（无机化学专业论文）脂氧合酶模型化合物的合成、表征及反应性研究(2).pdf

硕士学位论文 m a s t e r s t h e s i s 摘要 本论文的完成中合成了十三种富含苯并咪唑配体的脂氧合酶模型化合物， 并通过紫外一可见光谱( u v - v i s ) ，红外光谱q r ) ，电导( a m 。i ) ，元素分析，循环伏 安( c v ) 等钡i 试手段表征了这些配合物 用硫代巴比妥酸法( 2 t h i o b a b i t u r i ea c i d ) 测定了金属配合物的脂氧合酶活性 求出亚油酸氧化反应决速步骤动力学准一级速率常数，亚铁化合物 f e ( c t b ) c 1 2 2 h 2 0 催化反应准一级速率常数远大于全氧原子配位的三核铁配合 物 f e 3 ( p 3 - o ) ( t t 2 - p h c o o 。) 6 ( 1 1 2 0 ) 2 ( c h 3 0 1 - 1 ) c 1 通过电喷雾质谱s i m s ) 对f c ( c t b ) c h 2 h 2 0 ， f e 4 ( n t b ) 4 ( i _ t 2 - o h ( r a s u c 2 - ) 】 ( c l 0 0 6 ， f c z ( i d b ) z ( i t 2 - o ) ( 仙z - a c ) z c h ， f e 3 ( v 3 一o ) ( t t 2 - p h c o o ) d ( h 2 0 h ( c h 3 0 均】 c l 催化亚油酸氧化次级产物分析，前三个化合物通过自由基和有机金属化合物 机理促进亚油酸氧化，三核铁配合物 1 = e 3 ( i t 3 一o ) ( # 2 - p h c 0 0 3 6 ( h 2 0 ) 2 ( c h 3 0 d c l 可能通过有机金属化合物机理进行，几乎表现出抑制脂氧化 对化合物m n ( c t b ) ( c 1 0 0 2 ，c u ( e d t b ) ( n 0 3 ) 2 。e t o h ， c 0 2 ( e g t b ) ( h 2 0 ) 4 c h 的脂氧合酶活性研究发现含铁模型化合物催化活性优于非铁化合物，富含苯并 咪唑的金属化合物活性优于全氧配位的化合物， 用邻苯二酚作为底物测试了含铁模型化合物的多酚氧化酶活性，发现三核 铁配合物对多酚氧化亦表现出抑制作用 化合物口e 3 ( - o ) ( r t 2 p h c o o ) 6 ( h 2 0 ) 2 ( c h 3 0 h ) c i 同时表现为脂，多酚氧化 抑制作用，原因与其较低的氧化还原电势e 。一o 0 4 i v 有关 关键词：脂氧合酶，脂氧合酶模型化合物，合成，表征，脂氧合酶活性， 硫代巴比妥酸法，电喷雾质谱 a b s t r a c t t h i r t e e nf e r r i cm o d e lc o m p l e x e sc o n t a i n i n gb e n z i m i d a z o l y l - r i c hl i g a n dh a v e b e e ns y n t h e s i z e da n dc h a r a c t e r i z e db yu l t r a v i o l e t a v i s i b l es p e c t r a ( u v - v i s ) ，i r 曲a r e d s p e c t r ao r ) ，m o l a rc o n d u c t i v i t y , c y c l i cv o l t a m m e t r y ( c v ) t h el i p o x y g e n a s e 棚血删烛a c d v i t y o fs o m ec o m p o u n d sh a sb e e nd e t e r m i n e da n dt h ep s e u d o f i r s t - o r d e r r a t ec o n s t a n t so fl i n o l e i ca c i d 旺，a 1o x i d a t i o na r ea c q u i r e d t h er a t ec o n s t a n to ft h e r e a c t i o nc a t a l y z e db yf e ( c t b ) c 1 2 2 h 2 0i sm u c hl a r g e rt h a nt h a to f t r i n u c l e a rf e r r i c c o m p l e x ， f e 3 ( i x 3 一o ) ( - p h c o o ) 6 ( h 2 0 h ( e l l 3 0 h ) c 1 t h e s e c o n d a r yd e c o m p o s i t i o np r o d u c t s o fl ao x i d a t i o n c a t a l y z e db y 班e ( c t b ) c 1 2 a 2 0 ，腰自0 嘞舢2 j d 泥( m - s u 嘲( c 懈口e 2 q ) b ) 2 ( 】j 2 - o ) ( j 】2 _ a 嘞】c 1 2 a n d ( m - o x i t 2 - p h c o o ) 6 ( h 2 0 ) 2 ( c h 3 0 h ) c 1 a r ea s s a y e d b y m e a n so f2 - t h i o b a b i t u r i ca c i d t e s ta n de l e c t r o s p r a yi o n i z a t i o nm a s ss p e c t r o m e t r y f o rt h ef o r et h r e ec o m p l e x e s ， o u re x p e r i m e n t a lr e s u l t s g i v e e v i d e n c et o s u p p o r tb o t ho ft h e m e c h a n i s m s ：t h e r a d i c a la n dt h eo r g a n o f e r r i ei n t e r m e d i a t e s ；h o w e v e r ，t h et r i n u c l e a rf e r r i cc o m p l e x m a yc a t a l y z eo n l y t h es u b s t r a t er a d i c a lm e c h a n i s m i nt h i sw o k ，w eh a v ea l s od os o m er e s e a r c ho l it h el o m i m i c k i n ga c t i v i t yo f n m 由血伽砷魄溅m 冰肛 x ( 如临q 】回) i b ) 叫q 旌峨 c 0 2 ( e g t b ) ( h 2 0 ) 4 c h i t i s 咖吐1 a t a 】l 也e c o m p o u n d s c a n p r o m o t e l a o x i d a t i o n e x c e p t c o z ( e g t b ) ( h 2 0 ) 4 c h i no r d e rt oi n v e s t i g a t eo t h e r p r o p e r t i e so f t h ef e r r i c - c o n t a i n i n gc o m p o u n d s ，t h e p o l y p h e n o lo x i d a s ea c t i v i t yo fs o m ec o m p l e x e sh a sb e e ns t u d i e d - o ) ( i t 2 - p h c o o ) 6 ( h 2 0 ) 2 ( c h 3 0 h ) c ii n h i b i t st h eo x i d a t i o no f b o t hl i n o l e i ca c i d a n d o - d i p h e n o l ，w h i c hm a y b ec a u s e db yi t sv e r yl o wr c d o x p o t e n t i a l ，e a = 0 。0 4 1 v k e y w o r d s ：l i p o x y g e n a s e ，m o d e lc o m p l e xo f l i p o x y g e n a s e ，s y n t h e s i s ， c h a r a c t e r i z a t i o n ，2 - t h i o b a b i t u r i ca c i d t e s t , l i p o x y g e n a s ea c t i v i t y , e l e c t r o s p r a y i o n i z a t i o nm a s s s p e c t r u m ( e s i m s 、 2 硕士擎位论文 t v 执s t e r 7 s t f e s 【s 第一章文献综述 ，u p o x y - g e n a s e ： l i n o l e i c 八a c i d5 h 1 l 己 i l i p o x y g e n a s e - - - 1 ，缩写，s l o - - 1 ) 开始的，对于其活性部位结构己开展了大量的光 谱测试，并且到目前为止通过x 射线晶体结构衍射确定结构的l o 已有数种 3 ，4 ，5 ，其中以大豆氧合酶i ( s l o - 1 ) ，大豆脂氧合酶3 ( s l o 一3 ) 和从兔体内分离 的脂氧合酶1 5 ( r l o 一1 5 ) 结构研究最为详尽在大豆脂氧合酶1 ，3 的活性部位， f e ( i i ) 与三个组氨酸咪唑氦原子口i s 4 9 9 ，h i s 5 0 4 ，h i s 6 9 0 ) ，一个异亮氨酸羧基氧原 子( n e 8 3 9 ) ，一个天冬酰胺羰基氧原子( a s n 6 9 4 ) ，一个水分子配位；1 5 一r l o 活性部 位f e ( 1 与s l o l ，s l o - 3 类似，仅a s r l 6 9 4 被h i s 3 6 6 取代，其它配位的氨基酸残 基与s l o 类似，分别为h i s 3 6 l ，h i s s 4 t ，h i s s 4 s ，i l e 6 6 3 ，还有一个空位，s l o 一1 ， r l o 一1 5 活性部位f e ( i i ) 的配位环境如图( 1 - 1 ) ： 图1 1 c o o r d i n a t i o ne n v i r o m e n t o f s l a c o o r d i n a t i o ne n v i f o m e n t o f r l e ) 5 m a r k j ，n e l s o n 认为，配位的水分子在催化过程中起着很关键的作用【6 】 通过对s l o - 1 活性部位研究证实，脂氧合酶( l o ) 在催化不饱和脂肪酸 ( p u f a ) 发生氧化之前，首先需要一个酶活性的诱导过程，即l o 中f e ( i t ) 的是 不具有活性的，必须经由生物体内少量的烃过氧化物( r - o o s ) 把f e z + 一o i - 1 2 活 化成f e 3 + _ o h 7 】在f e “一f e 因价态变化而诱导酶活性的过程中，脂氧合酶( l o ) 原来是无色的，氧化还原电势在+ 6 0 0 士1 0 0 m v ( v s n h e ) ，氧化生成黄色的含 f e ( b i ) 活性配位结构的f e _ o h ( 。a 。= 3 5 0 n m ) ，如果有过量的l - o o h 或者其 它的烷基过氧仳a 勿_ ) o 均，f e = - - o h反应生成紫色f e m - - o o h ( m 。x = 5 8 5 n m ) ( 如图1 2 ) 氧化过程中价态及颜色的变化可以作为脂氧合酶( l 0 ) 催化作用过 程中的一个佐证 6 1 | | c 刚 、 s ， l融。5 | | oo h 啪 伪， s ， 4 - 呈 性 融 舛，、 叶 |。，、i置 o f e ( m ) 或p 旬x o 哼f e ( ) ，l m c t ) 根据文献 3 5 】，3 0 0 - - 4 0 0 r i m 间的 吸收峰可指认为p o x o 斗f e ( m ) 或配体( l i g a n d ) 苯并咪唑基- - - f e ( i i i ) 的荷移跃迁， 而4 0 0 5 0 0 r i m 间的吸收峰可指认为配体场中( h d 跃迁由于a l = 0 跃迁禁阻 吸收强度很小，所以一般观察不到其可见吸收峰，但是由于吸收波长恰好在可 见光区，从而使含铁配合物都有显示出一定的颜色 部分化合物的紫外一可见光谱图如图3 - 1 ，其中b 1 在3 7 5 n m 附近的吸收峰 可指认为l a 3 - - o x o 斗f e ( i i i ) 荷移跃迁 1 9 硕士学位论文 m a s i e r lst i i e 5 i s 整j | 哥峰耐 2 0 0 c m 1 ，羧基以单齿配位，若a = 4 0 8 0 c m 一，羧基以双齿配位可能性较大，若 值在1 4 0 c m “左右，可以认为羧基桥连配位【38 配合物的酸根离子( 立f l ：c 1 0 4 等) 是否参加配位也可根据红外光谱来判断，对 于c 1 0 4 如果未参加配位，则配合物会在1 1 6 0 - - 1 0 8 5 c m d 之间有一吸收峰：若 以单齿配位，则会在1 2 7 0 1 2 4 5 c m 一，1 1 3 0c m “和9 4 8 9 2 0o m 。1 有三个吸收峰 【3 9 ，4 0 凸=罄星乏釜薹三 一e一心n口【sv小。一 寸导 一一呻卜 一暑一n(一。昏。一 一目一卜一吗蔷)60= 0 6 0 【 ) 0 8 一 (i)品蔷蛊o_【 一吕一啮一心(一to一 。一叶 一量一hn崎(一。小。一 。n 呻 【s ) 9 | 卜 o t 甘n 曲。掣n寸曲 | n 西昏 一)|寸乱n一(量一n小叶一 c 6 一 一e一卜ci(e一。的2 o 一 n 小【 譬n0 2 心。一i i h 卜c i 一量一葛l(暑一寸2(i)。o=口)誉2 一e)oi(enni|(一。蔓曼。旨i|一昌ic1()c6=一暑一卜ci(量一直2暑一窑n二巨一寸n2 一暑一c【=(e一a9f 一量一n卜=eon口一 一e一嚣=(暑一一9ie一盎=(g一心n9i 一置) 0 葛一 一暑一。寸!(昌一n一心一 百一拳：(tu)a3lgv。n!o邑。h= 一e一卜=(enn喝一 u)导二一nq【一enn=(ev；母i 一量一nn2(e)8一n一(e一8i心一 =工)冀竺ou)口gi| 一e一叶n=(巳)|n噜一一暑一葛=(量一寸一一 小n 昏h o n 西一 。袋n 型西一o m o 一 ! 小h o n 小一 。袋no h 昏no z 6 hn 昏no 袋hn 譬n o n 小一 。一岛n on采no吗。寸n(s口口)o寸on。oh葛 一jq一田昏小n，的8i n一j丑一nn。n、。舟。寸n(s】q)00n占o一苫一n。c口nn(sjq)|80c葛cc宙jqv。o一，o器n 嚣jq06。叩；葛 (s占一8icoonn 一苫vm”。n工一罱(sjq)|嚣n00口n宙寸口一m寸omo叫nnm暑口冒罟n0；n(sjd甚oiconnn n 一目 i o 一口 一暑)盎=冒v搿9l 。m 高 (s占)|001毒高 爱j 口 苦口手 一t 亨 2专芋 冯 一8叶邑。 骧垣种罐l_i_凸联啦旨将 馘惮旧 硕士学位论文 m a s r e r s t i l e s i s 3=lg# uiilg# 硕士学位论文 m a 5 t e r st e s 【s lgls l， 硕士学住论文 m a s r e r st l 正s i s 图3 2 2 7 lel e# 四配合物电化学 1 分子筛的活化：将商用4 a 分子筛用自来水冲洗，除去表面粉尘颗粒，然 后用一次蒸馏水冲洗，再用二次蒸馏水冲洗至洗出液电导率值不变( 或小于 1 0 石s e m “1 ，然后放入马福炉活化，2 5 0 。c 活化两个小时，再升温至4 5 0 。c 活化4 个小时。小心放入真空干燥器冷却，备用 2 d m f 的提纯：向5 0 0 m l d m f ( a r ) 中加入适量已活化的4 a 分子筛脱水4 8 小时，然后减压蒸馏( 一o 5 a r m ，9 0 1 0 0 ) ，收集中间3 0 0 , - - 4 0 0 m l 馏分， 1 9 0 9 0 0 衄u v ，v i s 检验合格 3 支持电解质四丁基高氯酸铵的制备( t b a e ) ，用适当比例的四丁基氢氧化 铵( a r ) 和高氯酸( a r ) 反应，将所得白色沉淀过滤，先用蒸馏水冲洗沉淀至洗 出液呈中性，再用9 5 的乙醇和甲醇分别重结晶2 3 次，真空干燥4 8 小时，得 到片状白色固体 4 配合物的电化学测试条件：在d m f 溶液中，支持电解质t b a p 浓度为 0 1 0 m o l l ，配合物溶液浓度为1 0 1 0 弓m o l l ，将溶液置于三电极电解池中， 以铂电极为对电极，a 矿a g c l 电极为参比电极，玻碳电极为工作电极，用 b a s - 1 0 0 型电化学分析仪，在饱和n 2 气氛中测定循环伏安，所得数据列于表 3 5 所有配合物均用d m f 为溶剂，支持电解质为t b a p , 在饱和n 2 溶液中测得 它们的循伏安图( 部分配合物的循环伏安曲线如图3 - 3 ) ： 配合物d 1 ，d 2 ，d 3 都在1 0 0 0 m v 一1 0 0 0 m v 间有一对( 或两对) 氧化还原峰 以d l 为例，e a - - 4 0 0 m v , e c - 1 7 0 m v , e p = 5 7 0 m v , i g l f l 2 ，这可归属于f e 。f e m f e ”f e ”之间的氧化还原反应，可把反应视为准可逆电极反应过程【4 1 】，类似可看作 准可逆反应的还有d 2 ( i 以f 1 2 ，e 口- 3 1 0 m v ) ，d 3 ( 讲f 1 1 ，e p = 1 2 6 m v ) 对于 n 2 有两对氧化还原峰，e a = 5 3 0 m v , e 。= 3 5 0 m v ；e , = 3 2 3 m v , e c - 一1 4 3 m v , e 。分 别为1 8 0 m v , 1 7 5 m v ；i 以。分别为0 5 5 ，3 1 1 这两对氧化还原峰可分别归属为f e “f e ”一f e f e “，f e ”f e “一f e “f e “对于b 1 可归属为f e f e o f e l o f e ”，其氧化还原 电位都较小，这是由于与中心金属离子配位的全部是氧原子 硕士学位论文 m a s t e r st ii e s i s 表3 5 配合物循环伏数据( u = 1 0 0 m v s 。) n u m b e r e j m vi c ，吣e a m v i a u ae l n m v d i - 1 7 05 54 0 0 4 51 1 5 d 2 d 3 e 1 e 2 e 3 n 1 n 4 b 1 2 1 0 1 3 4 1 9 0 1 5 1 1 7 4 - 9 5 3 5 0 1 4 3 1 3 0 一3 9 9 5 0 8 6 0 9 0 8 5 6 2 2 1 1 2 8 1 4 9 3 3 9 i 6 7 5 2 6 5 0 0 2 5 0 2 1 0 2 4 9 2 6 1 3 0 5 3 0 3 2 3 2 6 0 _ 一1 1 】 8 0 7 8 1 3 0 6 。4 4 2 2 4 1 5 6 2 7 2 1 0 9 1 3 2 5 7 5 1 3 0 1 9 2 2 2 1 2 0 0 2 1 8 6 3 4 4 0 5 5 1 9 5 - 7 5 c l 4 1 98 2 0 5 3 4 4 2 0 4 7 7 【f 。2 ( d t p b ) ( 弘r o ) ( p r h c o o 瑚h f e 2 ( d t p b ) rs a r ) c t 4 + 2 9 户一 轮 扩一 酸 ；lu 硕士学位论文 m a s t e r st f i e s i s “0 0 越“出柚 r m w f e 2 ( e g t b ) ( r s u c 4 + 似位皿珊瑚瑚 r b w f e 2 ( e g t b ) ( p r d o p h t 2 ) 4 + m日 f e 2 ( e g t b ) c 1 6 f e ( n t b ) ( s a l - ) ( h 2 0 ) ( c 1 0 4 + r 州 f e 4 ( n t b ) 4 ( p 2 - o ) 2 ( p 2 一s u c 2 】“ f e ( n t b ) ( a e ) ( h 2 0 ) 】2 + t畸占sc皇u t婚由sc芒：u 黛_麓妊 6rjcg=q 暑rj，t】u 寰_jcgju 硕士学住论文 a s t r s1 i 蚯5 1 5 柚确啦m 州mm r w f e ) ( o ) ( 一p h c o o - ) 6 ( h 2 0 h ( c h s o h ) + 图3 3 配合物循环伏安图 第四章化合物酶活性研究 一模型化合物脂氧合酶( l o ) 活性的测定 研究模型化舍物( m o d e lc o m p o u n d ) 催化亚油酸( 1 i n o l e i ca c i d ，简写，l a ) 氧化 最直接的办法就是测定一定时间内亚油酸氧化物( l - o o h ) 的生成量，然后与未 加模型化合物时l a 在空气中自氧化对比，评价该化合物促进或者抑制亚油酸 氧化由于亚油酸过氧化物( l o o h ) 在室温( 2 5 ) 很不稳定，而在低温( o ) 时反应缓慢( 至少5 个小时) 这给跟踪带来了不便为了便于跟踪检测，本实验 中采取反应温度6 0 ，l - 0 0 h 断链生成次级产物，然后与硫代巴比妥酸( r b a ) 反应，因为不饱和脂肪酸氧化过程中控速步骤是第一步氢原子的夺取，因此可由 最终产物的生成速率评估不饱和脂肪酸的氧化实验中还发现不同模型化合物 催化l a 氧化存在不同的诱导期此外，由l n ( a ，一a f ) t 作图为一直线，推知此 反应为准一级反应由动力学一级反应推导出亚油酸氧化准一级反应速率公式 用生成物溶液的吸光度表示如下， l n a f a t ) = - k t + l n ( a f a f ) a f ，a l ，a t 分剐为反应最终，开始及t 时刻生成物溶液的吸光度值 基sc芒，u 1 i f e ( c t b ) c 1 2 2 h 2 0 腊氧合酶活性计艽 为证实脂氧合酶的催化活性价态本文采用已合成表征的模型化合物田e “( c t b ) 】 c 1 2 2 h 2 0 【4 2 进行研究 室温取7 0 毫升亚油酸( l a ) 溶液，加入0 1 毫升 f e “( c t b ) c i ：2 1 - 1 2 0 液，搅 拌1 0 分钟，然后加入2 0 毫升2 壕代巴比妥酸乙醇溶液，另加入0 9 毫升乙醇， 反应测试过程中保持体积为1 0 0 毫升，调节亚油酸溶液p h 7 2 5 最终被检测溶 液中模型化合物的浓度c 。l = 1 0 1 0 m o l l ；c t a = 3 7 2 1 0 。t o o l l ；c t b a _ 1 4 8 x 1 0 。m o 儿，水浴6 0 。c 加热，反应过程中溶液逐渐变黄，在4 5 5 n m 处有一吸收蜂， i n ( a f - a t 卜t 作图( 图4 l a ) 零 i ：j ：3 习i 蓍 一jf “ “1h p 刖 芝一，! 兰 铲 图4 l 亚油酸氧化类一级反应速率 a r e “( c r b ) 】2 + 催化b 亚油酸自氧化( 空白) 反应刚开始时，生成物量很少，吸光度值较小，从第1 4 分钟检测到生成 物吸收峰的出现，此时吸光度记为a i ，1 0 分钟跟踪测定一次4 5 5 n m 处吸光度值 a t ，一个小时后生成物溶液吸光度值记为a 由图4 l a , t r e “( c 他) c 1 2 2 h 2 0 催化亚油酸氧化可视为准一级反应，l c 4 5 5 = o 1 1 6 m i l l 1 ，与亚油酸自氧化( 图4 l b ) k 4 5 5 ( 。t i 廿o i f ：4 4 1 0 。m i n “对照发现，有金属 化合物作用时反应加快，原因可能是催化过程中 f c 4 ( c t b ) 2 + 金属中心的烷胺氮 键断裂( 其结构如图4 2a ) ，结合l 之分子氧，0 2 分子配位后相当于刚好位于一 个疏水性口袋，与溶解在溶液中的自由氧分子相比，疏水氧更易氧化靠近的亚 油酸分子生成氧化物或断链产物，同时f e 2 + 被氧化为f e 3 + e s i m s 谱发现有分 子离子峰【f e ( c t b ) ( 0 2 ) 2 ”( m z = 2 51 ) ， f e ( c t b ) ( 0 2 ) ( o h ) 2 + ( m z = 3 7 0 ) ， 【f e ( c t b ) ( l o o h ) 2 ”( n g z = 4 3 7 , - , 4 3 8 ) f e ( c t b ) ”( m z = 2 3 0 ) ，( 如图4 2b ) 硕士学位论文 m a s r e r lst l 正s 1 5 f e ( c n 3 ) 0 9 2 斗( m ，2 恕5 1 ) 的生成迸一步证明由于f e n 。岫键长( 2 3 3 7 a ) 大于f e n k 蛔 f 2 1 1 3 a ) ，在催化过程中烷胺氮键更易断裂，被l e w i s 碱性较强的氧原子取代配位氧 分子既可以作为亲质子碱夺取l a 分子c l l 位的氢生成自由基，又可以作为过氧基供体 与l a 作用生成过氧化物为了证实反应过程中有无自由基生成将d m p o ( 5 ，5 二甲基 毗咯啉氧化物) 作为自由基跟踪剂加入呼c 瑚”催化的亚油酸乙醇溶液中，e p r 谱 没有发现d m p o - o h - 自由基信号峰( a n = a 。h = 1 5 0 r o t ) ，然而却发现o h l a 与 d m p o 反应物信号峰( a l f l 5 8 r o t , a 8 h - 2 ，2 4 r o t ) ( 圜4 2 d a b 图4 2 a f e “ c t b ) c m 2 h 2 0 晶体结构b r e 。( c t b ) 2 + 催化l a 氧化e s i m s c l a 氧化过程中自由基e p r 硕士学位论文 m a s t e r st 蚯s i s 2 影响 f e “( c t b ) c 1 2 2 h z o 脂氧合酶反应活性的几个因素 2 1 温度对拟酶活性的影响 反应温度控制在7 0 c ( 表4 - 1 ，图4 - 3 a ) 求出k 4 5 5 ，与6 0 0 c ( 表4 2 ，图4 - 3 b ) 相比， k 4 5 5 增加，烷基醛的生成量增力 1 1 4 3 ，并且次级产物与硫代巴比妥酸反应物在可 见光区5 3 2 n m 附近吸收峰也增强，表明随着反应温度升高，亚油酸氧化断链生 成二烯醛，丙二醛的量增加，e s i - m s 谱分别有相对应的分子离子峰f 图4 2 c ) 表4 1 f e “( c t b ) r 催化l a 氧化 表4 2 矿e “( c t b ) 1 2 + 催化l a 氧化 ( t = 7 0 c ) 时间t r a i n 1 r a f a 0 3 1 3 5 4 0 4 5 5 0 5 5 6 6 0 8 7 o 9 9 1 2 7 l - 5 3 1 8 3 2 1 3 ( r - - - 6 0 c ) 堕塑! 垒! ! 坐坠! 墅 6 0 0 9 3 1 0 0 1 7 8 1 5 0 2 7 8 2 0 0 3 9 8 2 4 0 5 3 7 3 l 0 7 6 2 3 5 0 8 8 6 4 0 i 0 9 6 1 _ 3 1 1 图4 3 a f e “( c t b ) 】2 + 催i ) 5 ( 7 0 c ) k 4 5 5 f 7 = o 0 5 4 m i n - 1 ，k 5 5 ( 6 0 ) = 0 0 3 4 m i n 一随反应温度升高，亚油酸氧化断裂生 成烷基醛的量也增加 反应温度控制在5 0 。c 求出9 4 5 5 ( 表4 - 4 ，图4 4 ) ，与6 0 c ( 表4 3 ，图4 。4 ) 反应相比， k 4 5 5 减小，但反应5 个小时后观察到断链产物与t b a 反应产物溶液在可见光区 4 9 5 n m 有吸收峰，根据文献报道 4 3 1 此时亚油酸氧化次级产物为单烯醛( 己烯醛， 壬烯醛等) ，烷基醛等 表4 3 【f e o ( c t b ) 】2 + 催化l a 氧化表4 4 f e 4 ( c t a ) 1 2 + 催化l a 氧化 ( t = 6 0 ) l n ( a 广a t ) 0 0 0 0 0 1 0 8 0 3 2 2 0 6 9 3 1 0 0 1 1 4 4 9 2 1 8 7 ( t = - s o c ) 时间t m i n i n ( a r a t ) 5 0 7 0 8 3 1 0 0 1 2 3 1 4 5 0 0 0 0 0 2 2 3 0 4 0 5 0 6 2 9 0 9 7 3 1 5 0 4 由l n ( a f - a t ) t 作图，分别得到准级速率常数k 4 5 s ( 6 0 r ) - - o 0 2 2 m i n 1 ，k 4 5 5 ( ) 卸0 1 6 m i n l ( 图4 5 ) 由此分析 温度刚氐时，不饱和脂肪酸靴的速度变幔5 0 0 c 氧化 次级产物的量与6 0 c 相比减少 撕踮鼬伯s苫姒恢 卫田田如仍旧面 t o r f i n 图4 4 亚油酸氧化反应速率常数 圈4 5 亚油酸氧化物( l o o h ) u v - v i s a f e ”( c t b ) 】z + 催化( 6 0 ) b f e 8 ( c t b ) r 催4 9 ( 5 0 c ) 如果控制温度o ，5 个小时后l a 氧化产物中观察到l o o h 在2 3 5 n m 处特 征峰吸收( 如图4 5 ) ，这也有相关报道得到证实 4 4 】综上，温度对l a 氧化造成的 影响，温度升高，l a 氧化速度加快，次级产物中二烯醛，丙二醛等生成量增加，； 温度降低，l a 氧化速度变慢，次级产物中有单烯醛，l o o h 等生成 2 2p h 对拟酶活性的影响 调节溶液p h - = 4 4 2 ，求得准一级反应速率常数k 4 5 5 = o ，0 0 2 1 m i n l ( 图4 6 ) 与 p h = 7 2 5 ( k 4 5 ：0 1 1 6 m i n 1 ) ( 图4 6 ) 相比，k 4 5 5 明显减小，但在5 3 2 n m 附近有吸收峰， 证明酸性条件二烯醛，丙二醛 4 3 1 等生成碱性条件下k 4 5 5 变化如表4 6 图4 6p h = 4 4 2 ，7 2 5l a 氧化反应速率常数 2 3 浓度对拟酶活性的影响 控制反应温度6 0 c ，p h = 7 2 5 f e “( c t b ) c 1 2 2 h 2 0 浓度依次为c o l = 1 o 1 0 一， 2 o 1 0 一，3 0x1 0 m o l l ，分别得到速率常数如表4 5 一至 硕士学位论文 m a s t e k s ，i 蚯s i s 表4 5 【f e l l ( c _ r b ) 】2 + 浓度对k 的影响 ( c l a = 3 7 5 x1 0 m o l l ，c t b a = 2 9 6 x1 0 m o l l ，t = 6 0 * c ，p h = 7 2 5 ) 由表4 5 看出k 随v e ( c t b ) 2 + 浓度增大而减小由于配合物在乙醇中溶解性 较差，为减小实验误差，多数配合物浓度都选定为1 0 x1 0 一m o l l 结论： f e ( c t b ) c 1 2 】2 h 2 0 催化亚油酸( l a ) 氧化从温度，酸碱度( p h 值) ，浓度 三个方面进行研究发现，测定拟酶活性三个参数较为适宜的条件分别为6 0 。c ， p h = 7 弼， c o m p l e x = 1 0 x 1 0 一m o f l 3 含双核，三核，四核铁配合物拟脂氧合酶( l 0 ) 活性的测定 3 i i f e 2 ( i d b ) z ( b z - o ) ( 盱a c - ) 2 l ( c 1 0 4 h 拟l o 活性的测定 f e z ( i d b ) 2 ( 1 a z - - o ) ( 1 z - - a c ) 2 ”催化亚油酸氧化次级产物溶液在可见光区 4 5 5 n m ，4 9 5 n m 处有吸收，不同条件下，准一级速率常数如表4 6 由e s i - m s 分 析发现产物有 f e ：! o d b ) 2 ( i t 2 - o ) ( 肛2 _ - a c 卫( l o o h ) ”( m z = 5 5 4 5 5 6 ) ，以及己醛， 1 3 碳醛( c h o ( c h = c h ) 2 ( c h 2 ) 7 c o o h ) ( m = 2 2 4 ) 分别与t b a 的缩合产物 t b a + 己醐( m z = 2 2 6 ) ，口r b a + 1 3 碳陶( r n z = 1 7 5 ) 存在( 图4 - n 这也证实 f e 2 0 d b h ( 陋旬) ( 2 - a c ) 2 】”催化l a 氧化夺取氢可能主要在c 1 3 位生成自由基产物为1 3 碳醛和 5 碳醛，6 碳醛和1 2 碳醛，如果自由基发生重排，产物还会从c r c l 4 之间断链，生 成其它相对应的小分子醛，酮，酸，酯 图4 7 【f e 2 ( d b ) 2 ( 肛r o ) ( “2 - 哦c | ) 2 】肿催化l a 氧化e s i - m s 3 2 f e 4 ( n t b ) 4 0 , z - o ) 2 ( 眦_ s u c 嘲( c 1 0 4 ) 6 拟l o 活性的测定 模型化合物溶液用d m f 配制溶液，其它条件( 浓度，温度，等) 同 f e ( c t b ) 2 十 催化测试条件相同，不同p h 条件下，准一级速率常数如表4 - 6 由e s i m s 分析氧 化产物有丁醛( m = 7 2 ) ，戊醛( m = 8 6 ) ，己醛( m = t o o ) ，九碳醛( i n = t 7 2 ) ，1 2 碳醛 ( m = 2 1 3 ) ，以及各种醛与硫代巴比妥酸反应产物分子离子峰等( 图4 8 ) ，次级产物 中同时有c 9 ，c 1 3 位断键裂解产物为亚油酸氧化自由基重排机理提供了证据 图4 8 f e 4 ( n t b ) 4 ( 一o ) 2 ( 睁s u c 2 ) “催化l a 氧化e s i - m s 3 3 | f e 3 ( 1 圩d ) ( - p h c o o ) 6 ( h 2 0 ) 2 ( c h s o i d c l 拟l o 活性 反应温度控制在6 0 。c ，选定4 5 5 ，4 9 5 n m ，5 3 2 n m 三个吸收波长进行跟踪，不 3 8 硕士学位论文 扒s t e r lst h e s i s 同p h 条件下的准一级速率常数如表4 6 表4 6 不同酸碱度l a 氧化准一级速率常数( 1 0 。r a i n “) o h = 7 2 5p h - 9 0 4 n u m b e r k 5 5k 9 ， k 5 ，21 ( 4 l 砷5 k s 3 2 c 11 3 0 435 65 02 0 1 2 5 51 62 35 23 51 6 n 23 03 2 2 21 69 3 b i0 3 30 70 i 20 2 60 4 0 2 0 c o n t r o l0 ，4 40 3 8 m o l l ，t = 6 0 2 2 ) 分析发现化合物陬2 b ) 2 ( i i 棚x 肛一剜( c l o 如0 2 ) ， v e 4 ( n t b ) 4 ( m - o ) z ( 阻- s 膏。) ( c l o d 6 删2 ) 也均能够促进亚油酸发生氧化由表4 - 6 发现相同条件下，c 1 催化亚 油酸发生氧化的速度最快，原因可能是f e ( c t b ) c 1 2 能结合氧分子生成 ( c t b ) f e ( 0 2 ) 2 ”，该中间体的活性氧夺取l a 分子c 1l 位上的氢，生成亚油酸自 由基l a 司渤【l 金属化合物【( c 1 1 3 ) f e 皿吲忙_ 4 3 7 q 38 ) ， ( c t b ) f e ( 0 2 x o h ) 2 + ( m z = 3 7 0 ) ，这些离子在e s i - i “l s 中均有相应的分子离子蜂其q 5 ( c t b ) f e ( o z ) ( o r t ) l a + n 生成表明l a 氧化生成有机金属化合物 ( c n 动f e ( l o o h ) ”第二步可能发生了o o 键的均相断裂，生成l o ，己醛，庚醛，戊醛，丙二醛，壬醛，壬烯醛，愈伤酸等 物质( 如图4 2 ) ，实验发现c 1 催化l a 发生氧化过程中不仅生成了自由基，而且 还有有机金属化合物生成对于化合物n 2 ( 两个氧桥，一个羧基桥) 和1 2 ( 一个氧 桥，两个羧基桥) 催化l a 氧化速率也较快，原因可能桥氧原子有较强的亲质子 能力，使之可能夺取l a 分子c l l 位质子，生成亚油酸自由基，然后再插入0 2 分 子生成亚油酸氧化物，也可能催化过程中与中心金属离子配位的烷胺氮键断裂 与亚油酸分子成键生成有机金属配合物在e s i - m s 谱图中，也分别有对应分子离 子峰瓤d b ) 2 m r 0 ) m r 恕疆o o 功r ( m f 5 5 6 ) ( 图4 7 ) ：r i f e 4 ( m 限) 4 ( 一o ) 2 ( 一s u c z ) ( l o o h ) 2 】o 十( m z = 4 3 7 ) ( 如图4 8 ) ，因此推测以上三个化合物催化l a 氧化 可能部同时经历了有机金属配合物和自由基的历程；但是 f 。3 ( 1 3 0 ) ( g z - - p h c o o ) 6 ! ( a 喝。冽+ ( 结榭口图4 。9 a ) 却f 烀不同，其催化反应准级速率常数f l o 3 n 虹1 、 小于田耶珊) 】一田= 2 b ) 2 ( 卿m r a c 麓】t f e 4 ( n t b ) 4 ( o ) 2 ( 2 一s u c 2 。) 1 6 + ， 1 i 蚕五丽万桁( 如图4 - 9 b ) ，三核铁化合物催化亚油酸氧化可能仅通过氧桥， 羟基或者烷氧基夺取质子形成l a 机理进行的，但它催化l a 氧化次级产物的量 非常少，几乎表现抑制脂氧化，原因可能其分子结构与天然脂氧合酶活性部位差别 较大并目配位原予全部为氧导致其氧化还原电事她f - 0 0 4 1 ) 远小于天然脂氧合酶 活性部位矽的氧化电位( s l i ) _ l ，o 6 0 v v s n h e ；0 3 6 v 、，s s c e ) 4 5 1 ；而单核，双