（有机化学专业论文）链霉菌streptomyces+sp103发酵液抗菌活性的物质基础研究.pdf

摘要 摘要 研究表明，有些植物内生真菌由于长期与宿主共处，有可能产生与宿主相同或相 似的活性物质，也可能产生有利于增强宿主抵抗力的活性物质。因此，本文以黄山采集 来的千层塔为原料，进行了内生真菌的分离、活性菌株的筛选以及初步探讨了其生物 活性的物质基础，具体研究内容如下： ( 1 ) 从千层塔中分离到8 7 株内生真菌，其中6 7 株菌株的发酵液对四种病原真 菌( 苹果轮纹、苹果炭疽、小麦赤枯、油菜菌核) 有抑制作用，其中，对小麦赤枯、 苹果轮纹、苹果炭疽和油菜菌核具有抑制作用的菌株所占的比例分别为：4 2 5 、 4 0 2 、6 0 9 和5 7 5 。 ( 2 ) 选取活性较好的菌株s t r e p t o m y c e ss p l 0 3 ，用发酵罐发酵，将发酵液离心， 分为发酵液和菌丝体，采用生长速率法测定了其对病原真菌的相对抑制率。发酵液对苹 果轮纹和油菜菌核的相对抑制率最好，几乎看不到菌丝生长，其相对抑制率为1 0 0 ； 对苹果炭疽和小麦赤枯的相对抑制率也分别为8 3 4 和8 1 3 。 ( 3 ) 采用柱层析、薄层层析等分离手段对s t r e p t o m y c e ss p l 0 3 发酵产物的不同部 位进行分离，并追踪各部分的生物活性，活性部位主要为8 0 乙醇部分和乙酸乙酯萃取 部分( c 3 和d 3 ) 。 ( 4 ) 通过硅胶柱层析、薄层层析、凝胶( s e p h a d e xl h - 2 0 ) 层析等方法，从发酵液 中分离到了3 个化合物，通过1 h n m r 、g c - m s 等光谱技术鉴定了其中的3 种化合物，分 别为苯甲酸苄酯、山萘酚、7 h - 6 ，9 a - m e t h a n o - 4 h - c y c l o p e n t a 9 ，1 0 c y c l o p r o p a 5 ，6 c y c l o d e c a 1 ，2 - d - 1 ，3 - d i o x i n 一1 3 一o n e ，6 ，6 a ，7 a ，8 ，9 ，1 2 ，1 2 m 1 2 b - o c t a h y d r o - 1 2 ，1 2 a d i h y d r o x y 一2 ，2 ，7 ，7 ，9 ，11 - h e x a m e t h y l ， 6 r - ( 6 m p h a ，6 a m p h a ，7 a m p h a ，9 a l p h a ，9 a a l p h a ，1 2 b e t a ，1 2 a b e t a ，1 2 b a l p h a ) 】。 关键词干层塔内生真菌链霉菌山萘酚 a b s t r a c t a b s t r a c t s o m er e s e r c h e s i n d i c a t e dt h a ts o m ee n d o p h y t i cf u n g it h a tc o e x i s tw i t ht h e i rh o s t sm a y c r e a t es a m eo rr e s e m b l ea c t i c v es u b s t a n c e sw i t ht h e i rh o s t s t h e ya l s om a yc r e a t ea c t i v e s u b s t a n c e st h a tw e r ea b l et ob o o s tu pt h e i rh o s t s r e s i s t i v i t y s ow ec h o s et h eh u p e r z i a s e r r a t ag a t h e r e df r o mh u a n gs h a na sm a t e r i a lt os e p a r a t ee n d o p h y t i cf u n g ia n ds e l e c ta c t i v e s t r a i n sa n ds t u d yt h ec h e m i c a lc o n s t i t u e n t sa n d a n t i - e n d o p h y t i cf u n g ia c t i v i t ya sf o l l o w s ： ( 1 ) 8 7s t r a i n sw e r es a p e r a t e df r o mh u p e r z i as e r r a t aa n d6 7 s t r a i n sh a da n t i - e n d o p h y t i c f u n g ia c t i v i t yo nb o t r y o s p h a e r i ab e r e n g e r i a n ad en o t rg l o m e r e l b a c i - g u l a t e ，f u s a r i u m g r a m i n e a r u ms c h w ，s c l e r o t i n i s c l e r o t i o n u m t h ep e r c e n t so ft h es t r a i n so fi n h i b i t o r ye f f e c t a r e 4 2 5 ，4 0 2 ，6 0 9 a n d5 7 5 ( 2 ) t h eb e t t e rs t r a i nw a sf e r m e n t e dw i t hf e r m e n t e r t h ep r o d u c t i o nw a sc e n t r i f u g e da s f e r m e n t a t i o na n dm y c e l i u mt od e t e r m i n et h er e l a t i v e l yi n h i b i t i o nr a t i oo ne n d o p h y t i cf u n g i b yg r o w t h r a t e a s s a y t h e f e r m e n t e dp r o d u c t i o nh a st h eb e s t i n h i b i t o r y a c t i o no n b o t r y o s p h a e r i ab e r e n g e r i a n ad en o ta n ds c l e r o t i n is c l e r o t i o n u m ，i t sr e l a t i v e l yi n h i b i t i o n r a t i oa r e1 0 0 t h er e l a t i v e l yi n h i b i t i o nr a t i oa r e8 3 4 a n d8 1 3 o ng l o m e r e l b a c i g u l a t e ， f u s a h u mg r a m i n e a r u ms c h w ( 3 ) t h ef e r m e n t i o n f r o m s t r e p t o m y c e s s p l 0 3w a s s a p e r a t e db y s i l i c a g e l c h r o m a t o g r a p h ya n dt h i nl a y e rc h r o m a t o g r a p h yt od e t e c t e dt h eb i o l o g i c a la c t i v i t y , t h ea c t i v e p o r t i o n sa r em a i n l yi n8 0 e t h a n o la n dc h l o r o f o r m ( c 3a n dd 3 ) ( 4 ) t h r e ec o m p o u n d sw e r ei s o l a t e df r o mf e r m e n t a t i o nf r o ms t r e p t o m y c e ss p10 3b yu s i n g s i l i c ag e lc h r o m a t o g r a p h y , c h r o m a t o g r a p h ys e p h a d e xl h 一2 0m e t h o d s t h e yw e r ei d e n t i f i e d b ys p e c t r o s c o p i cm e t h o d s ( 1 h n m r 、g c m s ) ，a n dt h e i rc h e m i c a ls t r u c t u r ew e r ee l u c i d a t e da s k a e m p f e r o l ，b e n z y lb e n z o a t ea n d7 h - 6 ，9 a - m e t h a n o - 4 h - c y c l o p e n t a 9 ，10 c y c l o p r o p a 5 ，6 c y c l o d e c a 1 ，2 - d 】- 1 ，3 - d i o x i n - 1 3 一o n e ，6 ，6 a ，7 a ，8 ，9 ，1 2 ，1 2 a ，1 2 b o c t a h y d r o - 1 2 ，1 2 a - d i h y d r o x y - 2 ，2 ，7 ，7 ， 9 ，1 1 一h e x a m e t h y l 一， 6 r 一( 6 a l p h a ，6 a a l p h a ，7 a a l p h a ，9 a l p h a ，9 a a l p h a ，1 2 b e t a ，1 2 a b e t a ，1 2 b a l p h a ) k e yw o r d s ：h u p e r z i as e r r a t ae n d o p h y t i cf u n g i s t r e p t o m y c e sk a e m p f e r o l i i 缩略语 缩略语 i i i 河北大学 学位论文独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行的研究工作及取得 的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得河北大学或其他教育机构的学位或证书 所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确 的说明并表示了致谢。 作者签名： 垒曼至 日期：乏! 兰年乙月旦日 学位论文使用授权声明 本人完全了解河北大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国 家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布 论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 本学位论文属于 l 、保密口，在年月日解密后适用本授权声明。 2 、不保密口。 ( 请在以上相应方格内打“ ) 作者签名： 导师签名： 日期：之! 圭年垒二_ oh 日期：墨堑年厶月型一e l 保护知识产权声明 本人为申制蝌学位所提交为潞菌r 叫哕矿，李缀瓣淼 论文，是我个人在导师母嘲知导并与导师合作卡取得的研究成果，研究工作及取得 7 的研究成果是在河北大学所提供的研究经费及导师的研究经费资助下完成的。本人完全 了解并严格遵守中华人民共和国为保护知识产权所制定的各项法律、行政法规以及河北 大学的相关规定。 本人声明如下：本论文的成果归河北大学所有，未经征得指导教师和河北大学的书 面同意和授权，本人保证不以任何形式公开和传播科研成果和科研工作内容。如果违反 本声明，本人愿意承担相应法律责任。 声明人：苎兰。翌蠢日期：艺! 生年二月2 日 作者签名： 导师签名： 日期：年月日 日期：2 甜乙月卫日 第一章内乍真菌综述 曼曼! 曼曼曼! 曼曼曼! ! 蔓! ! 曼! ! 曼曼皇! 皇! 曼曼曼曼曼曼苎曼曼_； 一i i i i i 曼曼! ! 曼! 曼皇! 曼! 曼! 曼曼曼皇曼曼鼍皇! 曼! ! 曼曼曼曼 第一章内生真菌综述 内生真菌( e n d o p h y t i cf u n g i ) 是指一类在其部分或全部生活史中存活于健康植物 组织内部，而不使宿主植物表现出明显感染症状的微生物【1 捌。 内生菌是一个生态学概念，而非分类学单位，是植物微生态系统的天然组成部分。 自1 8 9 8 年g u e r i n 等前人从黑麦草( l o l i u m t em u l e n t u m ) r = p 分离出内生菌以来，已经有百 余年的历史了，研究发现，内生真菌次生代谢产物具有抗肿瘤【3 1 、抗病【4 1 、抗虫【5 ，6 】等 活性。近2 0 年来，在内生菌的多样性，对宿主植物影响的生理生化机制、从内生真 菌中筛选次生代谢活性物质的研究非常活跃，并且已取得了很多进展。 1 1 内生真菌研究进展 内生真菌具有丰富的生物多样性。目前，已经从植物体中分离到了属于细菌、 酵母菌、放线菌和丝壮真菌的多种内生菌，并发现许多新种。内生菌长期生活在植物 体细胞内或细胞间隙这样一个特殊环境中，并与寄主协同进化，在演化过程中与宿主 植物形成共生关系；一方面内生菌可以从宿主植物中吸收营养，并得到保护；另一方 面，内生菌能够促进宿主植物生长发育，增强宿主植物对生物威胁( 食草动物、昆虫、 病原菌) 及非生物威胁( 高温、干旱、高盐) 的抗逆性。内生菌对宿主植物的生物学 作用的物质基础，在于其自身合成的抗生素、激素、酶抑制剂、诱导物等多种活性物 质或通过诱导物( 葡萄糖、糖蛋白、小肽、脱乙酰几丁质、花生四烯等不饱和脂肪酸) 胁迫宿主植物合成的萜类、生物碱、皂苷、黄酮、酚类和多炔类等次生代谢产物。这 些次生代谢产物的多样性是导致内生菌生物学作用多样性的根本原因，也是天然药物 研究者的兴趣所在。 从天然产物中筛选生物活性成分或先导化合物是研究创新药物的有效途径之一。 在过去的2 0 年，约有一半的药物来源于天然产物或天然的先导化合物，约5 的药物 为天然化合物的直接应用。研究者发现，特殊生念环境下的微生物与特殊的次生代谢 产物有紧密的关系。因此，活性物质的筛选中将更多的注意力集中在具有特殊生境的 生物上。内生真菌种类及数量庞大，分布的宿主植物范围广，其代谢途径及代谢产物 化学类型的多样性不仅与其种属有关，还与其所处的微生物环境有关。据d r e f u s s 和 洞北大学理学硕十学何论文 c h a p e l a 估计，约有一百万至数百万种内生真菌存活于2 7 0 0 0 0 至4 0 0 0 0 0 0 种微管植物 细胞内或细胞间隙这样的特殊环境中。由于宿主植物不同，其所处的微生态系统的多 样性，加上宿主植物本身所处生态环境的多样性，因而其次生代谢产物也具有丰富的 多样性，能够为天然药物的研究提供丰富的潜在资源。 1 9 9 3 年s t i d r l e 7 】首次从短叶红豆衫( t a x u sb r e v i f l i a ) 中分离到一株能合成抗癌物 质紫杉醇的内生真菌( t a x o m y c e sa n d r e a n a e ) 表明有的内生真菌合成和宿主植物相同 或相似的活性成分的能力。这一发现掀起了一场从药用植物中分离内生真菌的热潮， 为人类解决某些药用植物生长缓慢、资源紧缺等因素带来的药源紧张和生态破坏问 题，利用植物内生真菌进行工业化发酵生产某些重要天然药物提供了新的思路。近年 来，先后从数十种药用植物中也分离得到了和宿主植物相同或相似的其他活性成分。 例如，从长春花中内生真菌分离得到长春新碱类似物【8 】、从德国鸢尾内生真菌分离得 到鸢尾酮【9 】等。 药用植物内生菌的研究还发现，有的内生菌不但可以自身合成药物活性成分，还 具有促进宿主植物合成活性成分的能力。例如，w a n g 等【1 0 】从中国红豆衫( t a x u s b r e v i f l i a ) 中分离到一株内生真菌，可使红豆衫悬浮培养细胞紫杉醇的产量提高两倍， 这对于天然药物的研究具有特别的意义。江东福等【l l 】在内生菌和龙血树血竭关系的研 究中，发现内声真菌对龙血树血竭形成具有很强的促进作用。陈晓梅等【1 2 悃4 种纯培 养的内生真菌分别与金线莲无菌苗进行共培养，发现内生真菌对金线莲生长及多糖合 成都具有明显的促进作用。金线莲的干重最高增加了4 9 5 ，多糖含量增加了一倍左 右。关于内生真菌独立合成活性物质的遗传因素，以及促进植物合成活性成分的分子 机理，还有待进一步研究。 内生菌活性成分的筛选有两条思路：一是根据部分内生真菌具有合成和宿主植 物相同或相似活性成分的能力特点，从药用植物中寻找具有合成确定化合物的内生 菌，常用的方法是对分离得到的内生菌培养液提取物通过色谱技术、单克隆抗体免疫 检测等手段来确定该内生菌是否有产生目的化合物的能力。这一思路目标明确、针对 性强、工作量相对较小，是目前从内生菌中筛选活性物质的主要方法，采用这种方法 已经从多种资源缺乏的药用植物的内生菌中分离得到了和宿主植物相同或相似的活 性物质。当然，这种思路具有一定的偶然性，因为不能证实所有的植物中都存活着具 第一章内乍真菌综述 有合成和宿主植物相同或相似活性物质的内生菌。二是按照传统的化合物分离纯化鉴 定的思路，寻找未知但具有特定活性的化合物。首先是按照目的选择不同的筛选模型 进行活性菌株的筛选。其次，是对筛选出的活性菌株发酵培养、分离纯化活性物质， 再对活性物质进行理化研究及结构鉴定。 1 2 内生菌药用活性物质 1 2 1 抗肿瘤物质类 紫杉醇( t a x 0 1 ) 是由w a n i 等【1 3 1 从短叶红豆衫中分离的一种二萜类生物碱，具有 独特的抑制微管解聚和稳定微管的作用，对卵巢癌、乳腺癌、肺癌、食道癌、前列腺 癌以及直肠癌均有疗效，是目前从植物中发现的最重要的抗癌药物之一。由于紫杉属 植物中紫杉醇含量极低，加之紫杉属植物生长极其缓慢，自然资源非常缺乏。1 9 9 3 年 美国学者s t i e r l e 等【7 1 首次从短紫杉( t a x u sb r e v i f o l i a ) 的韧皮部中分离出一种新的内生 真菌( t a x o m y c e sa n d r e a n a e ) ，可在半合成培养液中产生紫山醇和紫杉烷类化合物。这 一发现为用微生物发酵法产生紫杉醇以解决紫杉醇药源危机提供了一条新途径，并成 为从药用植物中分离内生菌热潮的开端。至今，己从喜马拉雅红豆衫( t a x u s w a l l i c h i a 刀口) 【渊、南方红豆衫( t m 口r i r e i ) u s 、中国红豆衫( zc h i n p n s i s ) p 6 1 、东北 红豆衫( zc u s p i d t a ) 1 7 】、欧洲紫杉( z 施c 勉) 【1 8 1 、云南红豆衫( 妣y u n n a n e n s 厶) 1 9 】 等红豆衫属植物中分离到能够合成紫杉醇类化合物的内生菌，表明产生紫杉醇的内生 菌普遍存在于紫杉属植物中。另外，还有从落羽松( t s x o d i u m 如砌“，z ) 【2 0 1 、榧树( t o r r e y a g r a n d i f o l i a ) 2 1 1 、银杏( g i n k g ob i l o b a ) 【2 2 1 、秃柏( t a x o d i u md i s t i c h u m ) 2 3 1 以及一种 松树( w o l l e n i sn o b i l i s ) 2 4 】中分离到能产生紫杉醇的内生菌，显示了紫杉醇产生菌宿 主的多样性，这些内生菌分别属于紫杉霉属、镰刀霉属、交链孢属、盘多拉毛霉属、 髓霉属、黑团孢霉属、无孢类群、瘤座孢属、多节孢属、侧孢座腔菌属、链格孢属、 丝核菌属、茎点霉菌属、膝葡孢属等【2 5 1 。许多学者在分离得到产生紫杉醇内生菌的基 础上，迸一步做了紫杉醇高产菌株的筛选工作。c a r u s o 2 6 1 从紫杉属的不同种植物中分 离到能产生紫杉醇的内生菌2 5 种，紫杉醇含量最高可达到5 0 1 0 0n g l 。k i m 等【2 7 1 从银杏上分离到的链格孢属( a l t e m a r i a ) 的紫杉醇最高含量达到2 6 0n g l 。内生真菌 微孢拟盘多毛孢( p e s t a l o t i o p s i sm i c r o p o r a ) 的紫杉醇的产量也已经开始显示了其商业 潜力。 1 河北大学理4 产硕十学何论文 i i 鬼臼毒素( p o d o p h ) ，l l o t o x i n ) 是存在于鬼臼类植物中的一类天然的木脂素( 1 i g n a n s ) ， 能够抑制微管蛋白的解聚作用和阻断中期细胞分裂，并具有抑制d n a 拓扑异构酶活 性，是合成多种抗癌药物的前体，其糖苷衍生物e t o p o s i d e 和t e n i p o s i d e 毒性较低，对 小细胞肺癌、淋巴癌等多种肿瘤疾病均有很好的疗效而被美国f d a 批准上市。李海 燕等从桃儿七( s i n o p o d o p h ) ，l l u m e m o d i ) 茎中分离到一株能产生鬼臼毒素的内生真菌 【2 8 1 。曾松荣等又分别从南方山荷叶( d i p h ) ，l l e i as i n e n s i s ) 2 9 1 和川八角莲( d y s o s m a v e i t c h i i ) 中分离到了产生鬼臼毒素的内生真菌【3 0 】。 长春新碱( v i n c r i s t i n e ) 是有效的抗癌药物之一，一般用于治疗白血病和恶性淋巴 瘤等症。张玲琪等【l0 】从长春花( c a t h a r a n t h u sp o s e u s ) 茎皮中分离到一种内生真菌 ( 9 7 g g 3 ) ，证明该菌能够产生长春碱的内生真菌菌株，属交联孢属( a l t e r m a r i as p ) 。 球毛壳甲素a ( c h a e t o g l o b o s i n a ) 是一种细胞分裂抑制剂，通过影响细胞内的收 缩蛋白而抑制细胞质的分裂。张玲琪等【3 1 】从生长于西双版纳的美登木( m a y t e n 甜 s h o o k e r i ) 的老叶中分离、筛选出一株内生真菌球毛壳菌( c h a e t o m i u m g l o b o s u m ) 。 从该内生真菌的发酵产物中分离得到了球毛壳甲素a 。由于美登木自身合成的抗癌活 性成分是美登素( m a y t e n s i n e ) ，这一研究表明，植物内生真菌不仅能够产生与宿主成 分相同或相似的活性物质，有的还能产生与宿主成分结构不同而作用相似的活性物 质。同样的例子还见于红豆衫，从中分离到的内生真菌除能合成紫杉醇外，还能产生 其它一些抗癌活性物质，如十一元坏松孢菌素d ( c y t o c h a l a s i nd 。c y t d ) 、大环内酯类 布雷菲德菌素a ( b r e f e l d i na ，b f a ) 以及a 和b 【3 2 1 。 另外，从欧洲紫杉( t a x u sb a c c a t a ) 内生菌枝顶孢( a c r e m o n i u ms p ) 产生的白灰 制菌素a 、从雷公藤( t r i p t e r y g i u mw i l f o r d i i ) 内生真菌中得到的生物碱类细胞分裂抑 制素、从一种小蘖( b e r b e r i s o r e g a n a ) 内生真菌得到的法呢基蛋白转移酶抑制剂等多 种成分均表现出抗肿瘤活性。 1 2 2 抗生素类 内生菌产生的抗生素类物质，不仅对病原体起作用，还对其它的细菌、真菌、病 毒和一些原生生物起抑制作用。大量内生真菌次生代谢产物体外抗菌试验表明；约有 3 0 的内生真菌能够产生具有抗菌活性的物质 3 3 1 。在早期对内生菌与宿主植物的关系 以及与食草牲畜中毒原因的探索中，对禾本科植物内生菌的次生代谢产物进行了广泛 4 第一幸内乍真菌综述 的研究。结果表明，禾本科植物内生真菌可以产生麦角素、有机胺、吡咯里啶以及吲 哚二萜衍生物等数十种生物碱，这些生物碱表现出抗病原菌、抗线虫、昆虫等多种生 物学活性。李桂玲掣3 4 】从三尖衫、南方红豆衫3 和香榧中分离到约9 0 株拟青霉属、 镰孢属等内生真菌，都能产生一种或多种植物病原真菌的抑制剂。从西班牙中部石膏 性和盐性土壤中的芦竹( a r u n d od o u a x ) 、针茅( s t i p a t e n a c i s s i m a ) 、迷迭香( r o s m a h n 螂 o f f i c i n a l i s ) 、二行芥( d i p l o t a x i se r u c o i d e s ) 、麻黄( e p h e d r an e b r o d e n s i s ) 、戟叶滨藜 ( a t r i p l e sh a l i m u s ) 、南方芦苇( p h r a g m i t e sa u s t r a l i s ) 等植物中分离到3 7 种具有酵母 和细菌杀灭能力的内生菌【35 1 。邹文欣等【3 6 1 从黄花蒿( a r t e m l i s i aa n n u a ) 和蒙古蒿 ( a r t e m i s i am o n g o l i c a ) 分离到了l o 余种内生真菌，其中一株内生真菌刺盘孢霉 ( c o l l e t o r i c h u ms p ) 能产生炭疽菌酸( c o l l e t o t r i c h u ma c i d ) 等3 种新的抗菌活性物质， 对枯草芽鳌杆菌、金黄色葡萄球菌和八叠球菌有很好的抑制作用。从些兰科植物分 离到的内生真菌可以产生杀菌活性的物质，分别对奥里斯葡萄球菌、长球菌、大肠杆 菌、隐球酵母和假丝酵母具有广谱或专一抗性【3 7 】。从一株刺柏( j u m i p e r u sc o m m u n i s ) 分离到的h o r m o n e m a 属内生真菌产生的一种新的三萜糖苷，对假丝酵母、念珠菌和 曲霉表现出很高的杀菌活性，与临床葡聚糖合成抑制剂p n e u m o c a n d i nb 几乎有相同的 杀菌谱和活性【3 8 】。l i 和h a r p e r 等【3 9 1 从亚热带植物中分离到的一株盘单毛孢内生真菌 能够产生一种新的抗真菌物质a m b u i ca c i d ；从一种橡树的内生真菌中分离到两种抗菌 活性物质j e s t e r o n e 和h y d r o x y - j e s t e r o n e ；从薄荷中分离到的拟茎点霉属( p h o m o p s i s l o n g i c o l l a ) 内生真菌能够产生一种具有临床应用前景的新抗生素破钾加捍如如【4 0 】。 从锡兰肉桂( g n n a m o m u mz e y l a n i c u m ) 的一种内生真菌( m u s c o d o ，a l l b u s ) 中的 到5 种挥发性化合物，均有不同程度的细菌和真菌抑制作用，如将此5 种化合物混合 使用，可增强其抑菌效果 4 1 1 。从雷公藤( t r i p t e r y g e u mw i t f o r d i i ) 中分离得到的内生真 菌c r y p t o s p o r i o p s i sc f q u e r c i n aa 秽能产生一种新型环肽抗生素c 忉玉d c 彻镀裾，与棘白 霉素和肺炎球菌素的化学性质相似，对白色念毛霉素及发癣菌具有强烈的抑制和杀灭 作用【4 2 1 。从番茄( l y c o p e r d i c u me s c u l e n t u m ) 的根部皮层分离到的内生尖镰孢霉( f u s r i u m o x y s p o r u m ) 对病原真菌有很好的抑制作用【4 3 】。兰琪等从苦皮藤内内生真菌中分离到 多个菌株对番茄灰霉病菌、小麦赤霉病菌、苹果炭疽病菌和玉米小斑病菌有抑制作用 4 4 1 。g u o 等从分离到的内生真菌( c y t o n a e c m as p ) 获得了两种新化合物：三缩酚酸 洞北大学理学硕十学何论文 i 异构体c y t o m i ca c i da 和b ，具有人细胞巨化病毒蛋白酶抑制活性4 5 1 。 大量产抗生素的内生菌的研究发现，一方面，体现了内生菌与宿主植物的互利共 生关系，即通过抗生素来保护宿主植物免受病原菌侵害，使宿主植物表现出抗病虫害 侵染的能力。同时，丰富的抗菌活性成分的发现，使得内生菌成为筛选抗生素的又一 个重要资源。 1 2 3 毒性物质类 这方面的研究在牧草中开展得很深入，是在发现内生菌感染的牧草可能引起牲畜 中毒之后，对内生菌毒性物质的研究广泛开展。牧草内生真菌产生的麦角碱、麦角胺、 色胺和卟啉碱等数十种生物碱是引起牲畜神经系统紊乱、血清肾上腺素浓度改变，造 成高酥油草夏季综合症和黑麦草蹒跚症的主要原因【4 6 ，4 7 1 。例如，j u 掣4 8 】从一种早熟禾 ( p o aa m p l a ) 的内生菌中分离到的数个黄酮类化合物，对蚊子幼虫具有毒性作用。 这些具有特殊生物活性的有毒物质，也是天然药物工作者研究热点。 1 2 4 抗糖尿病物质类 z h a n g 4 9 】和s a l i t u r o 等【5 q 从非洲刚果热带植物分离到的内生菌( p s e u d o m a s s a r i a s p ) 产生的次生代谢产物中分离出一种类似胰岛素的小分子化合物( l 7 8 3 ，2 8 1 ) ，该 物质可以使人的胰岛素受体酪氨酸1 3 亚基磷酸化，并使胰岛素受体的作用底物磷酸 化，激活a k t ，起到类似胰岛素中介作用的效果。进一步研究表明，此小分子化合物 制成片剂在给糖尿病大鼠模型r i l l 后，能明显降低血糖浓度【5 l 】。 1 2 5 植物生长调节物质类 许多植物内生菌可以产生吲哚乙酸、吲哚乙腈和细胞激动素等植物生长激素，能 够促进植物生长，从而表现出感染内生菌的植株一般比未感染内生菌的植株生长速度 快的现象。张集慧等从天麻、石斛等兰科药用植物中分离到的5 种内生真菌中，检测 到赤霉菌、吲哚乙酸、脱落酸、玉米素、玉米素核苷等植物激素【5 2 】。从假单孢菌核、 肠杆菌核、葡萄球菌竣以及固氮菌属内生真菌的一些菌株分离到乙烯、生长素、细胞 激动素等生长调节物质【5 3 】。研究表明，内生真菌产生的此类物质，能够增强宿主对环 境威胁如干旱、低温、环境污染等的抗逆性，维持宿主在非生物威胁下的正常生长。 1 2 6 活性酶类 s t a m f o r d 5 4 】等从豆薯( p a c h y r h i z u se r o s u s ) 内生真菌( n o c a r d i o p s i ss p ) 分离得到 6 第一章内乍真菌综述 耐热淀粉酶，此酶在7 0 ( p h 5 0 ) 具有1 0 0 残基活性，在9 0 时1 0 分钟5 0 残 基有活性。 1 2 7 抗氧化活性类 从t e r m i n a l i am o r o b e n s i s 的一株内生真菌中得到两种异构体p e s t a c i n 5 5 1 和 i s o p e s t a c i n 5 6 1 ，二者既表现出抗菌活性，又显示出抗氧化活性。i s o p e s t a c i n 与类黄酮类 抗氧化剂结构相似，可以清楚溶液中的过氧化物和自由基。的抗氧化活性被证实比维 生素e 高出许多。 1 3 链霉菌代谢产物研究进展 链霉菌( s t r e p t o m y c e s ) ，属细菌域，放线菌门，放线菌纲，放线菌目，放线菌科， 链霉菌属，是具有复杂生活周期的革兰氏阳性放线菌。自从w s k a m a n 和h e 血c i 【5 7 】于 1 9 4 3 年建立链霉菌属( s t r e p t o m y c e s ) 以来，链霉菌已经成为放线菌乃至细菌域中种 类数量最大的一个属。目前，包括出现在专利中的种已经超过了3 0 0 0 个，至1 9 9 6 年 已经有有效描述的种有4 6 4 个，亚种4 5 个【5 8 】。 链霉菌是具有复杂生活周期的革兰阳性放线菌链霉菌属，许多成员都能产生在医 疗、农业、食品等领域具有重要意义的天然次级代谢物，目前临床上应用的抗生素约 三分之二来源于链霉菌属。该属产生的代谢物还包括抗肿瘤剂、免疫抑制剂、抗虫剂 【5 9 1 以及胞外水解酶，如淀粉酶、几丁质酶、纤维素酶、果胶酶、木聚糖酶和蛋白酶等 【鲫。正因为链霉菌次级代谢途径能产生众多次级代谢物，几十年来，关于链霉菌次级 代谢调控的研究倍受重视。 链霉菌基因组序列信息的获得，使次级代谢研究进入更深的层次。链霉菌基因组 富含次级代谢物合成基因簇，天蓝色链霉菌( s t r e p t o m y c e s c o e l i c o l o r ) 基因组中有2 3 个 参与形成复杂次级代谢产物的基因簇，约占基因组总量的5 ；除虫链霉菌 ( 勋印幻，砂c p 口化删f 巧凰) 中有3 0 个次级代谢基因簇，占全基因组的6 6 6 。链霉菌基 因组分析显示，其所编码的次级代谢途径远比我们目前已知得多，通过结合基因组学、 转录学、蛋白质组学、分子遗传学、发育生物学和生理学，我们可以阐述链霉菌次级 代谢物产生调控和形态学分化过程中复杂的信号传导途径。 作为微生物药物的一个重要来源，放线菌的代谢产物丰富多样，其中有许多较有 特色的代谢产物类型，根据统计，分离得到的糖肽类抗生素达到了1 2 0 多种，1 8 6 0 7 河北大学理学硕十学何论文 元环的大环内酯超过了1 0 0 0 种，多烯类近5 0 0 种，氨基糖苷类也超过了4 0 0 种，葸 环类也已经有4 0 0 余种，聚醚类达到了2 5 0 种，这些结构类型均是在其他微生物的代 谢产物中较少分离到的【6 2 1 。 自1 9 4 2 年首次从链霉菌中发现抗生素链丝菌素，以及1 9 4 4 年发现链霉菌 素以来，人们对从链霉菌中筛选新的抗生素的研究一直都没有停止过作为产生抗生素 等生物活性物质种类最多的一类微生物，目前在链霉菌中已经发现了8 7 0 0 多种代谢 产物，占放线菌产生代谢产物( 1 0 0 0 0 种) 的8 6 ，1 9 7 0 年前发现的抗生素中9 5 均为 链霉菌产生，包括链霉菌素、阿维菌素、他可莫司在内的以前和现在广泛应用的药物 均来源于链霉菌属的不同种这些次生代谓十产物在医疗、农业、食品等领域都具有重要 的意义，现阶段临床上应用的抗生素约三分之二来源于链霉菌属。该属产生的代谢产 物还包括抗肿瘤剂、免疫抑制剂、抗虫剂以及胞外水解酶，如淀粉酶、几丁质酶、纤 维素酶、果胶酶、木聚糖酶和蛋白酶等【6 3 1 。 由于链霉菌的开发历史较长，当今从中发现新化合物的数量有减少的趋势，但链 霉菌在微生物代谢产物研究中的地位还是无法撼动的，从链霉菌属发现的微生物代谢 产物占整个微生物代谢产物的3 8 6 ，这个数字超过了从真菌中发现的代谢产物的总 和【6 4 1 。 目前，对链霉菌代谢产物的研究基本上有两个方向： 一方面，从大量的链霉菌株中筛选分离有生物活性的代谢产物，期望能得到具有 新结构、新功能、高产量的活性化合物。近年来，g u 等人【6 5 】从玫瑰孢链霉菌中分离 出3 种达托霉素( d a p t o m y c i n ) 的脂肪类似物，并研究了其抗菌活性。m i l l e r 的人【删 从关岛附近的海洋链霉菌中分离到3 种由稀有氨基酸构成的环六肽内酯抗生素 p i p e r a z i m y c i n ( a c ) ，并对其进行抗肿瘤活性研究，结果表明，p i p e r a z i m y c i na 在 1 0 0 n m o l l 的浓度下对多种肿瘤细胞皆有细胞毒活性。p i n g 等人【6 7 】从链霉菌 s r e p t o m y c e sm e d i o c i d i c u s 中分离出3 种具有广谱抗菌活性的多烯类抗生素 m e d i o m y c i n s a ，b ，和c l e t h r a m y c i n 。 在国内，中国海洋大学在分离海洋放线菌代谢产物方面也做了很多的工作【6 8 1 ，采 用减压硅胶柱层析、反相硅胶柱层析、s e p h a d e xl h 2 0 和反相h p l c 等柱色谱技术， 分离到了大环内酯类、脂肪酸、环二肽、多元醇、环醚类等多种类型的化合物，并进 第一章内牛真菌综述 行了抗肿瘤活性研究。 另一方面，对链霉菌中具有较高生物活性的次生代谢产物的生物合成代谢途径进 行研究，以期望能找到调控产生这些代谢产物的基因，然后通过利用这些基因的信息 对其代谢途径进行调控、修饰和改造来提高活性物质的产量或获得新化合物。现在已 经成功克隆并研究了包括聚酮合酶途径( p k s ) ，非肽段核糖体合酶途径( n r p s ) ，查 耳酮合酶途径( c h s ) ，以及聚醚、多烯类合酶等途径【6 9 1 。 a 、次级代谢途径研究方法 链霉菌中某一特定次级代谢途径相关的基因通常以基因簇( c l u s t e r ) 的形式存在于 线状染色体上。基因簇最早是由r u d d 等【7 0 】通过不产抗生素的突变株种间杂交与遗传 分析发现的，典型的次级代谢途径基因簇长度约为1 5 1 2 0k b ，通常还包含调控和抗 性基因，仅极少数抗性基因甚至合成基因不在同一基因簇中。由于基因簇的存在，一 旦定位了某一途径的一个基因，通过分析相邻染色体区域就可以推断和研究整个代谢 途径，链霉菌中克隆r 1 1 2 8 c 聚酮化合物基因就是采用这样的策略与方法【7 1 1 。 z a z o p o u l o s 等根据次级代谢物合成基因以基因簇形式存在的特点，建立了一种全基因 组扫描技术以发现次级代谢相关基团( 不管是否表达) 【7 2 1 。 s c e o l i c o l o r 是第一个被完整克隆并研究的途径，主要通过合成阻遏突变种间的互 补来克隆 7 3 , 7 4 ；之后很快又克隆了其他的途径如丁省霉素、榴霉素和链霉素。分析这 些生物合成基因，发现在放线菌内具有相似功能的基因通常有很高的保守性【7 5 】。因此， 有些基因已经成功用作探针去鉴定菌株中合成相关但不同分子的基因，如克隆并研究 了包括聚酮合酶途径( p k s ) 、非肽段核糖体合酶途径( n r p s ) 、查尔酮合酶途径( c h s ) ， 以及聚醚，多烯类合酶等途径。 测序时代前，关于生物合成途径的研究很费力；序列数据的获得使研究这些途径 更加容易。现在，和功能基因组研究比较将有助于了解控制代谢启动及次级代谢调节 网络，因为不同放线菌利用营养的方式虽然不同，但它们触发主要代谢转换到次级代 谢的全局调控体系可能是保守的【7 6 】。不仅如此，根据基因组信息可以更加方便的研究 此前不曾发现或无法研究的“隐藏”或“沉默”次级代谢途径，以获得并研究对人类 有重要意义的新代谢物。 b 、改造次级代谢途径获得高产菌株 9 河北大学理学硕十学何论文 传统高产菌株的获得主要是育种改良生产菌种，通过诱变如紫外、氮芥、乙烯亚 胺、放线菌素k 、n t g 等大规模筛选，虽然稳定但工作量大。2 0 世纪7 0 年代发展起 来的原生质体融合技术成为抗生素生产菌选育菌种的重要途径之一，但由于菌株需带 标志，选育同样费时费力。2 0 世纪9 0 年代后期开始有意识地利用基因工程方法改造 修饰次级代谢途径，随着更多次级代谢基因簇信息和基因组信息的获得，利用分子 手段改造次级代谢途径成为可能。 由于基因组信息研究提供了比较清晰的代谢路径信息，操纵代谢途径以提高目标 代谢物成为可行。次级代谢物通常来自初级代谢中间物，可通过增加这些代谢物前体 提高最终产物。b u t l e r 等就根据碳流量与次级代谢的关系，在s f i v i d a n s 中操纵主要碳 代谢物以提高抗生素产量【7 7 1 。一种链霉菌中往往存在多条代谢途径均能利用的共同前 体，因此，可以敲除或失活那些竞争共同前体的代谢途径基因簇，或降低其表达水平， 使共同前体代谢物尽可能多地“流经 目标产物代谢途径，提高目标产物的相对量， 如s c l a l i g e m s 中通过敲除头霉素c ( c e p h a m y e n c ) 合成途径中的一个基因使该途径 失活，提高克拉维酸( c t a r u t a n ea c i a ) 的产量【7 8 】。这种敲除非目的代谢途径以提高目标 产物的产量的方法还需要在其他链霉菌中验证，但这是利用基因组信息改造菌株的最 直接方法。 次级代谢基因簇信息揭示抗生素相关基因成簇存在，其合成反应是一个线性过 程。因此，可采取以下策略提高代谢物产量：( 1 ) 提高限制步骤的反应速率。由于线性 反应的最终产物合成速率将取决反应过程中最慢的步骤，提高该步骤反应速率可使最 终产物过量表达，泰乐星合成途径中，由t y l f 编码的大菌素转为泰乐星的步骤限制最 终产物表达量的提高，克隆调控t y l f 基因可提高泰乐星的发酵产量【7 9 】；( 2 ) 过度表达线 性反应中的某一基因。谭华荣等在s n a n e h a n g e n s i s 中过度表达尼可霉素合成基因簇中 的s a n o 基因，使尼可霉素c 产量比野生型提高一倍【8 0 】：( 3 ) 刺激基因簇上游调控因子 来