（微生物学专业论文）嗜热脱氮芽孢杆菌新型双性sod基因的生理生化功能研究.pdf

i i ii i ii i ii iiul li iiil ! y 17 9 8 0 2 7 南开大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，进 行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位 论文的研究成果不包含任何他人创作的、已公开发表或者没有公开 发表的作品的内容。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个 人和集体，均已在文中以明确方式标明。本学位论文原创性声明的 法律责任由本人承担。 学位论文作者签名：王遗垴 妒3 年s 只 6 段 摘要 摘要 超氧化物歧化酶( s u p e r o x i d ed i s m u t a s e ，简称s o d ) 是一种金属酶类，它可分 为四类，分别是c u z n s o d ，m n s o d ，f e s o d 和n i s o d 。s o d 是一种重要的 氧自由基清除剂，能催化超氧阴离子( 0 2 ) 的歧化反应。s o d 与多种人类疾病 及衰老有关，因而是一种具有较大潜力的药物酶。 n g 8 0 - 2 为一株在石油开采工业中具有广泛应用前景的嗜热脱氮芽孢杆菌， 分离白天津大港油田。n g 8 0 2 耐高温，可乳化并降解原油，可明显提高石油产 量。 本实验室在独立完成n g 8 0 2 全基因组测序工作后，利用生物信息学方法对 其进行基因注释和序列分析的过程中，发现该菌株存在一个特殊的超氧化物歧 化酶基因( g t 2 2 1 5 ) 。经过进一步b l a s t 比对，发现该基因编码的蛋白质c 端2 3 7 位点到4 4 9 位点之间的序列与常温菌中的同工酶序列同源性高达9 5 ，而n 端 序列为其特有，且功能尚不明确。本文利用p c r 方法分别构建了全长s o d 及其 c 端蛋( s o d - e r a ) 的重组质粒p e t s o d 、p e t s o d c u t 。在不同温度下，对表达 蛋白的酶活性进行测定，发现：s o d 在2 5 到8 0 c 之间有活性，最适温度为 7 0 ( 2 ，且在其最适温度下，酶活力高达10 0 0u r a g ：s o d c u t 为温度敏感型，最 适温度2 5 ，随着温度升高，酶活性逐渐降低。 对s o d 和s o d c u t 进行原子吸收光谱测定发现该二者均为双性超氧化物歧 化酶。活性中心金属离子既含有m n 又含有f e ，并且f e m n 比值约为5 。进行金 属离子重构及重构酶活性分析发现：s o d 经f e 重构后酶活性提高了7 8 5 ，经 m n 重构后酶活性提高17 ；而s o d c u t 经f e ，m n 重构后活性反而降低，分别 只有原来的7 5 和7 0 5 。 本论文对嗜热脱氮芽孢杆菌n g 8 0 2 超氧化物歧化酶研究结果表明，s o d 蛋白( g t 2 2 1 5 编码) n 端特殊序列可能与耐热机制相关，研究为开发新的嗜热 酶资源奠定了基础。 构 关键词：嗜热脱氮芽孢杆菌生物信息学双性超氧化物歧化酶金属离子重 g e o b a c i l l u s t h e r m o d e n i t r i f i c a n sn g 8 0 2 i sag r a m - p o s i t i v et h e r m o p h i l i c b a c t e r i u m i tc a l le m u l s i f ya n dd e g r a d ec r u d eo i l ，t h e r e f o r eh a sab r o a da p p l i c a t i o n a f t e rw h o l eg e n o m eo fn g s 0 2 s e q u e n c e d , w eu s e da d v a n c e db i o i n f o r m a t i c m e t h o d st oa n a l y z ei t sd n as e q u e n c ea n df o u n da s p e c i a ls o dg e n e ( g t 2 2 15 ) s e q u e n c ea n a l y s i ss h o w e dt h a tt h ec - a m i n oa c i ds e q u e n c e ，f r o m2 3 7t o4 4 9 s i t e ， e x h i b i t sh i g hh o m o l o g y ( 9 5 呦谢t l lo t h e ri s o z y m e h o w e v e rt h en - a m i n oa c i d s e q u e n c eo fs o di su n i u q u e ，n os i g n i f i c a n ts i m i l a r i t yi sf o u n d ，a n dt h ef u n c t i o ni s u n c l e a r w ec o n s t r u c t e dr e c o m b i n a n tp l a s m i d sp e t s o da n dp e t s o d - c u t s o dw a s c o d e db yt h ew h o l e s o dg e n e ，w h i l es o d c u tw a sj u s tt h ec - a m i n oa c i do fs o d 们1 e e n z y m a t i cp r o p e r t i e so fs o da n ds o d - c u tw e r ef u r t h e re x r n a n i n e d ：s o dw a sa c t i v e b e t w e e n2 5 t o8 0 ，a n di t so p t i m u mt e m p e r a t r u ew a s7 0 c ；s o d c u t , o nt h eo t h e r h a n d ，w a sh e a t - s e n s i t i v e ，w h e nt e m p e r a t u r ei n c r e a s e d ，i t sa c t i v i t yd e c r e a s e d t h ee n z y m e sw e r ef o u n dt ob ec a m b i a l i s t i cs o d m na n df ec o f a c t o r sw e r e i n d e n t i f i e da n dq u a n t i f i e db ya t o m a t i ca b s o r p t i o ns p e c t r o s c o p y ，a n dt h er a t i oo f f e m nw a ga b o u t5 b yp e r f o r m i n gm e t a lr e p l a c e m e n t 谢t l lf ea n dm ns t u d i e s ，s o d i n c r e a s e d7 8 5o r17 o ft h ea c t i v i t y , r e s p e c t i v e l y ；s o d - c u tr e c o v e r e d7 5o r7 0 5 o ft h ea c t i v i t y , r e s p e c t i v e l y o u rr e s e a r c hs h o w e dt h a ts o d sn - a n l i n oa c i ds e q u e n c em a yb er e l a t e d t o h e a t - r e s i s t a n tm e c h e n i s m t k sw o r kl a i dt h e b a s i sf o rd e v e l o p m e n to fn e w t h e r m o p h i l i ce n z y m er e s o u r c e s k e yw o r d ：g e o b a c i l l u st h e r m o d e n i t r i f i c a n s b i o i n f o r m a t i c sc a m b i a l i s t i cs o d m e t a lr e p l a c e m e n t i i 目录 目录 摘要i a b s t r a c t i i 第一章引言1 第一节超氧化物歧化酶研究背景。l 1 1 1s o d 的类型1 1 1 2s o d 的分子结构及理化性质。2 1 1 3s o d 基因表达调控- 9 1 1 4s o d 在生命体中的作用。1 0 1 1 5s o d 的应用及修饰1 2 第二节蛋白质的重组表达与纯化的策略1 5 1 2 1 重组蛋白的表达的策略1 6 1 2 2 蛋白纯化的策略1 7 第三节研究目标、内容和创新性2 0 1 3 1 研究目标。2 0 1 3 2 研究内容。2 0 1 3 3 本项工作的创新性2 l 第二章材料与方法2 2 第一节实验材料2 2 2 1 1 菌株2 2 2 1 2 引物与表达质粒2 2 2 1 3 主要酶与试剂2 3 2 1 4 培养基及试剂配制2 3 第二节实验方法2 4 i i l 目录 2 2 1 生物信息学分析。2 4 2 2 2 菌株n g 8 0 2 基因组d n a 的小量提取方法2 4 2 2 3 聚合酶链式反应( p c r ) 2 5 2 2 4 质粒构建方法。2 7 2 2 5 感受态细胞的制备和转化。2 8 2 2 6 重组蛋白在e c o l ib l 2 1 中的小量表达方法2 9 2 2 7 重组蛋白在e c o l ib l 2 1 中的大量表达和纯化方法2 9 2 2 8 蛋白含量的测定方法。3 l 2 2 9 超氧化物歧化酶的酶活性分析( x a n t h i n eo x i d a s e - - c y t o c h r o m ec 法) 3 l 2 2 1o 超氧化物歧化酶的金属离子重构3 2 2 2 1 l 超氧化物歧化酶的原子吸收光谱测定3 2 第三章结果与分析3 3 第一节n g 8 0 2 超氧化物歧化酶基因( g t 2 2 1 5 ) 生物信息学分析结果3 3 第二节p l w l 2 9 6 重组质粒的构建3 8 3 2 1 扩增目的基因s o d 3 9 3 2 2p e t - 2 8 a ( + ) 及s o dp c r 产物双酶切3 9 3 2 3 筛选重组质粒。4 0 第三节p l w l 3 1 9 重组质粒的构建4 0 3 3 1 扩增目的基因s o d - c u t _ 。4 0 3 3 2p e t - 2 8 a ( + ) 及s o d - c u tp c r 产物双酶切。4 l 3 3 3 筛选重组质粒4 2 第四节标准法制定蛋白标准曲线。4 2 第五节n g 8 0 2 基因组编码的超氧化物歧化酶的酶活性分析4 3 3 5 1 重组质粒p l w l 2 9 6 在e c o l i 中的诱导表达条件。4 3 3 5 2 重组质粒p l w l 3 1 9 在e c o l i 中的诱导表达条件4 3 3 5 3 重组超氧化物歧化酶蛋白的纯化。4 5 3 5 4 超氧化物歧化酶蛋白浓度的测定4 7 3 5 5 酶活性测定。4 7 i v 目录 第四章讨论5 0 第一节序列分析与功能的推测5 0 第二节表达系统的选择5 0 第三节外源蛋白的诱导表达与纯化5l 第四节酶活的测定5 l 第五节酶中金属离子分析5 2 第五章结论5 3 参考文献5 4 致谢5 7 个人简历5 8 v 基的酶，它广泛存在于自然界的动物、植物以及一些微生物体内。1 9 3 8 年，m a n n 和k e k l i n 首次从牛血红细胞中分离出含铜的蛋白质；1 9 6 9 年，m ec o r d 和f f i d o v i e h 发现该蛋白有催化超氧阴离子自由基( 0 2 ) 发生歧化反应的功能，因此命名为超 氧化物歧化酶( s u p e r o x i d ed i s m u t a s e ，s o d ，e c l 1 5 1 1 ) 1 1 。s o d 是0 2 的专一清 除剂，故其在维持生物体内0 2 产生与消除的动态平衡中起着重要作用。它可 以防御氧毒性，使生物体能够防御氧化损伤，增强机体自身的免疫力，帮助人 体抵抗衰老。目前对s o d 的分子结构、理化性质及生理功能等方面的研究取 得了很大的进展，我国在s o d 的应用研究上也有了很大的发展，s o d - 已经进 入医药、化妆品、食品等领域【2 】。 s o d 催化的化学反应是： s o d ( 氧化型) + 0 2 。- - * s o d 。( 还原型) + 0 2 s o d 。( 还原型) + 0 2 + 2 h +s o d ( 氧化型) + h 2 0 2 总反应式为：20 2 。+ 2 h + _ h 20 2 + 0 2 1 1 1s o d 的类型 迄今为止人们已从细菌、真菌、原生动物、藻类、昆虫、鱼类、植物及哺 乳动物等生命体内分离得到了s o d 。根据结合的金属离子不同，s o d 主要分为 常见的f e s o d 、m n - s o d 和c u z n - s o d 。这三类s o d 可以根据不同类型s o d 对不同抑制剂的敏感程度不同而加以区分。如氰化物可抑制c u z n s o d ，而不 抑制m n s o d 和f e s o d 。因此，用氰化物可以鉴别c u z n s o d 和m n s o d 以 及f e s o d 。长时间用过氧化氢处理可使c u z n - s o d 和f e s o d 失活，而m n s o d 基本不受影响，此法可以鉴别m n s o d 。鉴别不同s o d 的另一个方法是将s o d 第一章引言 中金属离子去掉，然后分别加入c u z n 、m n 或f e 离子。若加入c u 和z n 离子 后，酶的活力恢复，则为c u z n s o d 。若加入另外两种金属离子使酶蛋白恢复 活力，就是m n s o d 或f e s o d 【3 】o 除上述三种类型外，1 9 7 9 年，l i l i a 等通过原子吸收光谱和电子顺磁共振光 谱在牛肝中发现了c o s o d 。n i s o d 是近年才发现的一种s o d ，主要存在于链 霉菌s t r e p t o m y c e ss p p 中。另外在一些厌氧微生物中发现了既可以利用f e 离子作 为辅基，又可以利用m n 离子作为辅基的s o d ，命名为c a m b i a l i s t i cs o d 。在 s t r e p t o m y c e sc o e l i c o l o r 中还存在性质类似于f e s o d 的f e z n s o d 4 1 。 1 1 2s o d 的分子结构及理化性质 1 1 2 1c u z n - s o d 的分子结构 c u z n s o d 主要存在于真核细胞中。分子结构为二或四聚体，亚基分子结构 由夕折叠组成，几乎没有口螺旋，分子量约为3 2 0 0 0 6 5 0 0 0d a 。由两个亚基 组成，每个亚基约含1 5 0 个氨基酸，并含1 个c u 原子和1 个z n 原子，纯品呈蓝绿色。 研究发现，不同来源c u z n - s o d 在氨基酸序列上存在明显的进化保守性并且序 列相似性非常高。在1 5 0 多个氨基酸组成中，有1 9 个氨基酸残基是完全不变的， 另# b 1 9 个也几乎不变。在1 9 个不变的氨基酸残基中，大多数氨基酸用以构成酶 的活性中心。如在牛血红细胞的c u z n s o d 中，h i s 4 4 、h i s 6 1 和h i s l l 8 与c u 离子 相连，h i s u 、h i s 、h i s 7 8 和a s p 8 1 与z n 离子相连，而a d 4 1 是c u z n s o d 酶活性 所不可缺少的。此外，c y s 5 5 和c y s l 4 4 形成的二硫键对维持c u z n s o d 二聚体的稳 定起重要作用。在已知一级结构的全序列的c u z n - s o d 中，组成活性部位的氨 基酸残基：1 1 1 r 1 3 5 、g l y 3 6 、a l a l 3 8 、g l y l 3 9 、g l y 5 9 、p r 0 6 0 、h i s 6 1 、p h e 6 2 、a s n 6 3 、 l y s l 3 4 、a 唱1 4 1 、a s p 札、h i s m 、h i 、h i s 7 8 和h i s 田，它们在所有c u z n s o d 中 的排列方式都基本上相刚卯。 通过对不同来源c u z n s o d 的氨基酸序列比较后得出：细菌、真菌、高等植 物细胞浆和动物的各种组织中的c u z n s o d 一级结构的同源性都很高。如人与高 等动物、箭鱼、果蝇、植物、真菌及光合自养细菌的同源性分别为8 2 、6 7 、 6 2 、5 6 和1 8 1 6 1 。此外，不同来源的c u z n s o d 具有以下几个方面特征：( 1 ) 与金属辅基相连的氨基酸残基和参与肽链内部二硫键形成部位附近的氨基酸残 基相同；( 2 ) 酶分子的高级结构的形成与甘氨酸残基的大量存在和均匀分布有很 2 第一章引言 大关系；( 3 ) 氨基酸序列中都存在一个位于分子结构表面的超变区，可能与免疫 学性质有关；( 4 ) 羧基末端有一个序列同源性很高的区域，在此区域的a r 9 1 4 1 对酶 的活性发挥起关键作用。 c u z n s o d 每个分子由两个亚基通过疏水作用和氢键缔合成二聚体，肽链内 部由半胱氨酸c 5 5 和c 1 4 4 的巯基构成的二硫键桥对亚基缔合起重要作用。 c u z n s o d 的活性部位是以c u 为中心的一个“疏水口袋 ，口袋底部的c u ：+ 与4 个h i s 和v i 、h 2 0 配位，z n 2 + 与3 个h i s 和1 个a s p 配位。c u 和z n 离子之间通过共同连 接1 个h i s 而构成咪唑桥结构。口袋长1 5a 、宽9a 、深6a ，口袋底部是c u 2 + 和 z n 2 + 存在的部位，底物0 2 就结合于口袋之中。活性中心的h i s 对酶活性至关重 要，该残基受损，酶活性丧失，位于活性中心附近且与c u 2 + 相距6a 的a r 9 1 4 3 ，因 具有正电荷，是0 2 进人活性中心的诱导者，并提供h + 以加快歧化速度。如果 该酶残基被修饰，大部分正电荷消失，不利0 2 的进人，酶活性降低9 9 。c u 寸 和z n 2 + 对活性中心的作用亦不同，c u 2 + 是必需的，任何金属取代c u + 都可使酶失 活，而z n 2 + 被c 0 2 + 、h 9 2 + 、c d 2 + 取代而不影响活性 7 1 。 初步的x 射线晶体结构分析表明c u z n s o d 每个结晶学不对称单位 c u z n s o d 是由两个酶分子( 4 个亚基) 组成，每个亚单位包含有一个c u 2 + 和一个 z n 2 + ，通过链内的二硫键稳定其结构，而不是共价键结合。该酶的两个亚基结构 上是相同的，整个结构由b 片层组成，几乎没有a 螺旋成分。整个结构特征是 由八股反平行的肛折叠片围成的圆桶状结构，称之为f l - b a r r e l ，其一侧尚有两个 无代表性结构的环( 1 0 0 p ) 。由x 一射线结构分析计算出整个结构含5 的仅螺旋， 4 5 的反平行伊折叠结构。 图1 1c u z n s o d 活性中心结构 1 1 2 2f e s o d 和m n s o d 的分子结构 3 第一章引言 一般来说，f c s o d 是较原始的一种s o d 类型，呈黄褐色，主要存在于原 核生物和某些植物的叶绿体中。分子结构为二或四聚体，分子量约为4 2 0 0 0 - - 8 5 0 0 0 d a 。由2 个亚基组成，每个亚基各含1 个铁。m n - s o d 是在f e - s o d 基础 上进化而来的一种蛋白类型，呈紫色或紫红色，主要存在于原核生物和真核生 物的线粒体中，在高等植物中的过氧化物酶体中也有。分子结构为二或四聚体， 分子构象呈口螺旋，其分子量随来源不同而异。来自原核细胞的m n s o d 由两 个亚基组成，每个亚基各含1 个锰，分子量约为4 2 0 0 0d a ：来自真核细胞线粒 体的m n - s o d 由4 个亚基组成，每个亚基各含1 个锰，分子量约为8 5 0 0 0d a 。 任何来源的b i n s o d 和f e s o d 的一级结构同源性都很高，均不同于 c u z n - s o d 的序列，可见它们来自同一个祖先。高等植物线粒体、叶绿体的s o d 序列类似于原始细菌的s o d ，如人m n s o d 和鼠、大肠杆菌的m n s o d 的同源 性分别为9 4 和4 3 t 8 1 。另外，m n s o d 和f e s o d 形成活性中心、催化中心及 与金属相连的氨基酸残基都是保守的，而且与金属m n 或f e 相连的氨基酸残基 也完全一致，并且m n s o d 和f e s o d 都富含酪氨酸和色氨酸，不含半光氨酸【5 l 。 从晶体结构看，m n - s o d 和f c s o d 在活性中心和金属一配体簇附近的结构 十分相似。每个亚基包含两个结构域，一个结构域由三个a 螺旋组成，另一个 结构域由三个a 螺旋和一个夕折叠构成。金属离子结合位点就在这两个结构域 之间。围绕活性中心的是几个保守的芳香族氨基酸，其中有3 个t y r 、3 + t r p 和2 个p h e ，都在距金属离子l m m 的范围内 9 1 。 在一些厌氧微生物中发现了既可以利用f e 离子作为辅基，又可以利用m n 离 子作为金属辅基的s o d ，命名为c a m b i a l i s t i cs o d ( c a m b i a l i s t i e ，意为变化的，可 变的) ，它们所产生的s o d 依赖于氧的存在。这种s o d 进行f e ，m n 的替换不影响 酶的活性，是能同时接受f e 或m n 的一类特殊的s o d 。p r o p i o n i b a c t e r i u m s h e r m a n i i 和p r o p i o n i b a c t e r i u mg i n g i v a l i s q 了的s o d 均为上述结构，对c 锄b 试i s t i cs o d 进行 研究后发现，依据其一级结构同源性以及金属离子活性位点附近的氢键结构不 同，可将c 锄b i a l i s t i cs o d 分为两类，p r s h e r m a n i i 中的s o d 一级结构与m n s o d 四聚体相似，而p r g i n g i v a l i s 中的s o d 一级结构与f e s o d - - 聚体相似【l o l 。 通过对结构详细分析得到f e s o d 、m n s o d 、c a m b i a l i s t i cs o d 均具有以下 结构特点：( 1 ) 每个亚基主链形成两个区域，n 端区为2 个长的反平行螺旋，c 端 区为一个含有拧成3 股夕折叠片的口+ 夕的结构；( 2 ) 连接两个结构域的c i s p r o 残基以及夕s h e e t 交叉连接附近的g l y 和p r o 对保持高级结构和发挥酶催化功能起 4 第一章引言 重要作用；( 3 ) 维持两个区域间连接的作用力包括a r g 与酸性支链间盐键、界面间 强烈的疏水作用和至少1 0 个氢键的作用；( 4 ) 四聚体结构具有以下对称关系：二 聚体亚基之间具有晶体学二次轴对称关系，在二聚体内部之间具有非晶体学二 次轴的对称性；( 5 ) 在活性部位，每个m n 或f e 原子都具有一个五配位的三角双锥 构型，其中一个轴向位置为h 2 0 2 ，其它4 个配位基为3 个h i s 和l y a s p ，其中2 个 h i s 和a s p 位于赤道平面，而另l + h i s 的咪唑基占据另一个轴向位置；( 6 ) 活性中 心处于一个主要由疏水氨基酸残基组成的疏水“篮子 里；( 7 ) 两个亚基链能形 成一个通道，该通道入口处f l 了a r g 、m e t 、a s n 等残基组成，经p h e 、t y r 、a s n 和 l y s 残基最终到达金属辅基附近的t y r 和h i s 残基，上述通道是底物接近金属离子 的必经之路【l l 】。 尽管f e s o d 和m n s o d 在一级结构及高级结构上显示极大的同源性，但它 们之间仍然存在很大差别。比较f c s o d 和m n - s o d 的氨基酸序列后发现，有5 个 构成活性中心的特征性氨基酸对f e s o d 或m n s o d 是特异的：在m n s o d 中，它 们分别是g l y 7 6 、g l y 7 7 、p h e 斛、g i n l 5 4 、a s p l 5 5 , 而在f e s o d q b ，它们分别为砧a 7 6 、 g i n 7 7 、t y 烈、a l a l 5 4 和i g l y l 5 5 。另外，有1 7 个对m n s o d 或是f e s o d 来说是非常 保守的氨基酸残基，它们或与活性位点有关，或是与其形成次级结构有关【1 2 1 ；两 种s o d 对一些化合物的敏感性不同，如f e s o d 对h 2 0 2 敏感而m n - s o d 对h 2 0 2 不 敏感；f e s o d 可以结合m n 离子，m n s o d 也可以结合f e 离子，但仅在结合原有 的金属离子时才会显示最大的催化活性；同一生物来源的f e s o d 和m n s o d 的 免疫学特性也不同。因此，通过对一级结构的比较、对酶中金属离子测定或借 助于一些生化试剂检测可以区分两种s o d 。 大多数来源的f e s o d 含有两个相同的亚基，且两亚基之间无二硫键的共价 连接，因为在巯基乙醇存在的条件下，其表观分子量不变。b a r r y 等发现，二聚 体的每一单体含有2 个结构域，分别为氨基酸残基1 4 0 组成的小结构域( 螺旋 a ) 及6 0 - 1 9 0 残基组成的大结构域。小结构域含5 个a 螺旋，并对活性中心提 供单一配基h i s 2 6 ；大结构域由5 个a 螺旋以及由这5 个a 螺旋所包围的含3 个 折叠槽的反平行夕折叠组成，并同时为活性中心f e 提供3 个配基h i s 7 4 ，h i s l 6 0 及a s p l 5 6 ；螺旋a 与球形大结构域相对分离，并通过两端的伸缩肽与蛋白质其 它部分相连；两个结构域通过含2 0 个残基的可伸缩性无规则卷曲相连。大结构 域所含的5 个螺旋( b - - - f ) 中，螺旋b 位于蛋白质内部，主要由非极性氨基酸残 基组成，该螺旋为f e 3 + 提供一个h i s 7 4 配基，螺旋c 和d 为位于蛋白质外部的两 第一章引言 性分子螺旋束，螺旋e 和f 由最后2 0 个残基组成，每个螺旋含1 0 个残基，两 个螺旋均相对不溶于极性溶剂，因为它们主要由芳香族氨基酸和非极性氨基酸 组成，位于结构域内部，螺旋e 含有蛋白质序列中仅有的2 个a r g ，其中a r 9 1 6 7 是稳定二聚体结构的重要氨基酸残基。大结构域的伊片层大多由相对较小的非 极性残基如a l a 和v a l 组成，极具亲水性，片层的两端由酶活性中心起重要作用 的残基锚定，位于f e 的开放结合部位的一对t r p 进入第一个折叠槽。在第三个 折叠槽的末端发现固定良好的活性部位t r p l 5 8 和f e 的另外两个配基a s p ”6 和 a s p l 6 0 。另外在片层中发现一对罕见的骨架碳之间的氢键，使得片层相互连接在 一起。但是，处于高自旋态的三价铁f e 3 + 与蛋白配基的结合不是对称的，其中三 个配基在一个平面上，它们是h i s 7 4 ，a s p l 5 6 和h i s l 6 0 ，而第四个配基h i s 2 6 则为 金子塔的塔顶【5 1 。 图1 2f 争s o d 及其三维结构图 m n s o d 在真核生物中多为四聚体，在原核生物中为二聚体，分子中含有 较高程度( 3 2 ) 的口螺旋结构，较少伊折叠片段，整个结构比较紧凑。每个亚基 含有两个结构域，其n 端序列如f e s o d 一样形成一个小结构域，小结构域由3 个 a 螺旋组成。另一个结构域由3 个a 螺旋和1 + p - 折叠组成，m n 3 + 结合位点就在这 两个结构域之间。在m n s o d 中，8 3 位和1 6 0 位的氨基酸在空间结构上距离很近， 为了适应这个结构，m n s o d 中与1 6 0 位g l n 相邻的8 2 ，8 3 位氨基酸是体积较小的 o l y ，其与金属锰相连接的氨基酸) j h i s 2 6 、h i s 8 7 、h i s l 8 1 和a s p l 8 5 障l 。中心金属 m n 3 + 具有五配位的三角双锥结构，其中3 个配位基位于赤道平面，两个轴向位置 上分别为一个水分子和一个为h i s 2 8 的咪唑基。酶的活性部位在一个主要由疏水 残基构成的环境里，两个亚基链组成一个通道，构成了底物或其它内界配体接 近m n 2 + 离子的必经之路【2 l 。 6 第一章引言 图1 3m n - s o d 三维结构图 1 1 2 3 不同s o d 的理化性质 s o d 是一种酸性蛋白，在酶分子上共价连结金属辅基，对p h 、热和蛋白酶 水解等特性比一般酶稳定，s o d 的主要理化性质见下表。 表1 1 三类常见s o d 的理化性质比较【1 3 】 2 n - s o dd ms o d 项目 o 氏一s o n 一 主要存在部位 嘉簿鬈霉器耋覆零墨薹署器举嚣麓器袭墓荐革 奠色 金属离子组成 亚薹种类及敛量 亚基相对分子t 分子杓象 氯基酸组成特点 苴绿色 2 个c u l + 和2 个z n l + 2 个反4 个相同的亚基 1 60 0 0 p 曩旋，争折叠( 圭) g l y ( 多) t y r 翱t r p ( 少或没有) 奠褐色 s - 4 个& 蚪 2 个或1 个相同的亚基 2 30 0 0 争折叠。- 螺旋( 主) t y f 和t r p ( 多) 锄( 没有) 紫红色 2 - , 4 个m n 2 个或4 个相网的亚基 2 30 0 0 哳叠巾螺旋( 主) 伽和t r p ( 多) c y i ( 投有) 吸收 可见 2 5 8i 孤 2 8 0 哪2 8 0 岫 光谱 蘩外 6 8 0 眦3 5 0n m 4 7 5n m 。 k c n ( im o i l , )抑翻 否否 h l o l ( 1t o o l l )抻翻 抑制番 i l mi _ - - - _ _ - - l _ _ - i _ _ - - _ - - - - - - - _ _ _ _ - _ _ _ _ - _ _ _ l _ - - _ - _ _ - - _ - - - _ - - _ _ _ _ - - - 。- 1 一 从上表可以看出，m n s o d 、f e s o d 的结构特征是不含半光氨酸，含有较 多的色氨酸和酪氨酸，因此紫外吸收光谱类似一般蛋白质，在2 8 0 n m 附近有最 大吸收峰。m n s o d 的可见光谱在4 7 5 n m 处附近有最大吸收，f e s o d 在3 5 0 n t o 7 第一章引言 处有最大吸收，这都反映了所含金属离子的光学性质f l 引。 1 1 2 4s o d 活性测定 s o d 的活性测定方法一般分直接测定法和间接测定法。常见的直接测定方 法有e p r 法、脉冲辐解法、超氧化钾法等。直接法需专用的仪器设备，因此应 用受到限制。间接测定法是通过某种能产生0 2 的物质或另一种0 2 的清除 剂，测定特征波长下的光吸收变化速率，计算s o d 对这个反应的抑制程度从而 间接定量s o d 活性。常见的间接测定方法有黄嘌呤氧化酶一细胞色素c 法、邻 苯三酚自氧化法、黄嘌呤氧化酶- n b t 法、化学发光法等。 黄嘌呤氧化酶一细胞色素c 法测定s o d 的原理：在有氧的条件下，黄嘌呤 氧化酶催化黄嘌呤发生氧化反应生成尿酸，与此同时产生0 2 ，0 2 将氧化型 细胞色素c 还原为还原型细胞色素0 ，后者在5 5 0 n m 处有最大吸收。s o d 可催 化0 2 发生歧化反应，从而抑制氧化型细胞色素c 还原速率。酶活性单位定义 为：在一定条件下，3 m l 的反应液中，每分钟抑制氧化型细胞色素c 还原速率达 到5 0 时所用的酶量定义为一个活力单位。 邻苯三酚法测定s o d 活性的原理是：邻苯三酚在碱性条件下，能迅速自氧 化，生成在4 2 0 n m 处有强烈光吸收的中间产物，并同时释放出0 2 ，s o d 是专 一以0 2 。为底物的金属酶，在有质子的介质中，它能迅速将0 2 歧化，产生 0 2 和h 2 0 2 ，从而阻止了中间产物积累，据此可测定s o d 的活性。酶活力单位 定义为：在一定条件下，l m l 的反应液中，每分钟抑制邻苯三酚在4 2 0 n m 波长 处的自氧化速率达5 0 时的酶量定义为一个活力单位。 氮蓝四唑( n b t ) 光还原法测定s o d 的原理是：在光照条件下，核黄素和 四甲基乙二胺反应产生超氧阴离子自由基0 2 ，0 2 使n b t 还原为蓝紫色的 化合物甲躜，甲脱在5 6 0 n m 处有最大光吸收。但由于s o d 与n b t 竞争0 2 从而降低n b t 还原为甲臌的速度。所以，试液颜色深浅与s o d 活性有关。以 抑制n b t 光还原达5 0 时的酶量作为1 个酶单位。 羟胺发色法测定s o d 的原理：邻苯三酚自氧化产生的o2 与羟胺反应生成 亚硝酸盐，在酸性条件下，亚硝酸盐与氨基苯磺酸和n 甲萘基二氨基乙烯反应 生成红色化合物，而s o d 抑制此反应，根据抑制率高低计算活性。 化学发光法测定s o d 的原理：在有氧条件下，黄嘌呤氧化酶催化黄嘌呤或 次黄嘌呤生成尿酸和0 2 ，0 2 与化学发光剂鲁米诺( l u m i n 0 1 ) 反应，使发光 8 第一章引言 剂受到激发成为激发态，当它返回基态时就向外发光即化学发光。s o d 可抑制 发光速率，根据抑制率高低计算活性。该法具有反应快、分析精确、灵敏度高、 专一性强、样品用量少等优点，但需要高灵敏度的精密发光测量仪器。 1 1 3s o d 基因表达调控 s o d 的基因表达调控有以下几个特点【1 4 i 。 ( 1 ) 三种酶都表现出各自特有的调控形式，并且相互影响，在生命体的抗氧 化过程中起着重要的作用。 s o d 在生命体中的表达因类型不同而异，c u z n - s o d 和f e s o d 大多数是 组成型表达，这两种酶量都比较稳定。如微生物体内的f c s o d 在整个生长阶段 都比较稳定，只有当微生物处于氧化胁迫时f e s o d 的表达量才升高。m n s o d 的表达方式与c u z n s o d 和f e s o d 不同，主要是诱导表达。p s e u d o m o n a s p u t i d a 在培养基的f e 不足，或菌体处于静止期时，m n s o d 才开始转录。在加入 m n 的培养基中，m n s o d 在整个生长时期都能检测到。 在生命体中，一种类型s o d 的表达受抑制，会导致其他类型s o d 表达量的 增加。如当n i 缺少时，n i s o d 的转录受到抑制而无法表达，同时其他的s o d 就会受到诱导以此弥补损失。当培养基中缺少f e 时，f e s o d 的表达受到抑制， 同时m n s o d 的表达受到诱导。h e r o u a r t 等发现当提高臭氧含量时番茄质体中 f e s o d 的转录量降低，而细胞c u z n s o d 的转录提高了1 2 倍【l 引。 ( 2 ) 不同来源的s o d 的基因表达调控有不同的影响因子。原核生物s o d 的 基因表达调控与生长条件、所处环境有关，而真核来源的s o d 的基因调控则与 植物或动物的生长发育阶段、体内激素有关。并且真核和原核s o d 基因的调控 受到多个因素同时作用活某一主导因子的影响。 微生物来源的s o d 的表达与微生物的生长阶段和营养条件有直接的关系。 p s e u d o m o n a s p u t i d a r 扣存在两种s o d 基因f f l j f e s o d 和m n s o d 。在正常k b 培养基 上，f e s o d 在对数期表达量最高，在静止期下降。但如果在静止期加入f e 则 f e s o d 的表达量又升高。如果正常培养基上加入f e ，在整个生长期f e s o d 都 维持较高的水平。同样c o r t e z 发现r h o d o b a c t e rc a p s u l a t u s 的f e s o d 在完全缺氧 或半氧气时表达量很低，而当完全暴露在氧气环境时表达量提高了1 0 倍【1 6 1 。酵母 的c u z n s o d 的表达受c u 的调控，当增j o l a c u 时，发现c u z n s o d 的转录明显升 9 第一章引言 高。 植物来源的s o d 的表达则与植物的生长发育阶段有关，也可能与植物激素 的调节有关。当植物处于逆境胁迫时植物激素和活性氧共同调节s o d 的表达。 c r o w e l l 和a m a s i n o 发现f e s o d 的表达与叶片是否处于伸展期有关。他们发现在 大豆叶片的伸展初期，去除细胞因子或植物生长因子，贝, l j f e s o dm r n a 迅速降 低，而在已经伸展的叶片中不存在此现象【1 7 i 。 动物来源的s o d 的表达则与动物体内的激素水平和细胞因子有关。s u g i n o 研究小鼠的黄酮细胞发现该细胞c u z n - s o d 和m n s o d 的表达受到p i 也和 r p l s 信号的刺激。地塞米松则显著降低黄酮细胞中的c u z n s o d 和m n s o d r n r