌，产碱菌属，芽抱杆菌，木 霉属，链格抱属，枯草芽胞杆菌，蜡状芽胞杆，恶臭假单胞菌，青霉， 甲基对硫磷降解菌的分离，鉴定及水解酶基因的克隆 节杆菌，不动杆菌属，缺陷假单胞菌，放射形土壤杆菌，诺h 氏菌，黑蓝 节杆菌，巨大芽胞杆菌，鲁氏酵母，瓶形酵母菌，黑曲霉，微球菌，伯克 霍尔德菌，聚多曲霉，绿色木霉，米曲霉等，包括细菌、真菌、放线菌、 藻类等( s c r e e n i v a s u l u c ，2 0 0 1 ：崔中利，2 0 0 l ；柏文琴，2 0 0 4 ；郑金来，2 0 0 1 ； 梁伊丽，2 0 0 4 ：b r a j e s hk ，2 0 0 4 ) ，其中细菌由于其生化上的多种适应能 力以及易诱发突变菌株，在降解农药的微生物中占重要地位。某些有机磷 农药可以被多种菌降解，同一种菌也会对多种有机磷农药具有降解作用， 体现了微生物种类的多样性以及某些微生物功能的多样性，同时提示某些 微生物可以应用于一种或多种农药的降解，而另一些则只能用于特定种类 农药的降解。 1 3 2 有机磷农药降解菌的获得与鉴定 可降解有机磷农药微生物的获得途径主要有：( 1 ) 从受污染的土壤。 农药厂污水处理曝汽池中的污泥等受污染的环境介质中富集、驯化、筛选 分离高效降解菌，这是目前采用最多的一种方法。( 2 ) 定向培育优良菌种 近年来也备受关注，其方法是在土壤中通过人为多次施药，培育可降解该 农药的微生物。( 3 ) 在上述农药降解菌培育过程中，诱变育种也是常用的 方法。王兆守等通过紫外诱交育种获得高效菌株。王永杰通过紫外诱变育 种获得高效菌株，刘玉焕等用n t g 诱变曲霉属乐果降解菌，经测定该诱变 菌株对乐果的降解率明显提高。( 4 ) 构建工程菌株在近年方兴未艾( 闰艳 春等，2 0 0 0 ) 。农药降解菌的降解基因多存在质粒中，因此通过质粒转移 可以使降解菌的降解基因在其它菌株上得到表达，同时，可使一个菌株携 带多个降解质粒，从而扩大降解谱及增强降解能力。 降解菌株的鉴定也是农药微生物降解中一项重要的工作，它对于开发 农药降解菌资源，阐明降解机理，构建工程菌及利用混合菌降解农药具有 重要意义。目前常用的鉴定方法的主要依据是降解菌的形态特征、培养特 征及生理生化特征，随着分子生物学技术和其它学科的发展，一些先进的 技术也被广泛应用于降解菌株的鉴定中( 刘淑艳，2 0 0 0 ) ，这些技术包括： g + c 含量测定、d n a 杂合率测定、r r n a 相关度测定、r r n a 的碱基序列测定、 核糖体蛋白的组分分析，红外吸收光谱、核磁共振、脂类分析、细胞色素 类型以及辅酶q 的类型等也被广泛应用( 李琳，2 0 0 4 ) 。 山东农业大学顼士学位论文 1 3 3 降解机理与代谢途径 微生物对农药的作用方式可分两大类，一类是微生物直接作用于农 药，其实质是酶促反应，主要是因为微生物本身含降解该农药的酶系基因， 或本身虽无该酶系基因，但是经诱导或环境存在选择压，基因发生重组或 改变产生了新的降解酶系。其作用的方式主要有氧化、脱氢、还原、水解 等几种反应类型。另一类是通过微生物的活动改变了化学和物理的环境而 间接作用于农药。常见的作用方式有3 种：矿化作用，指微生物直接以 有机磷农药作为生长基质，将其完全分解成为无机物如c o z 和h 2 0 等的过 程。共代谢作用：指微生物在有其可利用的碳源存在时，对其原来不能 利用的物质也可分解代谢的现象。种间协同代谢：指同一环境中的几种 微生物联合代谢某种有机磷农药( 石成春，2 0 0 3 ) 。 目前，微生物对有机磷农药的代谢途径研究比较清楚的是甲胺磷( 朱 南文，1 9 9 6 ：阮少江，2 0 0 0 ) 和甲基对硫磷。甲基对硫磷( p a r a t h i o n - m e t h y l ) 属高效商毒的有机磷农药，目前已报道了多种可降解甲基对硫磷的菌株， 但矿化菌很少。微生物代谢甲基对硫磷初始反应一般为水解反应，产物为 二甲基硫代磷酸( d i m e t h y l t h i o p h o s p h o r i ca c i dd m t p ) 和对硝基苯酚 ( p - n i t r o p h e n o l ，p n p ) 。但也有不同于该途径的报道，如崔中利等分离到 可共代谢的细菌b a c i l l u sc e f e u sj - 5 ，该菌株在降解甲基对硫磷的过程 中没有产生p n p ，而是检测到一紫外吸收波长为2 4 2 5 n m 的代谢中间产 物，该物质的化学性质还未知。d m t p 为无毒化合物，对d m t p 进一步降解 的研究意义不大，有关报道较少。p n p 的毒性与其母体甲基对硫磷相比下 降了i 0 0 倍，但由于其含有苯环结构，残留期很长，对环境和人类的健康 毒性也很大，因而对p n p 的微生物降解引起了广泛的重视( 崔中利，2 0 0 2 ) 。 图l 和图2 为甲基对硫磷和p n p 可能的代谢途径( w a t a mk i t a g a w a ，2 0 0 4 ) j 甲基对硫磷降解菌的分离、鉴定及水解酶基因的克隆 k s 。一m 芝争 胁n o h 图l 甲基对硫磷降解途径 f i g ，1t h e p a t h w a y o f m e t i i y l p a r a t h i o n d e g r a d a t i o n o l i l 审 w 弋阻。 一v 一 o 笋l l 事一沪 一文乎。 盖 i-tcaeyck 图2 对硝摹翠酚降解逢径 f 培2t h ep a t h w a yo f p - m t r o p h e n o l 1 3 4 影响农药降解的因素 农药在环境中主要有吸附和降解两种去向，其中农药的降解又可分为 生物降解和非生物降解两种方式。在光、热及化学因子作用下发生的降解 现象为非生物降解；而在动植物体内或微生物体内外的降解作用属生物降 解。生物降解主要是微生物降解在农药降解中占据了主导地位( 曹志芳， 1 9 9 3 ；d g i s i c t s t u c k i ，1 9 9 7 ；王永杰，1 9 9 9 ；王毓敏，1 9 9 9 ；s h i r l e y f n o s h i n o 。2 0 0 0 ；张韩洁，2 0 0 4 ) 。 ( i ) 环境因子：农药进入环境后，会受到一些环境因子的作用，如：温度、 。 腑 觜筝篱犬y 。 山东农业人学硕j ：学位论文 湿度、p h 值、含水量、有机质含量、粘度及气候等。一般来说在高温湿 润、有机质含量丰富、p h 偏碱性的情况下，农药易于被降解，残留低。 t h o m a sb 和j e n n i f e rk 等对土壤中莠去津、乐果、氟乐灵的降解情况进 行了研究，发现当土壤中加入堆肥、茎秆、木屑等以提高有机质含量时， 土壤中农药的降解效率明显提高( l i c h t e n s t e i nep ，1 9 6 4 ) 。 ( 2 ) 农药本身的因素：农药的分子结构、农药的使用浓度及农药的用药历 史等也影响农药的降解性能。农药因其在分子结构及理化性质方面不同， 对生物降解的敏感性差别很大。如：2 ，4 一d 与2 ，4 ，5 - t ，由于在第 5 位c 原子上增加了一个氯原子，就会使降解所需的时间从1 4 天增至2 0 0 天，2 ，4 ，5 t 相当难被微生物降解。 ( 3 ) 微生物的影响：由于农药降解的主要方式是在微生物的作用下进行， 因此微生物对于农药的降解具有重大的影响。微生物种类、数量繁多，有 利于农药的降解。有报道( 王倩如等，1 9 9 5 ) ，从活性污泥中分离出一株 蜡状芽孢杆菌和一株嗜中温假单胞菌；混合菌比单一菌降解率高，对甲胺 磷的去除率可达9 5 5 9 7 4 。 1 3 5 有机磷农药水解酶基因的克隆 目前，已从不同的微生物中分离到各种有机磷降解基因，表l 列出了 近年来国内外报道的几种有机磷降解基因的情况( m u l b r yww ，1 9 8 9 ； m c d a n i e lcs ，1 9 8 8 ：m u l c h a n d a n i a ，1 9 9 8 ；1 1 y ae l a s h v i l i ，1 9 9 8 ； o h s h i r ok ，1 9 9 9 ：i r e n eh o r n e ，2 0 0 2 ；0 h s h i r ok ，1 9 9 7 ；h o r n ei ，2 0 0 2 ) 。 天然菌株由于受到自然条件的影响，其对农药的降解率较低或作用较慢， 不能达到期望的效果。随着基因工程的进展，人们试图构建高效生物反应 器来提高有机磷农药降解酶的表达量。1 9 8 5 年s e r d a r 等首次尝试在大肠 杆菌中表达有机磷农药降解酶，表达产物虽具有生物学活性，但表达量还 未到原始天然菌株的十分之一，随后s e r d a r 将此酶基因前的s d 序列及信 号肽编码序列去除后再在大肠杆菌中表达，表达量有所提高，c h e n g 等从 a l t e r o m o n a ss p 中克隆到一个有机磷农药降解酶编码基因，并在在大肠杆 菌中尝试表达，o h s l f t r o 等从a r t h r o b a c t e rs p b 5 中分离到有机磷农药降 解酶基因o p h ，也在大肠杆菌中尝试表达，崔中利等将克隆到的甲基对硫 磷水解酶基因m p d 转入ec o l i 得到了高效表达( s u n d i e p k ，。2 0 0 3 ；刘智， 甲基对硫磷降解苗的分离鉴定及水解酶基因的克隆 2 0 0 3 ) ，最近甲基对硫磷水解酶基因成功的在枯草芽孢杆菌和甲醇酵母中 进行了表达( x i a o - y uc h u 。2 0 0 6 ) 。 表1 十种有机磷农药的降解基因 名称定义菌株来源大小 1 3 6 有机磷降解酶的研究 有研究表明，来源于黄杆菌和假单胞杆菌的有机磷农药降解酶( o p h ) 是以二聚体的形式存在，其位于氨基酸2 5 4 和2 5 7 位上的组氨酸残基在金属 活性位点附近，而这些残基通过活性位点与底物相互作用而影响催化反应 ( j p p h i l l i p s ，1 9 9 0 ；j p p h i l i i p s ；伍宁丰，2 0 0 3 ) 。如果将原酶中的四个 金属活性位点突变为两个，底物特异性就会发生改变，其中磷硫键有机磷 的底物特异性增加最为明显，达到2 3 0 倍。但相反磷氟键型有机磷的底 物特异性明显减少。而磷氧键型有机磷的底物的特异性改变不一，有些增 加，有些减少。该酶p h 最适范围在8 一i o 之间，温度范围较广，稳定性强， 酶活性不受金属离子的影响。将f l a v o b a c t e r i u ms p a t c c 2 7 5 5 1o p h 纯化 后制成酶反应器，曾被用来处理高浓度的有机磷杀虫剂蝇毒磷。1 9 9 1 年， d e f f a n k 等从一株嗜盐细菌中纯化得到一种有机磷农药降解酶，分子量 6 0 k d ，p - j - 被m 9 2 + 和c o ”激活，对含磷氟键的有机磷化合物作用较好，对 含磷氧键的有机磷化合物作用不好。2 0 0 2 年，h o m e 等( h o m ei ，2 0 0 2 ) 从一 株4 舢6 船耙r f “聊中分离到一种有机磷农药水解酶o p d a ，与o p h 相比具有 更广泛的底物范围，并且对某些底物来讲，它具有更好的动力学特征，降 j 6 山东农业人学硕j ：学位论文 解二甲基底物的速度更快，但对于二乙基底物的水解速度没有变化。 我国关于有机磷农药降解酶的研究起步较晚，但近年也已取得了较 大进步。李顺鹏等( c u iz h o n g l i ，2 0 0 1 ) 分离了多株有机磷降解菌，并对其进 行了详细研究，分离获得了多种有机磷农药降解酶的基因，实现了融和表 达，并对酶学性质进行了分析。从菌株m 6 中分离提纯的有机磷农药降解酶 经分析发现，其c 一末端含有6 个寡聚组氨酸，水解甲基对硫磷时，最适p n 8 6 8 8 ，最佳反应温度1 5 ：i a 1 2 + 、z n ”、c u 2 + 可使酶活性增加1 5 - - 2 0 ，ca ：2 + 、m 9 2 + 微弱的促进酶的作用，n i 2 + 对酶活性几乎无影响；i m m o l l e d t a n e + 几乎不影响酶的活性，而1 0 m m o l le d t a n a 2 + 对甲基对硫磷水 解酶有较强的抑制作用。陈亚丽( 2 0 0 1 ) 等从一株假单胞杆菌w b c 一3 中分离 到降解甲基对硫磷的有机磷农药降解酶，已进行x 一衍射分析其三维结构 ( l e is u n ，2 0 0 4 ；l i u h ，2 0 0 5 ；y a n - j i ed o n g ，2 0 0 5 ) 。刘玉焕等( 2 0 0 0 ) 从 曲霉菌中分离纯化出有机磷降解酶，此酶对有机磷农药乐果具有很好的降 解作用，它的最适反应温度4 5 ，最适反应p h 7 2 ，对热稳定，并能在p h 6 1 0 范围保持活性，重金属、c u 2 + 对该酶有明显的促进作用，而s d s 对其具有 抑制作用，这是首例来自真菌的磷酸三酯酶。 从总体上来看，有机磷农药降解酶在这些工程菌中的表达水平还较 低，只比原始菌株高十几倍或与原始菌株差异不大，还达不到廉价生产有 机磷农药降解酶的要求，但却证实了利用基因工程手段来提高有机磷农药 降解酶的表达、实现工业化生产这一途径的有效性。 1 3 7 农药微生物降解的新技术和新方法 1 降解菌的应用 目前，国内外对有机磷降解菌在生物修复中的应用已经展开了广泛的 研究。m u l b r y 等从蝇毒磷污染的土壤中分离的菌株制成生物过滤柱，在 7 d 1 0 d 内可将污水中1 5 0 0 m g l 的蝇毒磷降低到0 1 m g l 。曹志方等将假 单胞菌w b - 1 和瓶形酵母菌1 j n f 一2 组成联合菌，在甲胺磷生产废水s b r 生化 处理工艺上进行小试，结果表明，联合菌投加到活性污泥中驯化后处理废 水时，在进水c o d 浓度为1 0 0 0 m g l 1 8 0 0 m g l 范围内得到较好的处理效果， 甲胺磷的去除率达到8 5 以上。李顺鹏等将甲彗对硫磷的降解菌 a l c a l i g e n e ss p 接种于含有甲基对硫磷的土壤中，表现了较强的降解农 1 7 甲摹对硫磷降解菌的分离、鉴定及水解酶基因的克隆 药残留的生态效应在盆栽试验中，稻米与稻壳中甲基对硫磷比对照下降 了8 2 2 1 0 0 9 6 田间试验中，农药加菌，农药加有机肥加菌的处理，其稻米 中的甲基对硫磷残留均检测不到，而对照( 只施农药不加菌) ，稻米中的甲 基对硫磷含量为0 0 6 5 m g k g ，超过国家标准( 0 0 5 m g k g ) 。此外，程国锋等 用甲胺磷降解菌国c i u s s p 胁一j 和乐果降解菌p s p 嘲一l 的菌制剂进行 普通白菜变种矮脚黄残留降解小区试验，结果表明，菌剂对残留的甲胺磷 和乐果有明显的去除效果。总之，菌制剂已经开始走向实际应用，它可以 有效去除土壤、蔬菜、污水中的农药残留。 2 降解酶的应用 ( 1 ) 将酶固定化用于有机磷污染物的脱毒：固定化提供了固相支持物，制成 的酶反应器己用于有机磷的解毒。固定化酶用于污水处理中，可以重复使 用，而且避免极端条件下酶变性，用于土壤修复中，可避免土壤吸附、失活 以及水解蛋白的微生物降解( 虞云龙，1 9 9 6 ；m u l c h a n d